Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
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O trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81571719 e 81661168014, 81673014 e 81870055), o Comitê Municipal de ciência e tecnologia de Xangai (18QA1402300 e 16XD1403100) e a chave nacional R & D Plan (2017YFA0104600).

Atenção: O protocolo apresentado a seguir envolve o uso de laser nir femtossegundo e produtos químicos tóxicos. Pague por favor a atenção a todos os danos possíveis induzidos por procedimentos da experimentação. Por favor, leia as fichas de dados de segurança de todos os produtos químicos relevantes ou outros materiais antes de usar. Por favor, siga as instruções de segurança das instalações de laser ou consultar os profissionais para orientação antes de operar a fonte de laser.
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	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. 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Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Nós demonstramos uma estratégia da fotoestimulação combinando um laser do femtossegundo com um sistema confocal do microscópio da exploração do laser. A fotoestimulação pode funcionar diretamente como uma microscopia do dois-fotão definindo stim-B conformemente. Nós fornecemos um protocolo detalhado para utilizar um flash curto do laser do femtossegundo para provocar a sinalização de ERK ou os mitofcílios em pilhas do alvo. Os diferentes modos de estimulação podem ser realizados de acordo com diferentes f...

A tecnologia de controlar moléculas de sinalização celular é uma parte importante do desenvolvimento da ciência da vida. Tradicionalmente, o método mais comumente utilizado é o tratamento bioquímico por drogas ou materiaisbiológicos 1,2,3. Ao longo da última década, a invenção da optogenética abre uma nova era para a modulação celular de sinais moleculares. O transfection com proteínas sensíveis claras pela engenharia do gene faz a luz transformar-se uma ferramenta poderosa para modular várias atividades da proteína na pilha do alvo. Esta tecnologia tem feito avanços encorajadores, tais como excitação e inibição do sinal neural, promovendo a expressão gênica, manipulando padrões de sinais celulares, conduzindo diferentes destinos celulares e investigação patológica4,5 ,6,7,8,9. No entanto, a luz só pode funcionar através da transfecting células com proteínas optogenéticas. No estágio atual, existem métodos raros que permitem a luz controlar moléculas celulares diretamente além da optogenética.
O laser de Femtosecond tem pesquisas biológicas avançadas fornecendo a excitação eficiente do multifotônica ao manter a boa segurança biológica. Através da implantação de diversas estratégias de processamento de fotos, realizou inúmeras realizações como microscopia multifóton, microcirurgias e aplicações optogenéticas multifótons10,11,12, 12,13 ,14,15,16. As investigações recentes mostram que a estimulação do laser do femtossegundo foi demonstrada como um método ótico altamente eficiente para induzir diretamente eventos de sinalização moleculars. Verificou-se que a irradiação de laser femtossegundo fortemente focada no retículo endoplasmático (er) é capaz de esgotar o cálcio em ER e ativar os canais de cálcio ativado por liberação de cálcio (crac) para formar sinais de cálcio nas células17. Este sinal de cálcio foto-ativado pode se espalhar entre vários tipos de células18,19,20. Além disso, também tem a capacidade de ativar as vias de sinalização celular, como o fator nuclear de células T ativadas (NFAT) e a via de sinalização Erk21,22. Ajustando a intensidade e a localização da exposição do laser de femtossegundo nas pilhas, por exemplo, focalizando o laser em mitocôndria, pode influenciar a morfologia mitochondrial e os eventos moleculars23,24, 25. especificamente, rajadas de geração de Ros mitocondrial podem ser excitadas pela fotoestimulação, que é remarcada como flashes fluorescentes na mitocôndria (mitofcílios).
Assim, a tecnologia de fotoestimulação é de bom potencial para ser amplamente aplicada na pesquisa biológica relacionada. É igualmente uma boa possibilidade estender aplicações do laser do femtossegundo no controlo de moléculas e de funções de sinalização celulares além da microscopia. Aqui, nós fornecemos os detalhes técnicos da fotoestimulação. A fotoestimulação é conseguida acoplando um laser do femtossegundo a um microscópio confocal para fornecer a única pilha do alvo com um photoestimulação instantâneo curto. Pode iniciar a ativação de ERK eficiente e controlável na célula. Se a fotoestimulação está localizada na estrutura tubular mitocondrial, o potencial de membrana mitocondrial, morfologia, ROS e poros de transição de permeabilidade, todos podem ser controlados pela fotoestimulação. Baseado neste esquema da fotoestimulação, nós fornecemos um método detalhado de ativar a via de sinalização de ERK e de influenciar eventos mitochondrial múltiplos em pilhas de Hela. Este protocolo esclarece o processo de entregar a estimulação do laser do femtossegundo em pilhas do alvo.
O sistema da fotoestimulação é estabelecido em um microscópio confocal com um acoplamento do laser do femtossegundo nele para a estimulação simultânea e a microscopia contínua. O laser femtossegundo (comprimento de onda: 1.040 nm, taxa de repetição: 50 MHz, largura de pulso: 120 FS, potência média máxima de saída: 1 W) é dividido em duas vigas antes do acoplamento. Um é guiado através de um telescópio do relé que consiste em um par de lentes. É então diretamente refletida na abertura traseira de um objetivo (60x, N.A. = 1,2, imersão em água) para formar um foco de difração-limite (stim-A). O outro é refletido ao trajeto ótico da exploração do microscópio confocal para trabalhar como um modo da exploração do dois-fotão (stim-B). O stim-A apresenta um ponto de foco fixo no centro do campo de visão (FOV). Stim-B é uma área de exploração confocal parcial pre-projetada no FOV. Stim-A e stim-B são mostrados na Figura 1a. Uma câmera do CCD o espelho dichroic (DM) fornece a imagem latente do brilhante-campo para monitorar o foco do laser do femtossegundo.
Há alguns fundamentos cruciais para os seguintes experimentos. Neste protocolo, uma fonte do laser da fibra do femtossegundo (1040 nanômetro, 50 megahertz, 120 FS) é usada como um exemplo. Na prática, a maioria de osciladores femtossegundo comerciais podem ser usados contanto que a largura de pulso for mais curta do que 200 FS e a densidade de poder máxima deve estar acima do nível de 1011 ~ 1012 W/cm2. Por exemplo, um laser de ti: Sapphire geralmente usado para microscopia multifóton é capaz de substituir o laser femtossegundo mostrado na Figura 1b. O poder do laser e alguns outros parâmetros da fotoestimulação precisam de ser ajustados porque os parâmetros óticos (largura de pulso, comprimento de onda, e taxa da repetição) variam muito em lasers diferentes do femtossegundo que induzem assim eficiências diferentes da excitação do multifotônica.
Junto com a estimulação do laser do femtossegundo, a microscopia confocal fornece a imagem latente contínua da pilha para monitorar a dinâmica molecular no tempo real em ambos os modos de stim-A e de stim-B. Ambos os esquemas de fotoestimulação (stim-A e stim-B) são controlados por um obturador mecânico com resolução de milissegundo (Figura 1).
No modo stim-a, a posição do foco do laser é fixada no centro de FOV. Um telescópio do relé é usado para assegurar o foco do laser do femtossegundo a ser localizado no plano Confocal da imagem latente ajustando a distância entre duas lentes no sentido vertical (o sentido da propagação do laser, vertical ao plano Confocal da imagem latente, como mostrado em Figura 1). Pela imagem latente do brilhante-campo da câmera do CCD, o diâmetro do foco do laser pode ser medido (~ 2 μm, Figura 2b). As durações de estimulação e os tempos de exposição são controlados por um obturador durante o processo de imagem confocal.
Na modalidade de stim-B, a área da estimulação pode pre-ser atribuída manualmente no software de controlo da imagem latente confocal a todo o formulário como a linha, o polígono, ou o círculo. O obturador é sincronizado com o processo de digitalização confocal. Abre no tempo pre-designed que é ajustado com o software de controlo da imagem latente confocal. Em seguida, a área de estimulação é digitalizada pelo laser femtossegundo como microscopia confocal. Assim, a amostra só é estimulada pelo laser femtossegundo quando o processo de digitalização confocal entra em um determinado quadro de imagem.
O sistema da fotoestimulação pode ser estabelecido em Microscópios Metalúrgicos invertidos e eretos de acordo com os assuntos do experimento. As células in vitro cultivadas em placas de Petri são melhores para trabalhar com microscópios invertidos. Animais, especialmente cérebros de animais vivos, são mais adequados com microscópios verticais. Neste estudo, tomamos o microscópio invertido como exemplo. Deve-se notar que a tampa do prato de Petri não é aberta durante todo o experimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

O controle direto de eventos moleculares definidos celulares é importante para a ciência da vida. Recentemente, os estudos demonstraram que a estimulação do laser do femtossegundo pode simultaneamente ativar várias vias moleculares celulares da sinalização. Neste protocolo, nós mostramos que através do acoplamento do laser do femtossegundo em um microscópio confocal, as pilhas podem ser estimuladas precisamente pelo laser firmemente-focalizado. Alguns processos moleculares que podem ser observados simultaneamente são subsequentemente ativados. Nós apresentamos protocolos detalhados da fotoestimulação para ativar a via de sinalização regulada do sinal extracelular da quinase (Erk) em pilhas de Hela. Os flashes mitochondrial de espécies reactivas do oxigênio (ROS) e outros eventos mitochondrial podem igualmente ser estimulados se focalizando o pulso do laser do femtossegundo em uma determinada estrutura tubular mitochondrial. Este protocolo inclui o pré-tratamento de células antes da fotoestimulação, entregando a fotoestimulação por um flash laser femtossegundo no alvo, e observando/identificando alterações moleculares depois. Este protocolo representa uma ferramenta toda ótica para pesquisas biológicas relacionadas.

A fotoestimulação pode ser realizada simultaneamente juntamente com a microscopia de varredura confocal contínua. A fotoestimulação pode começar em qualquer slot de tempo pré-definido na sequência de microscopia confocal de lapso temporal. A microscopia confocal pode monitorar moléculas celulares pela imagem latente fluorescente. As respostas moleculares à fotoestimulação e outras dinâmicas podem ser identificadas desta forma. Teoricamente, se ERK for ativado, será o movimen...

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Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

O laser de femtossegundo firmemente-focalizado pode entregar a estimulação precisa às pilhas acoplando em uma microscopia confocal permitindo a observação e a fotoestimulação tempo real. A fotoestimulação pode ativar eventos moleculares celulares, incluindo via de sinalização ERK e flashes mitocondriais de espécies reativas de oxigênio.

Fotoestimulação por Femtosecond laser ativa extracellular-sinal-regulado quinase (ERK) sinalização ou eventos mitocondrial em células-alvo

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Métodos ópticos, como a optogenética, podem fornecer a modulação precisa de sinais moleculares celulares. Nosso protocolo demonstrou uma manipulação óptica oral de sinais moleculares de sinal celular por estimulação a laser femtosegundo. Ao acoplar nosso laser femtosegundo em um microscópio confocal, nossa técnica pode fornecer operação de nível único ou subcelular por estimulação a laser femtosegundo e o monitoramento dinâmico molecular em tempo real por microscopia confocal.Este método pode ser aplicado a qualquer sistema de microscopia fluorescente acoplado um laser femtosegundo no sistema da maneira adequada. Para quem está testinge nosso método pela primeira vez, siga as instruções separadas da instalação de laser ou busque orientação dos profissionais ao operar uma fonte de laser femtosegundo de laboratório. Para começar, ligue o laser femtosegundo e o microscópio confocal.Use espelhos reflexivos para direcionar o feixe laser femtosegundo através de um obturador mecânico. Em seguida, defina um telescópio de relé composto por um par de lentes para expandir a largura do feixe de transmissão. Isso deve ser consistente com a abertura traseira do objetivo.Agora, direva os espelhos reflexivos para alinhar o feixe expandido ao microscópio. Ajuste os dois espelhos reflexivos, apontados aqui, para ajustar o foco do laser femtosegundo ao centro do campo de visão. Finalmente, meça e sintonize os lasers conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.Cultura Hela células usando técnicas padrão. Quando estiver pronto para realizar o experimento, transfete as células com ERK2-GFP conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, ligue o microscópio confocal de varredura a laser e o laser femtosegundo.Certifique-se de que o obturador do laser está fechado. Então, abra o software do microscópio. Defina o laser de excitação em 488 nanômetros, e coloque seu nível de potência em 0,1 miliwatts.Defina o tamanho da imagem como 512 por 512 pixels, e o tempo de intervalo de cada pixel como 2,4 microssegundos. Em seguida, defina o tempo de intervalo entre dois quadros em seis segundos para minimizar o branqueamento da foto e danos fotográficos às células. Além disso, defina os quadros totais de imagem em cerca de 300 quadros para fornecer cerca de 30 minutos de microscopia contínua em um experimento individual.Pegue o prato contendo as células Hela transfeinadas com ERK2-GFP da incubadora, e coloque o prato no estágio do microscópio. No software, inicie o modo de digitalização rápida e sintonize o objetivo de adquirir imagens fluorescentes claras das células. Em seguida, pare de digitalizar rapidamente e mude para o modo de imagem de campo brilhante usando a câmera CCD.Abra o obturador e ajuste a distância entre as duas lentes do telescópio de relé para garantir que o diâmetro do foco do laser femtosegundo seja de cerca de dois mícrons. Em seguida, feche o obturador para completar o ajuste. Defina a potência do laser femtosegundo em 15 a 40 miliwatts para um laser de 810 nanômetros, ou um laser de 20 a 60 milímetros para um laser de 1040 nanômetros.Em seguida, defina o tempo de abertura do obturador em 05 a 0,2 segundos. Use o modo de varredura rápida para selecionar uma célula alvo que esteja expressando fortemente o ERK2-GFP. Uma vez encontrado, mova o estágio para localizar a área de citosol da célula alvo selecionada para que ela esteja no centro do campo de visão quando sob imagens de campo brilhante.Uma vez centrado, clique no botão iniciar para iniciar a imagem contínua. Abra o obturador em qualquer slot de tempo predefinido para fornecer a estimulação a laser femtosegundo na célula alvo. Quando o processo de imagem estiver concluído, salve os dados de imagem para análise suplementar.Defina a potência do laser femtosegundo em 15 a 40 miliwatts e 810 nanômetros e 20 a 60 miliwatts e 1040 nanômetros no espécime. Em seguida, pegue o prato contendo células transfeinadas com ERK2-GFP da incubadora e coloque-o no estágio do microscópio. Use o modo de varredura rápida para selecionar a célula alvo bem expressando ERK2-GFP.Em seguida, defina o processo de imagem confocal e defina um quadro especial de varredura como o quadro de estimulação no processo de imagem. Defina o parâmetro da estrutura de estimulação. Defina uma região de varredura de dois por dois a três por três mícrons quadrados na área de citosol perto do núcleo na célula alvo.Defina o tempo total de varredura em 0,1 a 0,2 segundos. Defina o intervalo entre dois quadros em seis segundos e defina os quadros totais de imagem em cerca de 300 quadros para fornecer cerca de 30 minutos de microscopia contínua. Salve os dados de imagem para análise de dados posteriores.Sincronizar o obturador do laser femtosegundo com o da varredura confocal de acordo com a área de estimulação fotográfica predefinida que só é aberta quando o escaneamento a laser cai na estrutura de estimulação. Clique no botão iniciar para iniciar o processo contínuo de imagem de microscopia. Para observar a dinâmica morfológica mitocondrial, as células Hela transfectas com Mito-GFP indicam fluorescentemente as mitocôndrias, ou uma base com mito-cpYFP para observar mitoflashes.Após a transfecção, ligue o laser femtosegundo e certifique-se de que o obturador esteja fechado. Em seguida, ligue o microscópio confocal de varredura a laser. Coloque o laser de excitação em 488 nanômetros.Em seguida, defina o nível de potência do laser de 488 nanômetros em 0,1 miliwatt. Além disso, defina o tamanho da imagem para 512 por 512 pixels e o tempo total de imagem de cada quadro para 2,2 segundos. Em seguida, defina o tempo de intervalo entre dois quadros em zero segundos e os quadros totais de imagem como 200 quadros para fornecer cerca de 440 segundos de microscopia contínua em um experimento individual.Pegue o prato contendo células transfectadas com mito GFP ou proteína fluorescente amarela circularmente permutada da incubadora e coloque o prato no estágio do microscópio. Verifique o estado do laser femtosegundo para garantir que o foco do laser femtosegundo esteja localizado no centro do campo de visão. Em seguida, ajuste uma seta de referência no centro da janela de imagem fluorescente para indicar a posição do foco.Em seguida, defina a potência do laser femtosegundo em cinco a 30 miliwatts com o laser a 810 nanômetros e de 10 a 40 miliwatts para o laser a 1040 nanômetros. Defina o tempo de abertura do obturador para 05 a 0,1 segundos. Use o modo de varredura rápida para selecionar a célula alvo que está bem expressando mito GFP ou a proteína fluorescente amarela circularmente permutada com mira mitocondrial.Selecione uma mitocôndria aleatoriamente na célula alvo como o sujeito experimental. Em seguida, mova o estágio do microscópio para localizar a estrutura tubular mitocondrial alvo no centro do campo de visão, através do modo de varredura rápida, conforme indicado pela seta de referência. Clique no botão iniciar para iniciar a imagem contínua.Finalmente, abra o obturador a qualquer momento predefinido para fornecer a estimulação a laser femtosegundo na estrutura tubular mitocondrial alvo. Aguarde até que o processo de imagem seja concluído e, em seguida, salve os dados de imagem para análise de dados posteriores. Utilizando o método apresentado neste protocolo, O ERK2 transloca-se para o núcleo após ser tratado com um pequeno flash do laser femtosegundo.A fluorescência ERK2-GFP atinge o máximo após vários minutos de estimulação a laser femtosegundo. As moléculas ERK2 serão desfosforiladas após ativarem substratos a jusante no núcleo e, em seguida, o ERK2 volta ao citoplasma indicado por uma diminuição da fluorescência GFP nuclear. O ERK2 pode ser ativado várias vezes por várias estimulações fotográficas.Portanto, é possível manipular o padrão de sinal ERK2 precisamente controlando o tempo de intervalo entre múltiplos estímulos. Além disso, o ERK2 pode ocasionalmente ser ativado em células adjacentes ao redor da célula estimulada. Esta observação indica que algumas moléculas difusíveis podem ser liberadas pela célula tratada com o laser femtosegundo para ativar ORK2 nas células adjacentes.A fosforilação da proteína a jusante ERK2 eIF4E pode ser confirmada individualizada por microscopia de imunofluorescência. Este resultado indica que a estimulação a laser femtosegundo pode ativar com sucesso a via de sinalização ERK. Flashes oxidativos mitocondriais ou mitoflashes são explosões oxidativas em mitocôndrias que raiz de dinâmica molecular complexa.A implementação deste esquema de estimulação de fotos resultou em uma excitação mitoflash bem sucedida. Esta estimulação fotográfica também mostra variedades de dinâmicas moleculares mitocondriais, incluindo fragmentação e restauração da morfologia mitocondrial, bem como oscilação do potencial da membrana mitocondrial. Semelhante às mitoflashes ativadas por fotos, esses eventos mitocôndrias têm desempenho diferente com diferentes intensidades de poder.O mais importante é garantir que o foco, o tamanho e a precisão do laser femtosegundo é uma propriedade para a estimulação nas células. O laser femtosegundo quase infravermelho pode ser perigoso para os usuários. Ao seguir este protocolo, use proteção adequada e impede que o laser se difunda da tabela óptica.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

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Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biologia

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

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Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

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F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

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Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

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Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

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