Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

İş Çin 'in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81571719 ve 81661168014, 81673014 ve 81870055), Şanghay Belediye bilimi ve Teknoloji Komitesi (18QA1402300 ve 16XD1403100) ve ulusal anahtar R & D planı (2017YFA0104600) tarafından destekleniyordu.

Dikkat: Aşağıda sunulan protokol NIR femtosaniye lazer ve toksik kimyasallar kullanarak içerir. Lütfen deneme prosedürleri tarafından indüklenen tüm olası zararlara dikkat edin. Lütfen kullanmadan önce tüm ilgili kimyasalların veya diğer malzemelerin güvenlik veri sayfalarını okuyun. Lazer kaynağını çalıştırmadan önce lütfen lazer tesislerinin güvenlik talimatlarını izleyin veya rehberlik için profesyonellere danışın.
1. deneysel hazırlık
...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Femtosaniye lazer ile bir lazer tarama Konfokal mikroskop sistemi ile birleştirerek bir fotostimulasyon stratejisi göstermektedir. Photostimulasyon, stim-B ' i buna göre tanımlayarak doğrudan iki foton mikroskopisi olarak çalışabilir. Biz erk sinyalizasyon veya hedef hücrelerde mitoflashes tetiklemek için femtosaniye lazer kısa bir flaş kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Farklı stimülasyon modları farklı deneysel amaçlarla ve sistemlere göre gerçekleştirilebilir. Stim-A, Konfokal mikro...

Hücresel sinyalizasyon moleküllerini kontrol etme teknolojisi, yaşam bilimin gelişiminin önemli bir parçasıdır. Geleneksel olarak, en sık kullanılan yöntem ilaçlar veya biyolojik malzemeler tarafından biyokimyasal tedavi1,2,3. Son on yıl içinde, optogenetik icat hücresel moleküler sinyal modülasyonu için yeni bir çağ açar. Gen mühendisliği ile hafif hassas proteinlerle transfeksiyon, ışık hedef hücrede çeşitli protein etkinliklerini modüle etmek için güçlü bir araç haline gelir. Bu teknoloji, sinirsel sinyalin uyarılması ve inhibisyonu, gen ifadesini teşvik etme, hücresel sinyal desenlerini manipüle etme, farklı hücreli kaderlerde önde gelen ve patolojik soruşturma gibi teşvik eden gelişmeleri4,5 ,6,7,8,9. Ancak, ışık yalnızca optogenetik proteinlerle hücreleri transferleştirerek çalışabilir. Mevcut aşamada, optogenetik dışında doğrudan hücresel molekülleri kontrol etmek için ışık sağlayan nadir yöntemler var.
Femtosecond lazer, iyi biyolojik güvenliği korurken verimli multifoton uyarma sağlayarak gelişmiş biyolojik araştırmalara sahiptir. Çeşitli fotoğraf işleme stratejilerini dağıtarak, multifoton mikroskobu, mikrocerrahi ve multifoton optogenetik uygulamalar gibi sayısız başarıları gerçekleştirmiştir10,11,12,13 ,14,15,16. Son araştırmalar, femtosaniye lazer stimülasyonunun, moleküler sinyalizasyon etkinliklerini doğrudan teşvik etmek için son derece verimli bir optik Yöntem olarak gösterilme olduğunu göstermektedir. Endoplazmik retikulum (er) üzerinde sıkı odaklı femtosaniye lazer ışınının, er 'de kalsiyum artışını ve hücrelerde kalsiyum sinyalleri oluşturmak için kalsiyum serbest aktif kalsiyum (CRAC) kanallarını etkinleştirebileceği bulunmuştur17. Bu fotoğraf aktive kalsiyum sinyali birden fazla hücre türü arasında yayılabilir18,19,20. Ayrıca, aynı zamanda aktif T hücrelerinin nükleer faktörü (nfat) ve erk sinyalizasyon yolu21,22gibi hücre sinyalizasyon yollarını etkinleştirmek için yeteneğine sahiptir. Örneğin, hücrelerde femtosaniye lazer pozlama yoğunluğu ve lokalizasyonu ayarlayarak, mitokondri üzerinde lazer odaklama, bu mitokondriyal Morfoloji ve moleküler olayları etkileyebilir23,24, 25. özellikle, mitokondriyal Ros nesil patlamalar, mitokondri (mitoflashes) Floresan yanıp sönen olarak belirtti photostimulasyon tarafından heyecanlı olabilir.
Bu nedenle, fotostimulasyon teknolojisi, ilgili biyolojik araştırmalarda yaygın olarak uygulanacak iyi bir potansiyele sahiptir. Ayrıca mikroskobik yanı sıra hücresel sinyal molekülleri ve fonksiyonları kontrol femtosaniye lazer uygulamaları genişletmek için iyi bir şans. Burada, fotostimulasyonun teknik ayrıntılarını sağlıyoruz. Fotostimulasyon, kısa flaş photostimulasyonu olan tek bir hedef hücre sağlamak için femtosaniye lazer ile Konfokal mikroskobun bağlaması ile elde edilir. Hücredeki verimli ve kontrol edilebilir ERK aktivasyonunu başlatabilir. Photostimulasyon mitokondriyal tübüler yapısında bulunuyorsa, mitokondriyal membran potansiyeli, morfoloji, ROS ve geçirgenlik geçiş gözenekleri, fotostimulasyon ile kontrol edilebilir. Bu fotostimulasyon şemasını temel alarak, ERK sinyalizasyon yolunu etkinleştirerek ve hela hücrelerinde birden fazla mitokondriyal olayı etkileyen ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz. Bu protokol, femtosaniye lazer stimülasyon hedef hücrelere teslim sürecini elucidates.
Fotostimülasyon sistemi, eşzamanlı stimülasyon ve sürekli mikroskopide femtosaniye lazer bağlantısı olan bir Konfokal mikroskop üzerinde kurulmuştur. Femtosaniye lazer (dalga boyu: 1.040 Nm, tekrarlama oranı: 50 MHz, darbe genişliği: 120 FS, maksimum çıkış ortalama güç: 1 W) bağlantı önce iki kiriş içine ayrılır. Biri lensler bir çift oluşan bir röle teleskop aracılığıyla yönlendirilir. Daha sonra doğrudan bir objektif arka diyafram yansıtılır (60x, yok = 1,2, su daldırma) bir dikesyon-limit odak (stim-A) oluşturmak için. Diğer iki foton tarama modu (stim-B) olarak çalışmak için Konfokal mikroskop tarama optik yolu yansıtılır. Stim-A, görüş alanı (FOV) merkezinde sabit bir odak noktası sunar. Stim-B, FOV 'de önceden tasarlanmış bir kısmi konfetit tarama alanıdır. Stim-A ve stim-B Şekil 1a'da gösterilir. Dikroik Mirror (DM) altında bir CCD kamera femtosaniye lazer odağı izlemek için parlak alan görüntüleme sağlar.
Aşağıdaki deneyler için bazı önemli esasları vardır. Bu protokolde, örnek olarak femtosaniye Fiber Lazer kaynağı (1040 Nm, 50 MHz, 120 FS) kullanılır. Uygulamada, çoğu ticari femtosaniye osilatörler, darbe genişliği 200 FS 'den daha kısaysa ve en yüksek güç yoğunluğu 1011 ~ 1012 W/cm2seviyesinden daha kısa olduğu sürece kullanılabilir. Örneğin, bir ti: Safir lazer genellikle multifoton microkopi için kullanılan femtosaniye lazer Şekil 1Bgösterdi yerine edebiliyoruz. Optik parametreler (darbe genişliği, dalga boyu ve tekrarlama oranı), farklı femtosaniye lazerlere göre farklı multifoton uyarma verimliliklerini artırdığından, lazer gücü ve diğer bazı fotostimulasyon parametrelerinin ayarlanması gerekir.
Femtosaniye lazer stimülasyon ile birlikte, Konfokal mikroskopide hem stim-A hem de stim-B modlarında moleküler dinamikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için sürekli hücre görüntüleme sağlar. Her iki fotostimulasyon şeması (stim-A ve stim-B) milisaniyelik çözünürlüğe sahip mekanik bir deklanşör ile kontrol edilir (Şekil 1).
Stim-A modunda, lazer odağı konumu FOV merkezinde sabit. Bir röle teleskop, dikey yönde iki lensler arasındaki mesafeyi ayarlayarak Konfokal görüntüleme düzleminde bulunan femtosaniye lazer odağı sağlamak için kullanılır (lazer yayılma yönü, konfeti görüntüleme düzlemine dikey, gösterildiği gibi Şekil 1). CCD kameranın parlak alan görüntülemesinde lazer odağı çapı ölçülebilir (~ 2 μm, Şekil 2B). Stimülasyon süreleri ve pozlama süreleri, Konfokal görüntüleme sürecinde bir deklanşör ile kontrol edilir.
Stim-B modunda, stimülasyon alanı, Konfokal görüntüleme kontrol yazılımında hat, çokgen veya daire gibi herhangi bir forma el ile önceden atanabilir. Deklanşör, Konfokal tarama işlemi ile senkronize edilir. Bu Konfokal görüntüleme kontrol yazılımı aracılığıyla ayarlanır önceden tasarlanmış zaman açılır. Ardından, stimülasyon alanı femtosaniye lazer tarafından Konfokal mikroskopi olarak taranır. Böylece, örnek sadece femtosaniye lazer tarafından uyarılır Konfokal tarama işlemi belirli bir görüntüleme çerçevesi girdiğinde.
Fotostimulasyon sistemi, deney konularına göre hem ters hem de dik Metalurji mikroskopları üzerinde kurulabilir. Petri yemekleriyle Kültürlenmiş In vitro hücreler, ters mikroskoplarla çalışmak daha iyidir. Hayvanlar, özellikle canlı hayvanların beyni, dik mikroskoplar ile daha uygundur. Bu çalışmada, ters mikroskopla örnek olarak ele alacağız. Bu petri tabağı kapağı tüm deneyler sırasında açılmamış olduğunu unutulmamalıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Hücresel tanımlı moleküler olayların doğrudan kontrolü yaşam bilimi için önemlidir. Son zamanlarda, çalışmalar femtosaniye lazer stimülasyon aynı anda birden fazla hücresel moleküler sinyalizasyon yollarını etkinleştirebilir göstermiştir. Bu protokolde, femtosaniye lazer ile bir Konfokal mikroskop içine bağlama ile göstermek, hücreler sıkı odaklı lazer tarafından tam olarak uyarılabilir. Aynı anda gözlenen bazı moleküler süreçler daha sonra aktif hale getirilebilir. Hela hücrelerinde hücre içi sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon yolunu etkinleştirmek için fotostimulasyonun ayrıntılı protokollerini sunuyoruz. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve diğer mitokondriyal olayların mitokondriyal flaşlar da belirli bir mitokondriyal tübüler yapısında femtosaniye lazer nabız odaklama uyarılabilir. Bu protokol, fotostimulasyon öncesinde hücreleri ön tedavi ederek, fotostimulasyonu hedef üzerine femtosaniye lazer flaş ile teslim ederek ve daha sonra moleküler değişiklikleri gözlemlemek/tanımlayarak içerir. Bu protokol, ilgili biyolojik araştırmalar için tüm optik bir aracı temsil eder.

Fotostimulasyon sürekli Konfokal tarama mikroskobu ile birlikte aynı anda gerçekleştirilebilir. Fotostimulasyon zaman aşımı Konfokal mikroskopide herhangi bir önceden tanımlanmış zaman yuvasında başlayabilir. Konfoksel mikroskopide floresan görüntüleme ile hücresel molekülleri izleyebilirsiniz. Fotostimülasyon ve diğer dinamiklere moleküler tepkiler bu şekilde tespit edilebilir. Teorik olarak, Eğer ERK etkinleştirilirse, sitoplazmada fosforylated hareket olacak hü...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Optogenetik gibi optik yöntemler hücresel moleküler sinyallerin hassas modülasyonunu sağlayabilir. Protokolümüz hücresel sinyal molekülerlerinin femtosecond lazer stimülasyonu ile oral optik manipülasyonunu gösterdi. Femtosaniye lazerimizi konfokal mikroskoba dönüştürerek, tekniğimiz femtosecond lazer stimülasyon ve konfokal mikroskopi ile gerçek zamanlı, moleküler dinamik izleme ile tek hücreli veya hücre altı düzeyde operasyon sağlayabilir.Bu yöntem herhangi bir floresan mikroskopi sistemlerine femtosecond lazeri uygun şekilde sisteme entegre ederek uygulanabilir. İlk kez bizim yöntem çalışıyor herkes için, lazer tesisinin ayrı talimatları izleyin veya bir laboratuvar femtosecond lazer kaynağı çalışırken profesyonellerden rehberlik isteyin. Başlamak için, femtosecond lazer ve konfokal mikroskobu açın.Femtosecond lazer ışınını mekanik bir deklanşörden yönlendirmek için yansıtıcı aynalar kullanın. Daha sonra, iletim ışını genişliğini genişletmek için bir çift mercenden oluşan bir röle teleskopu ayarlayın. Bu, hedefin arka diyafram ile tutarlı olmalıdır.Şimdi, genişletilmiş ışını mikroskoba hizalamak için yansıtıcı aynaları yönlendirin. Burada işaret edilen iki yansıtıcı aynayı ayarlayarak, femtosecond lazerin odak noktasını görüş alanının merkezine ayarlayın. Son olarak, lazerleri eşlik eden metin protokolünde açıklandığı şekilde ölçün ve ayarlayın.Kültür Hela hücreleri standart teknikler kullanarak. Denemeyi gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, hücreleri eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi ERK2-GFP ile dönüştürün. Daha sonra, lazer tarama confocal mikroskop ve femtosecond lazer açın.Lazerin deklanşöründen emin olun. Sonra mikroskop yazılımını açın. Uyarma lazerini 488 nanometre ye ayarlayın ve güç seviyesini 0,1 miliwatt olarak ayarlayın.Görüntüleme boyutunu 512'ye 512 piksel, her pikselin aralık süresini 2,4 mikrosaniye olarak ayarlayın. Ardından, fotoğraf beyazlatma ve hücrelere fotoğraf hasarı en aza indirmek için altı saniye iki kare arasındaki aralık lı süreyi ayarlayın. Ayrıca, bireysel bir deneyde yaklaşık 30 dakika sürekli mikroskopi sağlamak için toplam görüntüleme çerçevelerini yaklaşık 300 kare olarak ayarlayın.Kuvözden ERK2-GFP ile geçirilen Hela hücrelerini içeren yemeği alın ve kasedi sahneye koyun. Yazılımda, hızlı tarama moduna başlayın ve hücrelerin açık floresan görüntülerini elde etmek için hedefi ayarlayın. Ardından, ccd kamerayı kullanarak hızlı taramayı durdurun ve parlak alan görüntüleme moduna geçin.Deklanşörü açın ve femtosecond lazer odakçapı yaklaşık iki mikron olduğundan emin olmak için röle teleskobun iki lens arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, ayarlamayı tamamlamak için deklanşörü kapatın. Femtosecond lazerin gücünü 810 nanometre lazer için 15 ila 40 miliwatt veya 1040 nanometre lazer için 20 ila 60 miliwatt olarak ayarlayın.Ardından deklanşör açılış saatini 05 ila 0,2 saniye olarak ayarlayın. ERK2-GFP'yi güçlü bir şekilde ifade eden bir hedef hücre seçmek için hızlı tarama modunu kullanın. Bulunduktan sonra, seçili hedef hücrenin sitosol alanını yerelleştirmek için sahneyi parlak alan görüntüleme altında görüş alanının merkezinde olacak şekilde hareket ettirin.Ortalandıktan sonra, sürekli görüntülemeye başlamak için başlat düğmesine tıklayın. Hedef hücreye femtosecond lazer stimülasyon sunmak için herhangi bir önceden tanımlanmış zaman diliminde deklanşör açın. Görüntüleme işlemi tamamlandığında, görüntüleme verilerini daha fazla analiz için kaydedin.Femtosecond lazerin gücünü 15 ila 40 miliwatt ve 810 nanometre ve 20 ila 60 miliwatt ve 1040 nanometre olarak ayarlayın. Daha sonra, inkübatörden ERK2-GFP ile geçirilen hücreleri içeren çanak alın ve mikroskop aşamasına koyun. ERK2-GFP'yi iyi ifade eden hedef hücreyi seçmek için hızlı tarama modunu kullanın.Daha sonra, konfokal görüntüleme işlemini ayarlayın ve görüntüleme işleminde uyarım çerçevesi olarak özel bir tarama çerçevesi tanımlayın. Stimülasyon çerçevesinin parametresini tanımlayın. Hedef hücredeki çekirdeğe yakın sitosol bölgesinde ikişer üçe üç mikrondan oluşan bir tarama bölgesi ayarlayın.Toplam tarama süresini 0,1 ile 0,2 saniye olarak ayarlayın. İki kare arasındaki zaman aralığını altı saniyede ayarlayın ve toplam görüntüleme çerçevelerini yaklaşık 300 kare olarak ayarlayın ve yaklaşık 30 dakika sürekli mikroskopi sağlayın. Görüntüleme verilerini daha fazla veri analizi için kaydedin.Femtosecond lazerin deklanşörünün, önceden tanımlanmış fotoğraf stimülasyon alanına göre konfokal tarama ile senkronize edin. Sürekli mikroskopi görüntüleme işlemini başlatmak için başlat düğmesini tıklatın. Mitokondriyal morfolojik dinamikleri gözlemlemek için, Mito-GFP ile transfect Hela hücreleri floresan mitokondriyi gösterir, ya da mito-cpYFP ile bir baz mitoflashes gözlemlemek için.Transfeksiyondan sonra femtosecond lazeri açın ve deklanşörün kapalı olduğundan emin olun. Sonra, lazer tarama confocal mikroskobu açın. Uyarma lazerini 488 nanometreye ayarlayın.Daha sonra, 488 nanometre lazergüç seviyesini 0.1 miliwatt ayarlayın. Ayrıca, görüntüleme boyutunu 512 piksele, her karenin toplam görüntüleme süresini 2,2 saniyeye ayarlayın. Daha sonra, iki kare arasındaki aralık süresini sıfır saniyede ve toplam görüntüleme çerçevelerini 200 kare olarak ayarlayın ve tek bir denemede yaklaşık 440 saniyelik sürekli mikroskopi sağlayın.Mito GFP veya mitokondriyal hedefli dairesel permuted sarı floresan protein ile transfected hücreleri içeren çanak alın ve mikroskop aşamasında çanak koymak. Femtosecond lazer odak görüş alanının merkezinde bulunan olduğundan emin olmak için femtosecond lazer durumunu kontrol edin. Ardından, odak noktasının konumunu belirtmek için floresan görüntüleme penceresinin ortasına bir başvuru oku ayarlayın.Daha sonra, 810 nanometre ve 1040 nanometre lazer için 10 ila 40 miliwatt lazer ile 5 ila 30 miliwatt olarak femtosecond lazer gücünü ayarlayın. Deklanşörün açılış saatini 05 ila 0,1 saniye olarak ayarlayın. Mito GFP'yi veya mitokondriyal hedefli dairesel permuted sarı floresan proteinini iyi ifade eden hedef hücreyi seçmek için hızlı tarama modunu kullanın.Deneysel nesne olarak hedef hücrede rastgele bir mitokondri seçin. Daha sonra, referans oktarafından belirtildiği gibi hızlı tarama modu ile görüş alanının merkezindeki hedef mitokondriyal tübüler yapıyı yerelleştirmek için mikroskop aşamasını hareket ettirin. Sürekli görüntülemeye başlamak için başlat düğmesini tıklatın.Son olarak, hedef mitokondriyal tübüler yapı içine femtosecond lazer stimülasyon sunmak için herhangi bir önceden tanımlanmış zamanda deklanşör açın. Görüntüleme işlemi tamamlanana kadar bekleyin ve daha fazla veri analizi için görüntüleme verilerini kaydedin. Bu protokolde sunulan yöntem kullanılarak ERK2 femtosecond lazerkısa bir flaş ile tedavi edildikten sonra çekirdeğe dönüşür.ERK2-GFP floresanfemtosaniye lazer stimülasyon birkaç dakika sonra maksimum ulaşır. ERK2 molekülleri çekirdekteki aşağı yüzeyleri etkinleştirdikten sonra fosforilasyona tabi tutulacak ve erk2 nükleer GFP floresanının azalması ile gösterilen sitoplazmaya geri döner. ERK2 birden fazla fotoğraf stimülasyonu ile birden çok kez aktive edilebilir.Bu nedenle, birden fazla uyaran arasındaki zaman aralığını kontrol ederek ERK2 sinyal desenini hassas bir şekilde işlemek mümkündür. Buna ek olarak, ERK2 bazen uyarılmış hücre etrafında bitişik hücrelerde aktive edilebilir. Bu gözlem, bazı diffusible moleküllerin bitişik hücrelerde ERK2 etkinleştirmek için femtosecond lazer ile tedavi hücre tarafından serbest bırakılabilir gösterir.ERK2 downstream protein eIF4E fosforilasyon immünororesans mikroskopisi ile bireyselleştirilmiş doğrulanabilir. Bu sonuç, femtosecond lazer stimülasyonun ERK sinyal yolunu başarıyla aktive edebildiği anlamına geliyor. Mitokondriyal oksidatif yanıp söner veya mitoflashes karmaşık moleküler dinamikleri kök mitokondri oksidatif patlamalar vardır.Bu fotoğraf stimülasyon şemasının uygulanması başarılı bir mitoflash uyarma ile sonuçlandı. Bu fotoğraf stimülasyonu aynı zamanda mitokondriyal morfolojinin parçalanması ve restorasyonu ile mitokondriyal membran potansiyelinin salınımını da içeren mitokondriyal moleküler dinamiğin çeşitlerini göstermektedir. Fotoğraf aktif mitoflashes benzer, bu mitokondri olaylar farklı güç yoğunlukları ile farklı performans var.En önemli şey odak, boyut ve femtosecond lazer hassasiyeti hücrelerde stimülasyon için bir özellik olduğundan emin olmaktır. Yakın kızılötesi femtosecond lazer kullanıcılar için tehlikeli olabilir. Bu protokolü takip ederken, uygun koruma yıpratın ve lazerin optik tablodan dışarı yayınılmasını önler.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...