Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Arbetet stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81571719 och 81661168014, 81673014 och 81870055), Shanghais kommunala vetenskaps-och teknik kommitté (18QA1402300 och 16XD1403100), och National Key R & D plan (2017YFA0104600).

Försiktighet: Protokollet som presenteras nedan innebär att använda NIR femtosecondlaser laser och giftiga kemikalier. Vänligen uppmärksamma alla möjliga skador som induceras av experiment förfaranden. Läs säkerhetsdatabladen för alla relevanta kemikalier eller annat material före användning. Vänligen Följ säkerhetsanvisningarna för laseranläggningar eller konsultera proffs för vägledning innan du använder laserkälla.
1. experimentell förberedelse
<ol><...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Vi visar en fotostimulering strategi genom att kombinera en femtosecondlaser laser med en laser scanning konfokala Mikroskop system. Photostimulation kan direkt fungera som en två-Photon mikroskopi genom att definiera Stim-B i enlighet därmed. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att utnyttja en kort blixt av femtosecondlaser laser för att utlösa ERK signalering eller mitoblixtar i målceller. De olika stimuleringslägen kan utföras enligt olika experimentella syften och system. Stim-A kan enkelt ställ...

Tekniken för att kontrollera cellulära signalmolekyler är en viktig del av utvecklingen av Life Science. Traditionellt, den mest använda metoden är biokemisk behandling av droger eller biologiska material1,2,3. Under det senaste decenniet öppnar uppfinningen av optogenetik en ny era för cellulära molekylära signal modulering. Transfektion med ljuskänsliga proteiner genom genteknik gör att ljus blir ett kraftfullt verktyg för att modulera olika protein aktiviteter i målcellen. Denna teknik har gjort uppmuntrande framsteg såsom excitation och hämning av neurala signal, främja genuttryck, manipulera cellulära signal mönster, ledande olika cell öden och patologisk utredning4,5 ,6,7,8,9. Men ljus kan bara fungera genom att transfecting celler med optogenetiska proteiner. I nuvarande skede finns det sällsynta metoder som gör det möjligt för ljus att kontrollera cellulära molekyler direkt förutom optogenetik.
Femtosecond laser har avancerade biologiska undersökningar genom att ge effektiv multiphoton excitation samtidigt bibehålla god biologisk säkerhet. Genom att distribuera olika strategier Foto bearbetning, har det insett många prestationer såsom multiphoton mikroskopi, microsurgeries och multiphoton optogenetiska tillämpningar10,11,12,13 ,14,15,16. Nyligen undersökningar visar att femtosecondlaser laserstimulering har visats som en mycket effektiv optisk metod för att direkt inducera molekylära signal händelser. Det har visat sig att tätt fokuserad femtosecondlaser laser bestrålning på endoplasmatiska Retikulum (ER) kan tömma kalcium i ER och aktivera kalcium-release-aktiverade kalcium (CRAC) kanaler för att bilda kalcium signaler i celler17. Denna fotoaktiverade kalcium signal kan spridas mellan olika typer av celler18,19,20. Dessutom, det har också förmågan att aktivera cell signalering vägar såsom nukleär faktor aktiverade T-celler (NFAT) och erk signalering väg21,22. Genom att justera intensitet och lokalisering av femtosecondlaser laser exponering i celler, till exempel, att fokusera lasern på mitokondrien, det kan påverka mitokondriell morfologi och molekylära händelser23,24, 25. specifikt, utbrott av mitokondriell ros generation kan vara upphetsad av photostimulation, som är märkt som fluorescerande blixtar i mitokonan (mitoblixtar).
Därför är fotostimuleringstekniken av god potential att allmänt tillämpas i relaterad biologisk forskning. Det är också en god chans att förlänga femtosecondlaser laserapplikationer i kontroll av cellulära signalmolekyler och funktioner förutom mikroskopi. Här ger vi de tekniska detaljerna i photostimulation. Den photostimulation uppnås genom att koppla en femtosecondlaser laser till ett konfokala Mikroskop för att ge enda målcellen med en kort blixt photostimulation. Det kan initiera effektiv och kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Om photostimulation ligger på mitokondriell tubulär struktur, mitokondriella membranet potential, morfologi, ROS, och permeabilitet övergången porer, kan alla styras av photostimulation. Baserat på denna photostimulation system, ger vi en detaljerad metod för att aktivera ERK signalering väg och påverka flera mitokondriella händelser i hela celler. Detta protokoll belyser processen för att leverera femtosecondlaser laserstimulering till målceller.
Photostimulation systemet är etablerat på ett konfokala Mikroskop med en femtosecondlaser laser koppling i den för samtidig stimulering och kontinuerlig mikroskopi. Den femtosecondlaser laser (våglängd: 1 040 nm, repetitionshastighet: 50 MHz, pulsbredd: 120 FS, maximal effekt genomsnittlig effekt: 1 W) är uppdelad i två balkar innan kopplingen. En styrs genom ett relä teleskop som består av ett par linser. Det återspeglas sedan direkt i back-bländare av ett mål (60x, N.A. = 1,2, vatten nedsänkning) att bilda en diffraktion-Limit fokus (Stim-A). Den andra reflekteras till scanning optiska vägen av konfokalmikroskopi Mikroskop att arbeta som en två-Photon scanning mode (Stim-B). Stim-A presenterar en fast fokuspunkt i mitten av synfält (FOV). Stim-B är en fördesignad partiell konfokal scanning område i FOV. Stim-A och stim-B visas i figur 1a. En CCD-kamera under Dichroic Mirror (DM) ger ljus-fält Imaging för övervakning i fokus för femtosecondlaser laser.
Det finns några viktiga nödvändigheter för följande experiment. I detta protokoll används en femtosecondlaser fiber laserkälla (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) som ett exempel. I praktiken kan de flesta kommersiella femtosecondlaser oscillatorer användas så länge pulsen bredden är kortare än 200 FS och toppeffekt tätheten bör vara över nivån på 1011 ~ 1012 W/cm2. Till exempel, en TI: Sapphire laser som vanligtvis används för multiphoton mikroskopi kan ersätta den femtosecondlaser lasern visade i figur 1b. Lasern makt och några andra photostimulation parametrar måste trimmas eftersom de optiska parametrarna (pulsbredd, våglängd, och upprepning hastighet) varierar mycket i olika femtosecondlaser lasrar som därmed inducera olika multiphoton excitation effektivitetsvinster.
Tillsammans med femtosecondlaser laserstimulering ger konfokalmikroskopi kontinuerlig cell avbildning för att övervaka molekylär dynamik i realtid i både Stim-A och stim-B-lägena. Båda fotostimuleringsscheman (Stim-A och stim-B) styrs av en mekanisk slutare med millisekunders upplösning (figur 1).
I stim-A-läge, är placeringen av laser fokus fast i mitten av FOV. Ett relä teleskop används för att säkerställa fokus för femtosecondlaser laser ska placeras på konfokalmikroskopi Imaging planet genom att trimma avståndet mellan två linser i vertikal riktning (laser spridnings riktningen, vertikal till konfokala avbildning planet, som visas i Figur 1). Vid Bright-Field avbildning av CCD-kamera, kan diametern på laser fokus mätas (~ 2 μm, figur 2b). Stimuleringens varaktigheter och exponeringstider styrs av en slutare under den konfokala avbildningsprocessen.
I stim-B-läget kan stimuleringsområdet förhandstilldelas manuellt i konfokalmikroskopi Imaging kontrollerande programvara till någon form som linje, polygon eller cirkel. Slutaren synkroniseras med den konfokala skanningsprocessen. Det öppnar på pre-designade tid som är inställd genom konfokalmikroskopi Imaging kontrollerande programvara. Då är stimulering området skannas av femtosecondlaser laser som konfokal mikroskopi. Således är provet endast stimuleras av femtosecondlaser laser när konfokala skanningsprocessen går in i en given bildruta.
Fotostimuleringssystemet kan fastställas på både inverterade och upprätt metallurgiska Mikroskop enligt försökspersonerna. In vitro-celler odlade i petriskålar är bättre att arbeta med inverterade Mikroskop. Djur, särskilt hjärnor av levande djur, är mer lämpade med upprätt Mikroskop. I denna studie tar vi det inverterade mikroskopet som ett exempel. Det bör noteras att omslaget till petriskål inte öppnas under hela experiment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Direkt kontroll av cellulär definierade molekylära händelser är viktigt för Life Science. Nyligen, studier har visat att femtosecondlaser laserstimulering kan samtidigt aktivera flera cellulära molekylära signalvägar. I detta protokoll visar vi att genom att koppla femtosecondlaser laser till ett konfokalmikroskop kan celler stimuleras just av den tätt fokuserade lasern. Vissa molekylära processer som kan observeras samtidigt aktiveras därefter. Vi presenterar detaljerade protokoll för photostimulation att aktivera extracellulär signal reglerade Kinas (ERK) signalering väg i hela celler. Mitokondriella blixtar av reaktiva syreradikaler (ROS) och andra mitokondriella händelser kan också stimuleras om att fokusera femtosecondlaser laserpuls på en viss mitokondriell tubulär struktur. Detta protokoll innehåller förbehandling celler före photostimulation, leverera photostimulation av en femtosecondlaser laser blixt på målet, och observation/identifiera molekylära förändringar efteråt. Detta protokoll representerar ett helt optiskt verktyg för relaterade biologiska undersökningar.

Photostimulation kan utföras samtidigt tillsammans med kontinuerlig konfokal scanning mikroskopi. Photostimulation kan börja vid en fördefinierad tidslucka i tidsförlopp konfokalmikroskopi sekvens. Den konfokala mikroskopi kan övervaka cellulära molekyler genom fluorescerande avbildning. De molekylära svaren på fotostimulering och annan dynamik kan identifieras på detta sätt. Teoretiskt, om ERK är aktiverad, det kommer att fosforyleras flytta från cytoplasman till cell Nucleus...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Tätt fokuserad femtosecondlaser laser kan leverera exakt stimulering till celler genom att kopplas till en konfokal mikroskopi möjliggör realtid observation och photostimulation. Den photostimulation kan aktivera cell molekylära händelser inklusive ERK signalering väg och mitokondriella blixtar av reaktiva syreradikaler.

Photostimulation av Femtosecond laser aktiverar extracellulär-signalreglerade Kinas (ERK) signalering eller mitokondriella händelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Optiska metoder, såsom optogenetik kan ge den exakta moduleringen av cellulära molekylära signaler. Vårt protokoll visat en muntliga optisk manipulation av cellulära signalen molekylära genom femtosecond laser stimulering. Genom att koppla vår femtosekd laser i en confocal mikroskop, kan vår teknik ge encelliga eller subcellulära nivå drift genom femtosecond laser stimulering och realtid, molekylär dynamisk övervakning av confocal mikroskopi.Denna metod kan tillämpas på alla fluorescerande mikroskopisystem genom att koppla en femtosekdlaser i systemet på rätt sätt. För alla som försöker vår metod för första gången, vänligen följ separata instruktioner av laser anläggningen eller söka vägledning från proffs när du driver ett labb femtosecond laserkälla. Till att börja, slå på femtosecond laser och konfokalmikroskop.Använd reflekterande speglar för att rikta femtosekd laserstråle genom en mekanisk slutare. Därefter ställer du in ett reläteleskop bestående av ett par linser för att expandera transmissionsstrålebredden. Detta bör vara förenligt med baksidan bländare av målet.Nu, styra reflekterande speglar för att anpassa den expanderade strålen i mikroskopet. Justera de två reflekterande speglar, påpekade här, att stämma fokus för femtosecond laser till mitten av synfältet. Slutligen, mäta och stämma lasrarna som beskrivs i den medföljande textprotokoll.Kultur Hela celler med hjälp av standardtekniker. När du är redo att utföra experimentet, transfect cellerna med ERK2-GFP som beskrivs i den medföljande textprotokoll. Därefter slår på laserscanning confocal mikroskop och femtosecond laser.Se till att laserns slutare är stängd. Öppna sedan mikroskopmjukvaran. Ställ excitation laser på 488 nanometer, och ställ in dess effektnivå på 0,1 milliwatt.Ange bildstorleken som 512 med 512 pixlar, och intervalltiden för varje pixel som 2,4 mikrosekond. Ställ sedan in intervalltiden mellan två bildrutor vid sex sekunder för att minimera fotoblekning och fotoskador på cellerna. Ställ också in de totala bildbildsramarna vid cirka 300 bildrutor för att ge cirka 30 minuters kontinuerlig mikroskopi i ett enskilt experiment.Ta skålen som innehåller Hela cellerna transfekterade med ERK2-GFP från inkubatorn, och sätt skålen på mikroskopet scenen. I programvaran, starta snabb skanning läge, och ställa in målet att skaffa tydliga fluorescerande bilder av cellerna. Sedan, stoppa snabb skanning och växla till ljus-fält bildhanteringsläge med hjälp av CCD-kameran.Öppna slutaren och justera avståndet mellan reläteleskopets två linser för att säkerställa att diametern på femtosecond laserfokus är ungefär två mikrometer. Stäng sedan slutaren för att slutföra justeringen. Ställ in kraften i femtoseked laser på 15 till 40 milliwatt för en 810 nanometer laser, eller en 20 till 60 milliwatt för en 1040 nanometer laser.Ställ sedan in slutarens öppningstid på 05 till 0,2 sekunder. Använd snabb skanningsläge för att välja en målcell som starkt uttrycker ERK2-GFP. När hittade, flytta scenen för att lokalisera cytosol området för den valda målcellen så att den är i mitten av synfältet när under ljusa fält bildbehandling.När centrerad, klicka på startknappen för att börja kontinuerlig bildbehandling. Öppna slutaren vid någon fördefinierad tidslucka för att leverera femtosecond laserstimulering i målcellen. När avbildningsprocessen är klar sparar du bilddata för vidare analys.Ställ in kraften hos femtoseked lasern på 15 till 40 milliwatt och 810 nanometer och 20 till 60 milliwatt och 1040 nanometer vid exemplaret. Ta sedan skålen som innehåller celler transfekterade med ERK2-GFP från inkubatorn och lägg den på mikroskopstadiet. Använd snabb skanningsläge för att välja målcellen väl uttrycker ERK2-GFP.Ställ sedan in konfokal avbildningsprocessen och definiera en speciell skanningsram som stimuleringsramen i bildtagningsprocessen. Definiera parametern för stimuleringsramen. Ställ in en skanningsregion på två och tre av tre kvadratiska mikrometer vid cytosolområdet nära kärnan i målcellen.Ställ in den totala skanningstiden till 0,1 till 0,2 sekunder. Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor vid sex sekunder och ställ in de totala bildbildsramarna till runt 300 bildrutor för att ge cirka 30 minuters kontinuerlig mikroskopi. Spara bilddata för ytterligare dataanalys.Synkronisera slutaren av femtoseksen laser med den av confocal scanning enligt den fördefinierade foto stimulering område som endast är öppen när laserscanning droppar i stimulering ram. Klicka på startknappen för att starta den kontinuerliga avbildningsprocessen för mikroskopi. För att observera mitokondriell morfologisk dynamik, transfect Hela celler med Mito-GFP att fluorescerande ange mitokondrierna, eller en bas med mito-cpYFP att observera mitoflashes.Efter transfection, slå på femtosecond laser och se till att slutaren är stängd. Slå sedan på laserscanningskonfokalmikroskopet. Ställ excitationslasern på 488 nanometer.Ställ sedan in effektnivån för 488 nanometerlasern på 0,1 milliwatt. Dessutom ställer du in bildstorleken på 512 gånger 512 pixlar och den totala bildtiden för varje bildruta till 2,2 sekunder. Ställ sedan in intervalltiden mellan två bildrutor vid noll sekunder och de totala bildbildsramarna som 200 bildrutor för att ge cirka 440 sekunders kontinuerlig mikroskopi i ett enskilt experiment.Ta skålen som innehåller celler transfekterade med mito GFP eller mitokondriellt inriktade cirkulärt permuted gul fluorescerande protein från inkubatorn och sätta skålen på mikroskopet scenen. Kontrollera status för femtosekrad laser för att säkerställa att fokus för femtosecond lasern ligger i mitten av synfältet. Ställ sedan in en referenspil i mitten av fönstret för lysningsavbildning för att ange placeringen av fokus.Därefter ställer du in kraften i femtosekedlasern på fem till 30 miliwatt med lasern vid 810 nanometer och 10 till 40 milliwatt för lasern vid 1040 nanometer. Ställ in öppningstiden för slutaren på 05 till 0,1 sekunder. Använd snabb skanningsläge för att välja målcellen som väl uttrycker mito GFP eller det mitokondrieinriktade cirkulärt permuterade gula fluorescerande proteinet.Välj en mitokondri som slumpmässigt i målcellen som försöksperson. Därefter flyttar du mikroskopet scenen för att lokalisera målet mitokondriellt tubulär struktur i mitten av synfältet genom snabb skanning läge som anges av referenspilen. Klicka på startknappen för att starta kontinuerlig avbildning.Slutligen, öppna slutaren vid någon fördefinierad tid för att leverera femtosecond laser stimulering i målet mitokondriellt rörformiga struktur. Vänta tills avbildningsprocessen är klar och spara sedan bilddata för ytterligare dataanalys. Med hjälp av den metod som presenteras i detta protokoll, translocates ERK2 i kärnan efter att ha behandlats med en kort blixt av femtosecond laser.ERK2-GFP fluorescens når maximalt efter flera minuter av femtosecond laser stimulering. ERK2-molekylerna kommer att defosforyleras efter att ha aktiverat substrat nedströms i kärnan och sedan kommer ERK2 tillbaka till den cytoplasma som indikeras av en minskning av nukleära GFP fluorescens. ERK2 kan aktiveras flera gånger genom flera fotostimulering.Därför är det möjligt att manipulera SIGNALmönstret ERK2 exakt genom att kontrollera intervalltiden mellan flera stimuli. Dessutom kan ERK2 då och då aktiveras i angränsande celler runt den stimulerade cellen. Denna observation indikerar att vissa diffusa molekyler kan frigöras av den cell som behandlats med femtosecond lasern för att aktivera ERK2 i de angränsande cellerna.Fosforylering av ERK2 nedströms protein eIF4E kan bekräftas individualiserad genom immunofluorescensmikroskopi. Detta resultat indikerar att femtosekvisit laserstimulering framgångsrikt kan aktivera ERK-signalvägen. Mitokondriellt oxidativa blixtar eller mitoflashes är oxidativa skurar i mitokondrierna som rot från komplexa molekylära dynamik.Genomföra detta foto stimulering system resulterade i en framgångsrik mitoflash excitation. Detta foto stimulering visar också sorter av mitokondriellt molekylär dynamik inklusive fragmentering och restaurering av mitokondriell morfologi samt svängning av mitokondriellt membran potential. Liknar foto aktiveras mitoflashes, dessa mitokondrier händelser har olika prestanda med olika makt intensiteter.Det viktigaste är att se till att fokus, storlek och precisionen i femtosekvisionslaser är en egenskap för stimuleringen i celler. Den nära infraröda femtoseksiska lasern kan vara farlig för användarna. När du följer detta protokoll, bär ordentligt skydd och det hindrar lasern från att sprida ut från det optiska bordet.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-proteinkopplade receptor (GPCR)-medierad signalering Händelser som Kontroll chemotaxis av Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestämning av lipidaggregat avskärmning av fluorescensmärkt taggade proberna i levande celler genom fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Bedömning av Mitokondriella funktioner och cellviabilitet i Renal celler som överuttrycker proteinkinas C-isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal avbildning av Single Mitochondrial Superoxid Blinkar i intakt hjärta eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G-proteinkopplad receptor-medierad kemotaxi och dess signaleringshändelser i neutrofil-liknande HL60-celler

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifiering av intracellulära signalerings händelser som framkallas i levande celler genom interaktion med angränsande celler genomgår apoptotisk celldöd

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...