Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81571719 и 81661168014, 81673014 и 81870055), Шанхайским муниципальным комитетом по науке и технике (18-A1402300 и 16XD1403100), а также Национальным ключевым планом r'amp;D (20170).

ПРЕДЕКТО: Протокол, представленный ниже, включает в себя использование NIR фемтосекундных лазеров и токсичных химических веществ. Пожалуйста, обратите внимание на все возможные повреждения, вызванные экспериментальными процедурами. Пожалуйста, ознакомьтесь с листами данных о...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Мы демонстрируем стратегию фотостимуляции, сочетая фемтосекундный лазер с системой лазерного сканирования конфокального микроскопа. Фотостимуляция может работать непосредственно как двухфотоническая микроскопия, определяя Stim-B соответствующим образом. Мы предоставляем подробный ?...

Технология управления клеточными сигнальными молекулами является важной частью развития науки о жизни. Традиционно наиболее часто используемым методом является биохимическая обработка препаратами или биологическими материалами1,2,3. За последнее десятилетие изобретение оптогенетики открывает новую эру для модуляции клеточных молекулярных сигналов. Трансфекция с светочувствительными белками с помощью генной инженерии делает свет мощным инструментом для модулирования различных белков ы в клетках-мишенях. Эта технология сделала обнадеживающие прогрессии, такие как возбуждение и ингибирование нервного сигнала, содействие экспрессии генов, манипулирование клеточными сигнальными моделями, ведущие различные судьбы клеток и патологическое исследование4,5 ,6,7,8,9. Однако свет может работать только трансфектирующие клетки с оптогенетическими белками. На современном этапе существуют редкие методы, которые позволяют свету контролировать клеточные молекулы непосредственно помимо оптогенетики.
Фемтосекундный лазер имеет передовые биологические исследования, обеспечивая эффективное многофотонее возбуждение при сохранении хорошей биологической безопасности. Развертывая различные стратегии обработки фотографий, он реализовал множество достижений, таких как мультифотонная микроскопия, микрохирургии и мультифотонные оптогенетические приложения10,11,12,13 ,14,15,16. Недавние исследования показывают, что фемтосекундная лазерная стимуляция была продемонстрирована как высокоэффективный оптический метод, чтобы непосредственно вызвать молекулярные сигнальные события. Было установлено, что плотно ориентированных фемтосекундного лазерного облучения на эндоплазмический ретикулум (ER) способен истощать кальций в ER и активировать кальций-релиз активированного кальция (CRAC) каналы для формирования сигналов кальция в клетках17. Этот фото-активированный сигнал кальция может распространяться между несколькими типами клеток18,19,20. Кроме того, он также имеет возможность активировать клеточные сигнальные пути, такие как ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT) и ERK сигнальный путь21,22. Регулируя интенсивность и локализацию фемтосекундного воздействия лазера в клетках, например, фокусируя лазер на митохондриях, он может влиять на митохондриальную морфологию и молекулярные события23,24, 25. В частности, всплески поколения митохондриальных ROS могут быть возбуждены фотостимуляции, которая отмечается как флуоресцентные вспышки в митохондриях (митофлэшс).
Таким образом, технология фотостимуляции имеет хороший потенциал для широкого применения в соответствующих биологических исследованиях. Это также хороший шанс расширить фемтосекундные лазерные приложения в управлении клеточных сигнальных молекул и функций, кроме микроскопии. Здесь мы предоставляем технические детали фотостимуляции. Фотостимуляция достигается путем соединения фемтосекундного лазера с конфоковым микроскопом, чтобы обеспечить одну целевую ячейку с короткой флэш-фотостимуляцией. Он может инициировать эффективную и управляемую активацию ERK в ячейке. Если фотостимуляция расположена на митохондриальной трубчатой структуре, то митохондриальный мембранный потенциал, морфология, ROS и поры перехода проницаемости могут контролироваться фотостимуляцией. Основываясь на этой схеме фотостимуляции, мы предоставляем подробный метод активации ERK сигнального пути и влияния на несколько митохондриальных событий в клетках Hela. Этот протокол разъясняет процесс доставки фемтосекундной лазерной стимуляции в клетки-мишени.
Система фотостимуляции установлена на конфокальном микроскопе с фемтосекундным лазерным соединением в него для одновременной стимуляции и непрерывной микроскопии. Фемтосекундный лазер (длина волны: 1040 нм, частота повторения: 50 МГц, ширина пульса: 120 fs, максимальная мощность выхода: 1 Вт) делится на два луча перед соединением. Один из них проходит через реле телескоп, состоящий из пары линз. Затем он непосредственно отражается в задней апертуре цели (60x, N.A. 1.2, погружение в воду) для формирования фокуса с ограничением дифракции (Stim-A). Другой отражается на сканирующем оптическом пути конфокального микроскопа для работы в режиме двухфотонных сканирований (Stim-B). Stim-A представляет собой фиксированную точку фокусировки в центре поля зрения (FOV). Stim-B — это заранее разработанная область частичного конфокального сканирования в FOV. Stim-A и Stim-B показаны на рисунке 1A. Камера CCD под дихроарным зеркалом (DM) обеспечивает ярко-полевую визуализацию для мониторинга фокуса фемтосекундного лазера.
Есть некоторые важные предметы первой необходимости для следующих экспериментов. В этом протоколе используется фемтосекундный источник лазерного волокна (1040 нм, 50 МГц, 120 fs). На практике, большинство коммерческих фемтосекундных осцилляторов могут быть использованы до тех пор, как ширина импульса короче, чем 200 fs и пиковая плотность мощности должна быть выше уровня 1011 и 1012 Вт / см2. Например, Ti: Сапфировый лазер обычно используется для мультифотон микроскопии способен заменить фемтосекундный лазер, показанный на рисунке 1B. Лазерная мощность и некоторые другие параметры фотостимуляции должны быть настроены, потому что оптические параметры (ширина импульса, длина волны и скорость повторения) сильно различаются в различных фемтосекундных лазеров, которые, таким образом, вызывают различные мультифотоновые эффективность возбуждения.
Наряду с фемтосекундной лазерной стимуляцией, конфокальная микроскопия обеспечивает непрерывную клеточную визуализацию для мониторинга молекулярной динамики в режиме реального времени как в режимах Stim-A, так и Stim-B. Обе схемы фотостимуляции (Stim-A и Stim-B) управляются механическим затвором с миллисекундным разрешением(рисунок1).
В режиме Stim-A положение лазерного фокуса фиксируется в центре FOV. Реле телескоп используется для обеспечения фокус фемтосекундного лазера, который будет расположен на плоскости конфокальной визуализации путем настройки расстояния между двумя линзами в вертикальном направлении (направление лазерной распространения, вертикальнокая к конфокальная плоскость изображения, как показано в Рисунок 1). С помощью ярко-поляной визуализации камеры CCD можно измерить диаметр лазерного фокуса (2 мкм, рисунок 2B). Длительность стимуляции и время экспозиции контролируются затвором во время процесса конфокальной визуализации.
В режиме Stim-B область стимуляции может быть предварительно назначена вручную в программном обеспечении для управления изображениями в любой форме, как линия, полигон или круг. Затвор синхронизируется с процессом конфокального сканирования. Он открывается в заранее разработанное время, которое устанавливается через конфокальные изображения управления программным обеспечением. Затем область стимуляции сканируется фемтосекундным лазером в виде конфокальной микроскопии. Таким образом, образец стимулируется только фемтосекундным лазером, когда процесс конфокального сканирования входит в заданную раму изображения.
Система фотостимуляции может быть установлена как на перевернутых, так и на вертикальном металлургическом микроскопе в соответствии с объектами эксперимента. Клетки in vitro, культивированные в чашках Петри, лучше работать с перевернутыми микроскопами. С вертикальноговорями микроскопами больше подходят животные, особенно мозги живых животных. В этом исследовании мы берем в качестве примера перевернутый микроскоп. Следует отметить, что обложка блюда Петри не открывается в течение всего эксперимента.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Прямой контроль клеточных молекулярных событий важен для науки о жизни. Недавно исследования показали, что фемтосекундная лазерная стимуляция может одновременно активировать несколько клеточных молекулярных сигнальных путей. В этом протоколе мы показываем, что через соединение фемтосекундного лазера в конфокальный микроскоп, клетки могут быть стимулированы именно плотно сфокусированным лазером. Некоторые молекулярные процессы, которые могут одновременно наблюдаться, впоследствии активируются. Мы представляем подробные протоколы фотостимуляции для активации внеклеточного сигнала, регулируемого киназы (ERK) сигнального пути в клетках Hela. Митохондриальные вспышки реактивных видов кислорода (ROS) и другие митохондриальные явления также могут быть стимулированы при фокусировании фемтосекундного лазерного импульса на определенной митохондриальной трубчатой структуре. Этот протокол включает в себя предварительное лечение клеток перед фотостимуляцией, доставку фотостимуляции фемтосекундной лазерной вспышкой на цель и наблюдение/идентификацию молекулярных изменений впоследствии. Этот протокол представляет собой все-оптический инструмент для соответствующих биологических исследований.

Фотостимуляция может быть выполнена одновременно вместе с непрерывной конфокальной микроскопией сканирования. Фотостимуляция может начинаться в любой заранее определенный временной интервал в последовательности конфокальной микроскопии. Конфокальная микроскопи...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Плотно ориентированный фемтосекундный лазер может обеспечить точную стимуляцию клеток, будучи в сочетании с конфокальной микроскопией, позволяющей в режиме реального времени наблюдения и фотостимуляции. Фотостимуляция может активировать молекулярные события клеток, включая сигнальный путь ERK и митохондриальные вспышки реактивных видов кислорода.

Фотостимуляция Femtosecond Laser активирует внеклеточные сигналы, регулируемые Kinase (ERK) Сигнализация или Митохондриальные События в целевых клетках

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Оптические методы, такие как оптогенетика, могут обеспечить точную модуляцию клеточных молекулярных сигналов. Наш протокол продемонстрировал устные оптические манипуляции молекулами клеточного сигнала с помощью фемтосекундной лазерной стимуляции. Советив наш фемтосекундный лазер в конфокальный микроскоп, наша техника может обеспечить одноклеточную или субклеточную операцию с помощью фемтосекундной лазерной стимуляции и молекулярно-динамического мониторинга в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии.Этот метод может быть применен к любым флуоресцентным системам микроскопии путем соединения фемтосекундного лазера в систему надлежащим образом. Для тех, кто пытается наш метод в первый раз, пожалуйста, следуйте отдельным инструкциям лазерного объекта или обратиться за руководством к профессионалам при эксплуатации лаборатории фемтосекундный лазерный источник. Для начала включите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп.Используйте светоотражающие зеркала, чтобы направить фемтосекундный лазерный луч через механический затвор. Затем установите реле телескоп, состоящий из пары линз для расширения ширины луча передачи. Это должно соответствовать задней диафрагме цели.Теперь, направить отражающие зеркала, чтобы выровнять расширенный луч в микроскоп. Отрегулируйте два отражающих зеркала, указанные здесь, чтобы настроить фокус фемтосекундного лазера к центру поля зрения. Наконец, измерьте и настройте лазеры, описанные в сопроводительном текстовом протоколе.Культурные клетки Hela с использованием стандартных методов. Когда вы будете готовы к проведению эксперимента, трансфект клеток с ERK2-GFP, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и фемтосекундный лазер.Убедитесь, что затвор лазера закрыт. Затем откройте программное обеспечение микроскопа. Установите лазер возбуждения на 488 нанометров и установите его уровень мощности на уровне 0,1 милливатт.Установите размер изображения как 512 на 512 пикселей, а время интервала каждого пикселя как 2,4 микросекунды. Затем установите интервал между двумя кадрами за шесть секунд, чтобы свести к минимуму отбеливание фотографий и повреждение фото для ячеек. Кроме того, установите общий объем кадров изображения на уровне около 300 кадров, чтобы обеспечить около 30 минут непрерывной микроскопии в индивидуальном эксперименте.Возьмите блюдо, содержащее клетки Hela, трансфицированные ERK2-GFP из инкубатора, и положите блюдо на сцену микроскопа. В программном обеспечении, начать быстрый режим сканирования, и настроить цель приобрести четкие флуоресцентные изображения клеток. Затем прекратите быстрое сканирование и переключитесь в режим ярко-полевых изображений с помощью камеры CCD.Откройте затвор и отрегулируйте расстояние между двумя линзами реле телескопа, чтобы гарантировать, что диаметр фемтосекундного лазерного фокуса составляет около двух микрон. Затем закройте затвор, чтобы завершить регулировку. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне от 15 до 40 милливатт для лазера 810 нанометров, или от 20 до 60 милливатт для 1040 нанометрового лазера.Затем установите время открытия затвора на 05-0,2 секунды. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, которая сильно выражает ERK2-GFP. После того, как найдено, переместить этап для того, чтобы локализовать цитозол области выбранной целевой ячейки, так что он находится в центре поля зрения, когда под ярким полем изображения.После того, как по центру, нажмите на кнопку запуска, чтобы начать непрерывную визуализацию. Откройте затвор в любой предопределенный временной интервал, чтобы доставить фемтосекундную лазерную стимуляцию в целевую ячейку. По завершения процесса визуализации сохраните данные изображений для дальнейшего анализа.Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне от 15 до 40 милливатт и 810 нанометров и от 20 до 60 милливатт и 1040 нанометров в образце. Затем возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицированные ERK2-GFP из инкубатора, и поместите его на сцену микроскопа. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, хорошо выражаю электронную ERK2-GFP.Затем установите процесс конфокальной визуализации и определите специальную рамку сканирования в качестве каркаса стимуляции в процессе визуализации. Определите параметр каркаса стимуляции. Установите область сканирования от двух на два-три на три квадратных микрона в области цитозола близко к ядру в целевой клетке.Установите общее время сканирования на 0,1-0,2 секунды. Установите интервал между двумя кадрами на шесть секунд и установите общий объем изображений на уровне около 300 кадров, чтобы обеспечить около 30 минут непрерывной микроскопии. Сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных.Синхронизировать затвор фемтосекундного лазера с конфокального сканирования в соответствии с предопределенной области стимуляции фото, которая открыта только тогда, когда лазерное сканирование падает в рамке стимуляции. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать процесс непрерывной микроскопии. Для наблюдения за митохондриальной морфологической динамикой, трансфектные клетки Гела с Мито-GFP флуоресцентно указывают митохондрии, или базы с мито-cpYFP для наблюдения митофлашей.После трансфекции включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт. Затем включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Установите лазер возбуждения на 488 нанометров.Затем установите уровень мощности 488 нанометрового лазера на уровне 0,1 милливатта. Кроме того, установите размер изображения до 512 на 512 пикселей, а общее время изображения каждого кадра до 2,2 секунды. Затем установите интервал между двумя кадрами на ноль секунд и общий объем кадров изображения, как 200 кадров, чтобы обеспечить около 440 секунд непрерывной микроскопии в индивидуальном эксперименте.Возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицированные митоХондриальной GFP или митохондриальной мишенью круговой желтый флуоресцентный белок из инкубатора и положить блюдо на стадии микроскопа. Проверьте состояние фемтосекундного лазера, чтобы убедиться, что фокус фемтосекундного лазера находится в центре поля зрения. Затем установите эталонную стрелку в центре флуоресцентного окна изображения, чтобы указать положение фокуса.Затем установите мощность фемтосекундного лазера на уровне от 5 до 30 милливатт с лазером на 810 нанометров и от 10 до 40 милливатт для лазера на 1040 нанометров. Установите время открытия затвора на 05-0,1 секунды. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую клетку, которая хорошо выражает мито GFP или митохондриальной целевой круговой желтый флуоресцентный белок.Выберите один митохондрион случайным образом в целевой клетке в качестве экспериментального субъекта. Затем переместите стадию микроскопа, чтобы локализовать митохондриальную трубчатую структуру цели в центре поля зрения в режиме быстрого сканирования, о чем свидетельствует эталонная стрелка. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать непрерывную визуализацию.Наконец, откройте затвор в любое заранее выясняемое время, чтобы доставить фемтосекундную лазерную стимуляцию в целевую митохондриальную трубчатую структуру. Подождите, пока процесс визуализации будет завершен, а затем сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных. Используя метод, представленный в этом протоколе, ERK2 транслокирует в ядро после лечения короткой вспышкой фемтосекундного лазера.ERK2-GFP флуоресценция достигает максимума после нескольких минут фемтосекундной лазерной стимуляции. Молекулы ERK2 будут дефосфорилированы после активации субстратов вниз по течению в ядре, а затем ERK2 возвращается к цитоплазме, указанной уменьшением флуоресценции ядерного GFP. ERK2 может быть активирован несколько раз с помощью нескольких фотостимуляции.Таким образом, можно манипулировать шаблоном сигнала ERK2 именно путем контроля времени интервала между несколькими стимулами. Кроме того, ERK2 иногда может быть активирован в соседних клетках вокруг стимулировали клетки. Это наблюдение показывает, что некоторые диффузные молекулы могут быть освобождены клеткой, обработанной фемтосекундным лазером для активации ERK2 в соседних клетках.Фосфорилирование белка ERK2 вниз по течению eIF4E может быть подтверждено индивидуализированной микроскопией иммунофторесценции. Этот результат указывает на то, что фемтосекундная лазерная стимуляция может успешно активировать сигнальный путь ERK. Митохондриальные окислительные вспышки или митофлаши являются окислительными всплесками в митохондриях, которые корень из сложной молекулярной динамики.Реализация этой схемы стимуляции фотографий привела к успешному возбуждению митофлаша. Эта фотостимуляция также показывает разновидности митохондриальной молекулярной динамики, включая фрагментацию и восстановление митохондриальной морфологии, а также колебания митохондриального мембранного потенциала. Как и фото активированные митофлаши, эти митохондрии события имеют различную производительность с разной интенсивности власти.Самое главное, чтобы убедиться, что фокус, размер и точность фемтосекундного лазера является свойством для стимуляции в клетках. Ближайший инфракрасный фемтосекундный лазер может быть опасным для пользователей. Следуя этому протоколу, носить надлежащую защиту, и это предотвращает лазер от распространения из оптического стола.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Изображений G-белком рецептор (GPCR)-опосредованной сигнализации События, управления хемотаксис Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Определение липидного плота разделов флуоресцентно с метками зонды в живых клетках при флуоресцентной спектроскопии корреляции (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или<em&gt; В Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Обработки изображений G-белком рецептор-опосредованный хемотаксис и его сигнальных событий в нейтрофилами как клетки HL60

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...