Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81571719 og 81661168014, 81673014 og 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 og 16XD1403100), og National Key R & D plan (2017YFA0104600).

Forsiktig: Protokollen som presenteres nedenfor innebærer bruk av NIR femtosecond laser og giftige kjemikalier. Vennligst vær oppmerksom på alle mulige skader forårsaket av eksperiment prosedyrer. Vennligst les sikkerhetsdatablad av alle relevante kjemikalier eller annet materiale før bruk. Følg sikkerhetsanvisningene til laser fasilitetene eller Rådfør deg med fagfolk før du bruker laser kilde.
1. eksperimentell forberedelse
<ol><li>Sette opp photostimulati...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Vi demonstrerer en photostimulation strategi ved å kombinere en femtosecond laser med et laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop system. Photostimulation kan direkte fungere som en to-Foton mikroskopi ved å definere Stim-B tilsvarende. Vi gir en detaljert protokoll for å utnytte en kort Flash av femtosecond laser for å utløse ERK signalering eller mitoflashes i målceller. De ulike stimulering moduser kan utføres i henhold til ulike eksperimentelle formål og systemer. Stim-A kan enkelt settes opp basert på et ...

Teknologien for å kontrollere cellulære signalering molekyler er en viktig del av utviklingen av Life Science. Tradisjonelt er den mest brukte metoden biokjemiske behandling av narkotika eller biologiske materialer1,2,3. I løpet av det siste tiåret, åpner oppfinnelsen av optogenetics en ny æra for mobilnettet molekylær signal modulering. Transfeksjoner med lysfølsomme proteiner ved genteknologi gjør at lyset blir et kraftig verktøy for å modulere ulike protein aktiviteter i målcellen. Denne teknologien har gjort oppmuntrende skrider som eksitasjon og hemming av nevrale signal, fremme genuttrykk, manipulere cellulære signal mønstre, ledende ulike celle skjebne og patologisk undersøkelse4,5 ,6,7,8,9. Imidlertid kan lys bare fungere ved transfecting celler med optogenetic proteiner. Inne aktuelle scene, der eksisterer sjelden metoder det sette i stand lyset å administrere Cellular molekyler direkte for resten optogenetics.
Femtosecond laser har avansert Biological forskning av skaffer effektiv multiphoton eksitasjon stund bevarer fint Biological sikkerheten. Ved å distribuere ulike foto behandling strategier, har det realisert mange prestasjoner som multiphoton mikroskopi, microsurgeries og multiphoton optogenetic søknader10,11,12,13 ,14,15,16. Nylige undersøkelser viser at femtosecond laser stimulering har blitt demonstrert som en svært effektiv optisk metode for å direkte indusere molekylær signalering hendelser. Det har blitt funnet at tett fokusert femtosecond laser bestråling på endoplasmatiske retikulum (er) er i stand til å tømme kalsium i ER og aktivere kalsium-Release-aktivert kalsium (CRAC) kanaler for å danne kalsium signaler i cellene17. Dette Foto-aktiverte kalsium signalet kan spres mellom flere typer celler18,19,20. Videre har det også evnen til å aktivere celle signalering trasé som kjernefysisk faktor av aktiverte T celler (NFAT) og erk signalering Pathway21,22. Ved å justere intensiteten og lokaliseringen av femtosecond laser eksponering i celler, for eksempel ved å fokusere laseren på mitokondrier, kan det påvirke mitokondrie morfologi og molekylære hendelser23,24, 25. spesielt, serieopptak av MITOKONDRIE ros generasjon kan bli opphisset av photostimulation, som er bemerket som fluorescerende blinker i mitokondrier (mitoflashes).
Derfor er photostimulation teknologi av god potensial til å bli mye brukt i relaterte biologisk forskning. Det er også en god sjanse til å forlenge femtosecond laser applikasjoner i kontroll av mobilnettet signalering molekyler og funksjoner foruten mikroskopi. Her gir vi tekniske detaljer om photostimulation. Photostimulation oppnås ved å kopling en femtosecond laser til et konfokalmikroskopi mikroskop for å gi enkelt mål celle med en kort blits photostimulation. Det kan starte effektiv og kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Hvis photostimulation er plassert på mitokondrie rørformede struktur, mitokondrie membran potensial, morfologi, ROS, og permeabilitet overgangen porene, kan alle styres av photostimulation. Basert på denne photostimulation ordningen, gir vi en detaljert metode for å aktivere ERK signalering sti og påvirke flere mitokondrie hendelser i Hela celler. Denne protokollen kaster prosessen med å levere femtosecond laser stimulering til målceller.
Photostimulation systemet er etablert på et konfokalmikroskopi mikroskop med en femtosecond laser kopling inn i den for samtidig stimulering og kontinuerlig mikroskopi. Den femtosecond laser (bølgelengde: 1 040 NM, Repetisjonshastighet: 50 MHz, pulsbredde: 120 FS, maksimal effekt gjennomsnittlig effekt: 1 W) er delt i to bjelker før kopling. En er guidet gjennom et relé teleskop bestående av et par linser. Det er da direkte reflektert inn i ryggen-blenderåpning av en objektiv (60x, N.A. = 1,2, vann nedsenking) å danne en Diffraksjon-grense fokus (Stim-A). Den andre gjenspeiles i skanne optiske banen til konfokalmikroskopi mikroskop for å fungere som en to-Foton skanning modus (Stim-B). Stim-A presenterer et fast fokuspunkt i midten av synsfeltet (FOV). Stim-B er et forhåndsutformet område for delvis konfokalmikroskopi skanning i FOV. Stim-A og Stim-B er vist i figur 1a. En CCD kameraet under det dichroic speilet (DM) skaffer lys-åker tenkelig for avlytting brennpunktet av femtosecond laser.
Det er noen viktige nødvendigheter for følgende eksperimenter. I denne protokollen, en femtosecond fiber laser kilde (1040 NM, 50 MHz, 120 FS) brukes som et eksempel. I praksis kan de fleste kommersielle femtosecond oscillatorer brukes så lenge pulsen bredden er kortere enn 200 FS og peak strøm tetthet bør være over nivået på 1011 ~ 1012 W/cm2. For eksempel, en ti: Sapphire laser vanligvis brukes for multiphoton mikroskopi er i stand til å erstatte femtosecond laser viste i figur 1B. Laseren makt og noe annet photostimulation parameterene nød å bli innstilt fordi det optisk parameterene (impuls bredde, bølgelengde, og gjentagelse rate) variere en meget inne annerledes femtosecond laser det således indusere annerledes multiphoton eksitasjon effektiviteten.
Sammen med femtosecond laser stimulering, gir konfokalmikroskopi mikroskopi kontinuerlig celle avbildning for å overvåke molekylær dynamikk i sanntid i både Stim-A-og Stim-B-moduser. Begge photostimulation ordningene (Stim-A og Stim-B) styres av en mekanisk lukker med oppløsning på millisekunder (figur 1).
I Stim-A-modus, er plasseringen av laser fokus fast i sentrum av FOV. Et relé teleskop brukes til å sikre at fokuset for femtosecond laser plasseres på konfokalmikroskopi bilde plan ved å justere avstanden mellom to linser i vertikal retning (laser overførings retningen, vertikal til konfokalmikroskopi bilde plan, som vist i Figur 1). Av det lys-åker tenkelig av CCD kameraet, diameteren av laser fokusere kan målt (~ 2 μm, skikkelsen 2b). Stimulering varigheter og eksponeringstider styres av en utløser under konfokalmikroskopi bildebehandlings prosessen.
I Stim-B-modus, kan stimulering området være pre-tilordnet manuelt i konfokalmikroskopi Imaging kontrollerende programvare til enhver form som linje, polygon, eller sirkel. Lukkeren synkroniseres med konfokalmikroskopi skanneprosess. Den åpner for det pre-designet tid hvilke er sette igjennom det konfokalmikroskopi tenkelig kontrollerer programvare. Deretter blir stimulering området skannet av femtosecond laser som konfokalmikroskopi mikroskopi. Dermed er prøven bare stimulert av femtosecond laser når konfokalmikroskopi skanning prosessen går inn i en gitt tenkelig ramme.
Photostimulation systemet kan etableres på både invertert og oppreist metallurgisk mikroskop i henhold til eksperimentet. In vitro celler kultivert i Petri retter er bedre å jobbe med invertert mikroskop. Dyr, spesielt hjernen av levende dyr, er mer egnet med oppreist mikroskop. I denne studien tar vi det omvendte mikroskopet som et eksempel. Det bør bemerkes at dekselet av Petri parabolen ikke er åpnet under hele eksperimenter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Direkte kontroll av cellulære definerte molekylære hendelser er viktig for Life Science. Nylig har studier vist at femtosecond laser stimulering kan samtidig aktivere flere cellulære molekylære signal veier. I denne protokollen viser vi at gjennom koplings femtosecond laser til et konfokalmikroskopi mikroskop, kan cellene bli stimulert nettopp av tett fokusert laser. Noen molekylære prosesser som kan observeres samtidig er senere aktivert. Vi presenterer detaljerte protokoller av photostimulation å aktivere ekstracellulære signal regulert kinase (ERK) signalering sti i Hela celler. Mitokondrie blinker av reaktive oksygen arter (ROS) og andre mitokondrie hendelser kan også stimuleres hvis fokusere femtosecond laser pulsen på en bestemt mitokondrie rørformede struktur. Denne protokollen inkluderer pretreating celler før photostimulation, levere photostimulation av en femtosecond laser blits på målet, og observere/identifisere molekylære endringer etterpå. Denne protokollen representerer et helt optisk verktøy for relaterte biologiske undersøkelser.

Photostimulation kan utføres samtidig sammen med kontinuerlig konfokalmikroskopi skanning mikroskopi. Photostimulation kan starte ved en forhåndsdefinert tidsperiode i tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi sekvens. Den konfokalmikroskopi mikroskopi kan overvåke cellulære molekyler ved fluorescerende bilder. Den molekylære reaksjoner på photostimulation og andre dynamikk kan identifiseres på denne måten. Teoretisk sett, hvis ERK er aktivert, vil det være fosforylert flytte fra...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Tett fokusert femtosecond laser kan levere presis stimulering til celler ved å bli koblet til en konfokalmikroskopi mikroskopi slik at sann tids observasjon og photostimulation. Photostimulation kan aktivere celle molekylære hendelser inkludert ERK signalveien og mitokondrie blinker av reaktive oksygen arter.

Photostimulation av femtosecond laser aktiverer ekstracellulære-signal-regulert kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hendelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Optiske metoder, som optogenetikk kan gi presis modulering av cellulære molekylære signaler. Vår protokoll demonstrerte en muntlig optisk manipulering av cellulære signalmolekyler ved femtosecond laserstimulering. Ved å koble vår femtosecond laser til et konfokal mikroskop, vår teknikk kan gi encellede eller subcellulær-nivå drift ved femtosecond laser stimulering og sanntid, molekylær dynamisk overvåking av konfokal mikroskopi.Denne metoden kan brukes på alle fluorescerende mikroskopisystemer ved å koble en femtosecond laser inn i systemet på riktig måte. For alle som prøver vår metode for første gang, vennligst følg de separate instruksjonene i laseranlegget eller søk veiledning fra fagfolk når du bruker en lab femtosecond laserkilde. For å begynne, slå på femtosecond laser og confocal mikroskop.Bruk reflekterende speil for å lede femtosecond laserstrålen gjennom en mekanisk lukker. Deretter angir du et relételeskop bestående av et par linser for å utvide overføringsstrålebredden. Dette bør være i samsvar med baksiden blenderåpning av målet.Nå styrer du de reflekterende speilene for å justere den utvidede strålen inn i mikroskopet. Juster de to reflekterende speilene, påpekt her, for å justere fokuset på femtosecond laseren til midten av synsfeltet. Til slutt, måle og justere lasere som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen.Kultur Hela celler ved hjelp av standard teknikker. Når du er klar til å utføre eksperimentet, transfiserer du cellene med ERK2-GFP som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Deretter slår du på laserskanningkondikal mikroskopet og femtosecond laser.Kontroller at laserens lukker er lukket. Deretter åpner du mikroskopprogramvaren. Sett eksitasjonslaseren på 488 nanometer, og sett effektnivået på 0,1 milliwatt.Angi bildestørrelsen som 512 og 512 piksler, og intervalltiden for hver piksel som 2,4 mikrosekunder. Deretter angir du intervalltiden mellom to rammer på seks sekunder for å minimere bleking av bilder og bildeskade på cellene. Angi også de totale bildebilderammene på rundt 300 bilder for å gi omtrent 30 minutter kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.Ta parabolen som inneholder Hela-cellene som er transfisert med ERK2-GFP fra inkubatoren, og legg parabolen på mikroskopstadiet. I programvaren, start rask skannemodus, og tune målet om å skaffe klare fluorescerende bilder av cellene. Deretter stopper du rask skanning og bytter til bildebehandlingsmodus med lysfelt ved hjelp av CCD-kameraet.Åpne lukkeren og juster avstanden mellom de to linsene på relételeskopet for å sikre at diameteren på femtosecond laserfokus er omtrent to mikrometer. Lukk deretter lukkeren for å fullføre justeringen. Sett kraften i femtosecond laser på 15 til 40 milliwatt for en 810 nanometer laser, eller en 20 til 60 milliwatt for en 1040 nanometer laser.Deretter angir du lukkeråpningstiden på 05 til 0,2 sekunder. Bruk rask skannemodus til å velge en målcelle som sterkt uttrykker ERK2-GFP. Når det er funnet, flytter du fasen for å lokalisere cytosolområdet i den valgte målcellen, slik at den er i midten av synsfeltet når det er under bildebehandling med lyst felt.Når du er sentrert, klikker du på startknappen for å begynne kontinuerlig bildebehandling. Åpne lukkeren ved en forhåndsdefinert tidsluke for å levere femtosecond laserstimuleringen inn i målcellen. Når bildebehandlingsprosessen er fullført, lagrer du bildedataene for videre analyse.Sett kraften til femtosecond laser på 15 til 40 milliwatt og 810 nanometer og 20 til 60 milliwatt og 1040 nanometer på prøven. Deretter tar du parabolen som inneholder celler som er transfisert med ERK2-GFP fra inkubatoren og legger den på mikroskopstadiet. Bruk rask skannemodus til å velge målcellen som uttrykker ERK2-GFP.Deretter angir du den konfokale bildebehandlingsprosessen og definerer en spesiell skanneramme som stimuleringsrammen i bildebehandlingsprosessen. Definer parameteren for stimuleringsrammen. Angi et skanneområde på to og to til tre kvadratmikromet ved cytosolområdet nær kjernen i målcellen.Still inn den totale skannetiden på 0,1 til 0,2 sekunder. Still inn intervalltiden mellom to rammer etter seks sekunder, og angi de totale bildebilderammene på rundt 300 bilder for å gi omtrent 30 minutter kontinuerlig mikroskopi. Lagre bildedataene for videre dataanalyse.Synkroniser lukkeren av femtosecond laseren med den confocal skanning i henhold til den forhåndsdefinerte fotostimulering området som bare er åpen når laser skanningen faller i stimuleringsrammen. Klikk startknappen for å starte den kontinuerlige mikroskopiavbildningsprosessen. For å observere mitokondriemorfologiske dynamikk, transfect Hela celler med Mito-GFP å fluorescerende indikere mitokondrier, eller en base med mito-cpYFP å observere mitoflashes.Etter transfection, slå på femtosecond laser og sørg for at lukkeren er lukket. Deretter slår du på laserskanning confocal mikroskop. Sett eksitasjonslaseren på 488 nanometer.Deretter setter du effektnivået til 488 nanometerlaseren på 0,1 milliwatt. I tillegg setter du bildestørrelsen til 512 med 512 piksler og den totale bildetiden for hver ramme til 2,2 sekunder. Deretter angir du intervalltiden mellom to rammer på null sekunder og de totale bildebilderammene som 200 bilder for å gi omtrent 440 sekunder kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.Ta parabolen som inneholder celler som er transfisert med mito GFP eller mitokondriemålt sirkulært permutert gult fluorescerende protein fra inkubatoren og sett parabolen på mikroskopstadiet. Kontroller statusen til femtosecond laseren for å sikre at fokuset på femtosecond laseren er plassert i midten av synsfeltet. Deretter angir du en referansepil i midten av det fluorescerende bildevinduet for å angi posisjonen til fokuset.Deretter setter du kraften til femtosecond laser på fem til 30 miliwatts med laseren på 810 nanometer og 10 til 40 milliwatt for laseren på 1040 nanometer. Still inn åpningstiden for lukkeren til 05 til 0,1 sekunder. Bruk rask skannemodus til å velge målcellen som er godt uttrykker mito GFP eller mitokondrie-målrettet sirkulært permutert gul fluorescerende protein.Velg en mitokondrie tilfeldig i målcellen som eksperimentelt emne. Deretter flytter du mikroskopstadiet for å lokalisere mål mitokondrierørformet struktur i midten av synsfeltet ved rask skannemodus som angitt av referansepilen. Klikk på startknappen for å starte kontinuerlig bildebehandling.Til slutt åpner du lukkeren når som helst forhåndsdefinert tid for å levere femtosecond laserstimulering inn i mål mitokondrierørformet struktur. Vent til bildebehandlingsprosessen er fullført, og lagre deretter bildedataene for videre dataanalyse. Ved hjelp av metoden som presenteres i denne protokollen, translocates ERK2 inn i kjernen etter å ha blitt behandlet med en kort blits av femtosecond laseren.ERK2-GFP fluorescens når maksimum etter flere minutter med femtosecond laserstimulering. ERK2-molekylene vil bli defosforylert etter aktivering av nedstrøms underlag i kjernen, og deretter kommer ERK2 tilbake til cytoplasma indikert av en reduksjon av kjernefysisk GFP-fluorescens. ERK2 kan aktiveres flere ganger ved flere fotostimuleringer.Derfor er det mulig å manipulere ERK2-signalmønsteret nøyaktig ved å kontrollere intervalltiden mellom flere stimuli. I tillegg kan ERK2 av og til aktiveres i tilstøtende celler rundt den stimulerte cellen. Denne observasjonen indikerer at noen diffuse molekyler kan frigjøres av cellen behandlet med femtosecond laser for å aktivere ERK2 i de tilstøtende cellene.Fosforylering av ERK2 nedstrøms protein eIF4E kan bekreftes individualisert ved immunofluorescence mikroskopi. Dette resultatet indikerer at femtosecond laserstimulering kan aktivere ERK signalveien. Mitokondrieoksidative blink eller mitoflashes er oksidative utbrudd i mitokondrier som roter fra kompleks molekylær dynamikk.Implementering av denne bildestimuleringsordningen resulterte i en vellykket mitoflash eksitasjon. Denne fotostimuleringen viser også varianter av mitokondriemolekylær dynamikk, inkludert fragmentering og restaurering av mitokondriemorfologi samt oscillasjon av mitokondriemembranpotensial. I likhet med fotoaktiverte mitoflashes, har disse mitokondrihendelsene forskjellig ytelse med forskjellige effektintensiteter.Det viktigste er å sørge for at fokus, størrelse og presisjon av femtosecond laser er en egenskap for stimulering i celler. Den nær-infrarøde femtosecond laseren kan være farlig for brukere. Når du følger denne protokollen, bruk riktig beskyttelse, og det hindrer laseren i å spre seg ut fra det optiske bordet.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestemmelse av Lipid Raft Partisjonering av fluorescently-merkede prober i levende celler ved fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Vurdering av Mitokondrielle funksjoner og celleviabilitet i nyre celler ved overuttrykk Protein C isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging av enkelt Mitokondrielle superoksid Blinker Intakt hjerte eller<em&gt; I Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G protein-koblet reseptor-mediert Chemotaxis og av signalanlegget hendelser i nøytrofilmedierte som HL60 celler

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifikasjon av intracellulære signal Hendelser indusert i levende celler ved Interaksjon med nabocellene gjennomgår celledød ved apoptose

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...