Name: high-throughput analysis of optical mapping data using electromap
Uploaded: 2019-06-04T15:00:00
Duration: 7 min 36 s
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この研究は、EPSRC学生シップ(博士課程研修L016346のためのSci-Phy-4-ヘルスセンター)からD.P.に資金提供されました。 K.R.とL.F.、ウェルカムトラストシード賞助成金(109604/Z/15/Z)、英国心臓財団助成金(PG/17/55/33087、RG/17/15/33106)をD.P.、欧州連合(交付協定No 633196 [CATCH ME])、英国心臓財団(FS/13/43/30324からP.K.およびL.F.;PG/17/30/32961からP.K.、A.H.へ)、およびレダック財団をP.K.にJ.W.は英国心臓財団(FS/16/35/31952)の支援を受けています。

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P.K.は、心房細動で活動する複数の薬剤・デバイス企業から研究支援を受け、そのような企業数社から名誉を受けています。L.F.は、EU、BHF、MRC、DFG、ギリアドに対する制度研究助成金を受けています。P.K.およびL.F.は、バーミンガム大学が保有する2つの特許(心房細動療法WO 2015140571、心房細動のためのマーカー2016012783)の発明者として記載されています。

他のすべての著者は、潜在的な利益相反を宣言しません。

ここでは、心臓光学マッピングデータセットの柔軟かつ多可変数解析のためのオープンソースソフトウェアElectroMapの利用に関するステップバイステップガイドを紹介します。エレクトロマップを正常に使用するには、イメージングデータが .tif または .MAT 形式。ElectroMap には、いくつかの変更可能なユーザー設定が組み込まれています。図2Aで示すように、これは実験モデルとイメージングハードウェアの間に存在する広い不均一性のために必要である。ただし、ソフトウェア内の既定の設定が常に最適であるとは限らないため、ソフトウェアを使用する上で重要な手順は、ユーザーが特定の実験的なセットアップの設定を調整することです。これには、図 2Bに示すように、カメラの設定とタイムスケールが含まれます。最適な設定が見つかったら、[構成ファイル]を選択して後で保存して再読み込みできます。
自動化されたCL測定および信号セグメンテーションの組み込みは、ソフトウェアの主な利点です。これらの特徴は実験記録の急性応答の分析を可能にし、単一拍動に焦点を合わせから分析を広げる。必要なセグメンテーションが達成されると、シングルファイル分析モジュールは、個々のセグメント(単一ビートを含む)の自動分析を可能にし、記録全体の複数の変数のハイスループット分析を実現し、単一の .csv ファイル。組み合わせて、グループ化されたピークのアンサンブル平均化は、ElectroMap で自動的に実行されるノイズノイズ信号の品質を向上させる効果的な方法です。しかし、アンサンブル平均は、例えばビート対ビート変動の研究において、普遍的に有益ではありません。したがって、ElectroMapは、アンサンブル平均化を避けるために単一のビートセグメンテーションを統合し、SNR(空間および時間フィルタリング)を改善するための代替処理オプションを含み、さらに調査し、マップするためのAlternans解析モジュールが含まれていますビート対ビートの変動。
オプティカル マッピング データセットは、多くの場合、ベースライン ドリフトやモーション アーティファクトなどのアーティファクトを示します。同様に、生成される信号は、小さなピクセルサイズ、短い露光時間および低分画蛍光変化2のために低品質であることができます。これらの要因は、基になる EP 動作の効果的かつ正確な分析を妨げる。前述のとおり、ElectroMap には、これらの問題を克服するためのいくつかの処理戦略があります。しかし、これらのアルゴリズムを根本的に低品質/歪んだデータに適用することは、効果的な分析を妨げるでしょう。したがって、SNR は ElectroMap で測定および表示されるパラメータの 1 つです。同様に、ユーザーは、ピクセル情報と比較モジュールを使用してサンプルからの特定の領域からの信号を選択して比較することができ、図5に示すモーションアーティファクトなどの現象を識別することができ、適切なデータの除外。
現時点では、ElectroMap はベースライン補正と同じ方法で生データからモーション アーティファクトを除去することはできません。したがって、ソフトウェアの将来の開発の可能性は、報告されているように計算方法によるモーションアーティファクト除去を含有する31,32である。さらに、エレクトロマップは現在、1つの光信号の研究に限定されている。しかしながら、レシオメトリック染料と電圧及びカルシウム染料27の同時使用には、2つの波長チャネルの同時処理が必要である。したがって、デュアル信号解析の統合は、ソフトウェアに対する重要な将来の追加です。位相特異点追跡などの不整脈データセットに適用可能な分析オプションの拡張は、ソフトウェア33,34の範囲を均等に広げるだろう。最後に、記載されたいくつかの解析オプションは、電極マッピングデータの分析にも有用である。実際、ElectroMapは対照的な電グラム波形20、35にもかかわらず電極マッピングデータを分析するために使用されており、さらなる最適化は、このモダリティの使用を拡大します。

光学マッピングは、電圧および/またはカルシウム濃度の蛍光レポーターを利用して、従来のものよりも大きな空間分解能で心臓電気生理学(EP)およびカルシウム処理を多細胞製剤で調製します。テクニック1,2,3.したがって、光学マッピングは、心臓3、4、5における生理的および病因的電気的挙動に関する重要な洞察を提供する、重要かつますます利用される技術として出現した。,6,7,8.光学マッピング実験から得られたデータの効果的な処理と分析は、いくつかの要因によって複雑です。光マッピングデータセットの高い時空間分解能の性質は、数千の画像フレームで構成される生のビデオファイルで、それぞれが多数の個々のピクセルで構成され、高スループットと自動化を必要とする大きなデータファイルを生み出します。処理9.画素サイズが小さく、色素の負荷が悪く、蛍光の小さな小さな変化が、信号対雑音比(SNR)の低い光信号をもたらし、効果的な解析が達成可能である前処理を必要とする10。処理および分析は、光を利用して活性化を開始する光遺伝学的ペーシングプロトコルを使用することによってさらに複雑になり、蛍光センサ11、12からの記録された信号を歪める可能性がある。さらに、データが処理されると、いくつかの一貫性のない技術と定義を適用して目的のパラメータを測定することができ、最も適用可能な技術は実験のセットアップ、モデルおよび質問2によって異なる。 10、13.これらの制限は、技術のさらなる取り込みを妨げ、真に客観的な分析を妨げます。
これらの制限を克服するために、いくつかの研究グループは、実験モデル、質問、ハードウェア7、14、15、16に合わせたカスタム処理パイプラインを設計しました。その他は、基礎となるアルゴリズムが4、17にアクセスするのが難しいかもしれない商用プロプライエタリなソフトウェアを使用しています。その結果、光マッピングデータの処理と分析のために、自由に利用可能なオープンソースソフトウェアプラットフォームが明らかに必要です。このソフトウェアは、オープンソース、使いやすく、柔軟なパラメータ調整、明確なEP特性を持つ実験モデルの範囲に適用可能であり、心臓の範囲の簡単で調整可能な定量化を可能にすることが重要です。光学マッピングを使用して研究できるパラメータ。
我々は最近、心臓光学マッピングデータセット13の高い、半自動化された処理、分析およびマッピングのための包括的なソフトウェアプラットフォームElectroMapを公開し、リリースしました。ここでは、ElectroMap の利用に関するビデオ マニュアルを紹介し、複数の光マッピング データセットの処理、解析、およびマッピングに使用する方法を示します。私たちは、標準的なEPおよびカルシウム処理変数を定量化し、スタンドアロンの伝導速度、単一ファイル解析およびオルタナナンモジュールの使用を実証するためにElectroMapの使用に焦点を当てています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MATLAB and Simulink R2018a</td>
			<td>Mathworks, Inc, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td>MATLAB software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of optical mapping data using electromap

光学マッピングは、多細胞製剤における心臓電気生理学の高い時時間分解能研究のための確立された技術である。ここでは、光学マッピングによって取得された高解像度電圧およびカルシウムデータセットの解析、定量化、マッピングのためのElectroMapの使用をステップバイステップガイドで紹介します。ElectroMap解析オプションは、主要な電気生理学的パラメータの多種多様をカバーし、グラフィカルユーザーインターフェイスは、前処理とパラメータ定義の簡単な変更を可能にし、ElectroMapを幅広い範囲に適用可能にします。実験モデル。組み込みのペーシング周波数検出と信号セグメンテーションにより、実験記録全体のハイスループット解析、急性応答、単一ビート対ビート変動性を示します。さらに、ElectroMap には、ノイズの多いデータセットの信号品質を向上させるために自動マルチビート平均化が組み込まれ、この機能が単一のデータセットを使用する際に検出されない可能性のある電気生理学的変化を解明する方法を示します。ビート分析。カスタムモジュールは、ここで示すように、伝導、単一ファイル分析、および代替の詳細な調査のためにソフトウェア内に含まれています。このソフトウェアプラットフォームは、複雑な心臓電気生理学の処理、解析、マッピングを可能にし、加速するために使用することができます。

この研究の一環として行われたすべての作業は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する英国動物法(科学的手続き)法1986および指令2010/63/EUによって定められている倫理的ガイドラインに従って行われました。実験は、ホームオフィス(マウス:PPL 30/2967およびPFDAAF77F、モルモット:PPL PF75E5F7F)とバーミンガム大学(マウス)とキングスカレッジロンドン(モルモット)の機関レビューボードによって承認されました。ここで分析された生データの収集の詳細な方法は、以前の出版物5、6、14、19で見つけることができます。
ElectroMap を制御するメイン インターフェイスを図1Aに示します。データセットを分析するために必要な手順は、主に[イメージの読み込み]、[プロセスイメージ]、および[マップの作成] ボタンによって制御され、図 1Aではそれぞれ緑、青、赤で強調表示されています。図 1B-Dは、これらの各ボタンの選択時に発生する操作を示しています。ロード イメージは、ユーザーが選択したイメージしきい値オプション (図 1B)を適用し、プロセス イメージ(図 1C)はフィルタリングとベースライン補正を適用します。最後に、マップを作成すると、まず時間枠とセグメンテーションの設定に従ってデータを平均化し(単一のビートセグメンテーションを選択しない限り)、上述の解析を実行します。
ElectroMap の重要な側面は、カメラの種類と実験モデルに関する柔軟性です。これは、広く使用されているモデル間に存在する明確な心臓EPと解剖学的特性のために光学マッピングソフトウェアの有用性のために重要です。図2Aは、例えばモルモット心室と比較した場合のマウス心房の作用電位形態を示し、以前に報告した6,14として電圧感受性染料を用いて記録した。アクションポテンシャルの明確な形状と、異なるフレームレートとピクセルサイズを持つ2つの別々の光学マッピングカメラを使用しているにもかかわらず、ElectroMapを使用して両方のデータセットを正常に分析することができます。ただし、これにはユーザー インターフェイス内の一部のパラメーターを変更する必要があります (図 2B)。長引くモルモットアクションの可能性は、より大きな時間枠を必要とすることを注意してください。さらに、トップハットベースライン補正が光学的に記録された信号を生理学的に変更するのを防ぐために、その時間長は、それが作用電位の時間経過よりも大きくなるように増加する必要があります。
ElectroMapは、EPパラメータを効果的に回復するために必要とされるかもしれない光学的に記録された信号のSNRを改善するのに役立つ多数の処理オプションを提供しています。たとえば、データ セグメンテーションに続くピークの自動アンサンブル平均です。図3A-Cは、アンサンブル平均の適用が、他の方法の代わりに、孤立したマウス左アトリア(n=13)からSNRを改善する方法を示す。これにより、測定の不均一性と解析失敗の可能性が減少します (図 3D)。例えば、3 Hz から 10 Hz へのペーシング周波数の変更は APD50を変更しませんでしたが、アンサンブル平均化が行われていない場合、10 Hz ペーシングで APD50の予想29の減少が観測されました(図3E)。
図 4は、ElectroMap が提供する自動ペーシング周波数検出およびセグメンテーションの有効性と有用性を示しています。ここでは、マウス左のアトリア(n=5)を120ミリ秒のサイクル長でペースアップし、サイクル長は50ミリ秒に達するまで徐々に10ミリ秒短縮した。).これは、すべてのデータセットで高い精度で実現されました (図 4B)。データの自動セグメンテーションにより、ペーシング周波数/サイクル長の短縮に伴う伝導速度の減速の簡単かつ高スループット解析が可能となりました(図4C,D)。同時に、APD50(図4E)および拡張間隔(図4F)が短くなった。光学的に測定されたピークの振幅は減少し、ピークまでの時間は増加しました(図4G,H)。これらは再び心臓組織29、30における期待される返還応答であり、ElectroMapの使用は、薬理学的薬剤の存在下でのペーシング頻度に応答して変化を解明するのに役立ち、遺伝子改変、または病気の状態。
ElectroMap などのソフトウェアを使用する場合の重要な考慮事項は、基になるデータにアーティファクトが存在することです。図5は、例えば、運動アーティファクト(組織運動による光学的に記録された信号の歪み)がElectroMap内の活性化および特に再偏光の正確な測定を妨げることができることを示している。詳細については、「ディスカッション」を参照してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59663/59663fig1.jpg"> 図1:エレクトロマップの主な処理ステップ。(A) エレクトロマップのグラフィカルユーザーインターフェイスで、ロードイメージ(緑)、プロセスイメージ(青)、およびマップの生成(赤)ボタンが強調表示されます。(B)イメージの読み込みオプションの選択に適用できるイメージしきい値オプション。(C) ユーザーが利用できる信号処理オプションには、空間的および時間的なフィルタリングとベースライン補正が含まれており、プロセスイメージを押すことでイメージスタックに適用できます。(D) [マップの作成] を選択してアクティブ化される平均化とパラメータ定量 (APD 測定値を示す) をアンサンブルします。オシェイらから適応フィギュア, 201913.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59663/59663fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59663/59663fig2.jpg"> 図2:エレクトロマップを用いたマウスとモルモットのデータの解析(A) マウスのアトリアおよびモルモットの心室から光学的に記録された作用電位と、これらの信号の最初の(df/dt)と第2(d2 f/dt2)の両方を導出する。ElectroMap 内で使用できる活性化および再分極時間のさまざまな定義が強調表示されます。(B) ElectroMaps インターフェイスで使用される画像と信号処理設定のスクリーンショット。赤いボックスは、マウスとモルモットデータの分析の間に変更が必要な設定を強調表示します。オシェイらから適応フィギュア, 201913.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59663/59663fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59663/59663fig3.jpg"> 図 3: APD の変更を解決するための平均化をアンサンブルします。(A) APD50マップと例の単一ピクセル信号は、単一ビート光学作用電位から。(B)APD50マップと例えば、10連続ビート(ピーク法)のアンサンブル平均によって生成された光学作用電位からの単一画素信号。(C) 10ビート平均信号と比較して単一ビートのSNR。(D) APD50不均一性(i)および測定失敗数(ii)は、単一ビートおよび10ビート平均APD50マップのSNRの関数として。(E) APD50で 3 および 10 Hz のペーシング周波数を、単一のビートと 10 ビート マップから測定します。(平均±標準誤差、n = 13左アトリア、****p<0.001、学生のペアt-testによるデータ)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59663/59663fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59663/59663fig4.jpg"> 図4:心臓組織におけるペーシング周波数応答を研究するためにElectroMapを使用する。(A) ペーシング周波数認識とセグメンテーションのエレクトロマップスクリーンショットの例。(B) 既知とエレクトロマップの比較は、ペーシングサイクルの長さを測定した。(C) アクティベーションは、120 ミリ秒と 60 ミリ秒のペーシング サイクルの長さでマップされます。(D-H)伝導速度(D)、APD50(E)、拡張間隔(F)、振幅(G)、ピークまでの時間(H)を10ミリ秒単位で120msから60ミリ秒に減少させるペーシングサイクルの関数としてグループ化した。 (平均±標準誤差、n = 5左アトリアとして示されるデータ)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59663/59663fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59663/59663fig5.jpg"> 図 5: モーション アーティファクトの効果。(A) APD50マップ。(B) アクティベーションマップ。(C) APD およびアクティベーション マップでマークされた(十字)とマークされた場所からの信号の例。赤十字でマークされた組織の領域では、収縮が正常に結合解除されておらず、測定された光信号を歪める。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59663/59663fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

このプロトコルでは、心臓光学マッピングデータを分析するためのMATLABベースのオープンソースソフトウェアプラットフォームであるElectroMapのセットアップと使用について説明します。ElectroMapは、心臓実験モデルの広い範囲にわたって光学マッピング電圧とカルシウムデータセットの分析のための汎用性の高いスループットツールを提供します。

エレクトロマップを用いた光マッピングデータのハイスループット解析

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

心臓研究におけるマルチアレイおよび光マッピング技術の利用が拡大しています。しかし、現在欠けているのは、電気生理学データを分析するための堅牢で高スループットのオープンソースソフトウェアです。研究者の分析を支援する新しいソフトウェア「エレクトロマップ」を開発したのはこの理由です。エレクトロマップは、複数の異なるカメラ、複数の異なる蛍光色素、および光学マッピングと多電極アレイシステムを含む異なる取得モダリティーを使用して、任意の種から取得することができる心臓マッピングデータを分析するための新しく確立された方法を組み込んでいます。アクション電位持続時間、導電アッセイ、形態などの標準APパラメータの測定に加えて、エレクトロマップは解析と定量活性を可能にします。まず、GitHub リポジトリから、エレクトロマップの最新のソース コード リリースからすべてのファイルをダウンロードします。ダウンロードしたコンテンツを目的の場所に解凍します。MATLAB を開き、エレクトロマップのソース コードをホストするフォルダーの場所に移動します。次に、ファイルのエレクトロマップを開きます。m を押し、エディタで実行を押してエレクトロマップのユーザーインターフェイスを起動します。次に、画像をロードするには、[フォルダを選択]を押して、分析するデータ ファイルの場所に移動します。インターフェイス内からロードするファイルを選択し、Load イメージを押します。ロードされると、最初のフレームが表示され、赤い輪郭が画像の自動しきい値を示します。必要に応じて、しきい値ドロップダウンメニューのイメージのオプションを変更して、信号時間のコースの振幅に基づいてしきい値に変更します。しきい値を選択すると、イメージ スタック全体に適用されることに注意してください。必要に応じて、手動で画像のしきい値を調整するスライダーをアクティブにする手動にしきい値オプションを変更します。さらに、しきい値オプションの下にある適切なチェックボックスを選択して、分析対象のカスタム領域を選択します。領域の数など、対象地域の選択の詳細オプションは、上部メニューから ROI の選択から利用できることに注意してください。適切なしきい値を適用したら、プロセスイメージを押して処理を適用します。この時点で、フレームレートとキロヘルツとピクセルサイズ(マイクロメートル)と信号処理オプション(ウィンドウタイムフレーム、空間、時間フィルタリングなど)に正しいカメラ設定が入力されていることを確認してください。ファイルが処理された後、赤い円で標識された組織平均信号のピークを調べます。検出されたピークに基づいて信号をセグメント化します。セグメント信号を押します。必要に応じて、対象時間を拡大してセグメント信号を選択することで、信号のカスタムセグメンテーションを適用します。画像が処理されると、[マップの作成] ボタンがアクティブになります。アクションの潜在的な持続時間、活性化時間、伝導速度、および信号対雑音比分析を適用するために、マップを生成します。リスト ボックスから目的のセグメントを選択して、それぞれに解析を適用します。次に、[ピクセル情報を取得] を選択して、画像内の任意のピクセルからの信号の詳細な表示を表示し、ピクセルを比較して最大 6 つの位置からの信号を同時にプロットします。伝導速度のより詳細な分析にアクセスするには、プレス伝導。次に、単一ベクトルを押して、2点間の遅延不活性化時間から勾配ベクトルを計算する単一ベクトル法を用いて伝導を分析する。最後に、ローカルベクトルを押して、メインインタフェースの設定と一致する設定でマルチベクトルメソッドを適用します。活性化曲線を押して、時間の関数として活性化された組織の割合をプロットします。エレクトロマップを使用して他のパラメータを定量化するには、表示マップの上にあるドロップダウンメニューから、他の目的の解析のいずれかを選択します。単一ファイル分析を押すと、ファイル内の特定された各セグメントの高スループット継続時間と伝導分析用の専用モジュールが開きます。画像全体、または選択した領域または対象点に対して解析を実行します。エレクトロマップからデータをエクスポートするには、エクスポート値を押して、現在表示されているマップの値をメインユーザーインタフェースに保存します。次にエクスポート マップを押して、現在表示されているマップを含むポップアップを表示し、さまざまな画像形式で保存できます。必要に応じて、カラーバーアイコンを選択してカラーバーを追加します。[編集]、[カラー マップ] の順に選択して、縮尺を設定します。最後に、アクティブ化ビデオを押して、アニメーションGIFファイルとして保存できるアクティベーションシーケンスのアニメーションをレンダリングします。これは、前述のように、感応性染料を使用して記録されたモルモット心室と比較した場合のマウス心房の作用電位形態を示す。アクションポテンシャルの形状が明確で、フレームレートとピクセルサイズが異なる2つの別々の光学マッピングカメラを使用しているにもかかわらず、適切なパラメータを選択することで、両方のデータセットを正常に分析することができます。他の方法の代わりにアンサンブル平均を適用すると、離れたアトリアからSNRを改善することができます。3ヘルツから10ヘルツへのペーシング周波数の変化は、アンサンブル平均化が行われない場合にAPDを変更しなかったが、アンサンブル平均データから測定すると、10ヘルツペーシングでAPDの予想される減少が観察された。さらに、マウス左アトリアは120ミリ秒のサイクル長さでペースを上げ、サイクル長は50ミリ秒に達するまで10ミリ秒ずつ徐々に短縮された。エレクトロマップは、それに応じてペーシングサイクル長さとグループ組織の平均ピークを自動的に識別します。APDおよび拡張期間隔が短くなる。光学的に測定されたピークの振幅は、ピークまでの時間が増加する間に減少した。このプロトコルは、アクションの潜在的な持続時間、伝導速度、ピークからピークまでの変動性を迅速に分析するために、エレクトロマップの設定をインストールして設定する方法と、信号対雑音比を改善するために平均をアンサンブルする方法を示しています。私たちは、この自由に入手可能なソフトウェアのリリースは、研究者が分析ニーズを持ち、心臓研究のいくつかの主要な発見につながることを願っています。私たちは、開発したアルゴリズムを構築し続け、エレクトロマップ機能をさらに拡大するために他の人を奨励します。

Research

JoVE Journal

Medicine

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