Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

نشكر ديفيد هاس على أفكاره المفيدة في هذا العمل. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة روز هيلز زمالة البحوث الصيفية (2016-2018) وزمالة البحوث تحت التخرج USC لM.T.، وجائزة التدريب الداخلي معهد سابان للبحوث ما قبل الدكتوراه إلى دكتوراه، وجامعة جائزة برنامج شركاء البحوث الجامعية في جنوب كاليفورنيا إلى R.L.

وقد نُفذت جميع الإجراءات الحيوانية وفقاً للمبادئ التوجيهية المعتمدة من مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس ولجان الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانية التابعة لجامعة جنوب كاليفورنيا.
1. توليد ناقلات التعبير المستندة إلى pCS2
<ol><li>
لاستنساخ pCS2.Lifeact-eGFP، وإعداد العمود الفقري نا?...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

في هذا البروتوكول، قدمنا تعليمات خطوة بخطوة حول كيفية الحقن المجهري على وجه التحديد وmRNA الكهربائي في خلايا أجنة السمان الغاز. لقد أثبتنا أن الكهربة المركبة في المختبر تسمح بالتعبير السريع والفعال عن بروتينات الفلورسنت (FPs) في أجنة السمان الغازية(الشكلان 2 و3). ويم?...

الكهربائي هو طريقة التغوط المادي الذي يستخدم نبض كهربائي لخلق المسام العابرة في غشاء البلازما، مما يسمح لمواد مثل الأحماض النووية أو المواد الكيميائية لتمرير في السيتوسول. يستخدم على نطاق واسع الكهربائي لتسليم الحمض النووي في البكتيريا والخميرة والنباتات وخلايا الثدييات1،2،3. يتم استخدامه بشكل روتيني لإدخال الحمولات الوراثية في الخلايا والأنسجة المستهدفة داخل جنين الطيور النامية لدراسة الرقابة الوراثية على التنمية أو تسمية السكان المهاجرين من الخلايا4،5،6، 7. ومع ذلك، توجد عدة قيود تجريبية أيضا مع الكهربة الحمض النووي8. على سبيل المثال، غالباً ما يقدم الكهربة الحمض النووي أرقام متغيرة للغاية من ناقلات التعبير لكل خلية، وبالتالي mRNAs والبروتينات التي ترمز. هذا التباين يمكن أن يؤدي إلى عدم تجانس الخلية الكبيرة التي تعقدكل من تحليل الصورة وتفسير البيانات 9،10. بالإضافة إلى ذلك، البروتينات من الحمض النووي الكهربائي تبدأ فقط للتعبير عن ~ 3 ساعة بعد الكهربائي ولا تصل إلى أقصى قدر من الكفاءة في عدد الخلايا وكثافة الفلورة حتى 12 ساعة، على الأرجح بسبب الوقت اللازم لنقل إلى النواة وكاملة كل من النسخ والترجمة في الجسم الحي11.
وعلى النقيض من ذلك، تم استخدام التغوط mRNA بشكل فعال في مجموعة متنوعة من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا الدهنية Xenopus laevis عن طريق الحقن المجهري12،13، إعادة برمجة الخلايا الجذعية البشرية عن طريق الانقبح lipofectamine mRNA14 ، والخلايا الجذعية العصبية المتمردة الكهربائي في الفئران الكبار15. اختبرنا قدرة الكهرباء mRNA لتسمية الخلايا بكفاءة أثناء التطور الجنيني في وقت مبكر من الطيور باستخدام mRNAs في المختبر توليفها التي ترميز البروتينات الفلورية المتميزة (FPs). لدراساتنا, استخدمنا ناقلات pCS2 + , ناقلات التعبير متعددة الأغراض التي تستخدم عادة للتعبير عن البروتينات في Xenopus وحمار وحشي الأجنة. يسمح المروجون للبوليميراز من نوع SP6 وT7 RNA في pCS2+ بتوليف الحمض النووي الريبي والبروتين من أي جين مستنسخ عند استخدامه في نظام النسخ/الترجمة في المختبر.
هنا، نثبت أن الكهربة mRNA يسمح التعبير السريع والفعال من البروتينات الفلورية (FPs) في أجنة السمان الغاز. قمنا بتصميم وإنشاء العديد من ناقلات التعبير المستخدمة في هذه الدراسات. على سبيل المثال، نحن subcloned الجينات LifeAct-eGFP16 في ناقلات pCS2 +17 للتعبير من المروج CMV والمروج SP6. الجين المدرج يكمن المصب من المروج SP6 والمنبع من SV40 بولي (A) الذيل18. في الأجنة التي تم تحويلها إلى كهرباء مشتركة مع الحمض النووي الريبي والحمض النووي، تم الكشف لأول مرة عن الملوثات العضوية الثابتة المرمزة من الـ mRNAs في المختبر في غضون 20 دقيقة من الكهربة، في حين تم الكشف عن الـ FPs من ناقلات تعبير الحمض النووي فقط بعد 3 ح. ترميز mRNAs متعددة للنووي، غولجي، و يمكن أن تكون البروتينات الغشاء الكهربائي في الجنين في وقت واحد، مما أدى إلى التعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في الخلايا الفردية. وأخيرا، باستخدام انتعاش الفلورة في الجسم الحي بعد حقن الصور (FRAP) ، ونحن نظهر أن غالبية mRNAs الكهربائي الاضمحلال في غضون 2 ساعة. وهكذا، فإن إنتاج البروتين الأولي السريع جنبا إلى جنب مع ترجمة بروتين جديدة محدودة يجعل mRNA الكهربائي تقنية قيمة عندما يكون التحكم الزمني في التعبير ضروريا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

نبلغ أن الكهرباء mRNA يسمح البروتينات الفلورية لتسمية الخلايا في الأجنة السمان الحية بسرعة أكبر وعلى نطاق واسع من الكهرباء الحمض النووي. كفاءة الانف بنسبة عالية يسمح ما لا يقل عن 4 mRNAs متميزة لتكون مشتركة مع كفاءة ~ 87٪. وتتحلل معظم الMRNAs الكهربائي خلال أول 2 ساعة بعد الكهرباء، مما يسمح بإجراء تجارب حساسة للوقت في الجنين النامي. وأخيرا، نحن نصف كيفية صورة دينامية الأجنة الحية الكهربائي مع mRNAs التي ترميز مختلف البروتينات الفلورية المستهدفة دون الخلوية.

mRNA الكهربائي هو أكثر كفاءة من الكهرباء الحمض النووي
استخدمنا pCS2 +. H2B-السترين لإعداد في المختبر منقولة mRNA. وبما أن الإلكتروبورات الحمض النووي عادة ما يتم تنفيذها عند 1-2 ميكروغرام/ميكرولتر، استخدمنا تركيز ًا متساويًا من mRNA (محسوبً?...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

نحن نبلغ رسول RNA (mRNA) الكهربائي كوسيلة تسمح للتعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في نظام نموذج الجنين السمان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا الفلورية وتسجيل ها في الحركات الحية عن طريق المجهر الفاصل الزمني بعد وقت قصير من الكهربائي.

التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

يوفر الارنا الكهربائي التعبير السريع والفعال، والسيطرة المكانية والزمانية من البروتينات المتعددة داخل نظام نموذج الطيور. هذه الطريقة تسمح للتعبير عن بروتينات الفلورسنت بشكل أوسع وأسرع من وضع العلامات التي يحققها الكهربة القياسية للحمض النووي. Electroporation يسهل فتح عابرة من المسام في غشاء البلازما التي تعمل كقنوات لنقل الحمولات الوراثية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي في خلايا العديد من الكائنات الحية النموذجية.للتجارب الأولية العمل مع الأجنة التي هي أقدم من يوم واحد من العمر لأنها أكثر صلابة وأكثر مقاومة للتلاعب الخارجي مثل الكهربائي. في مرحلة النمو الجنيني المناسبة كسر بلطف وتصب محتويات بيضة السمان في طبق بيتري 10 سم. استخدام ماصة نقل لإزالة غالبية الألبومين سميكة.استخدم نسيج المختبر لمسح سطح النير برفق لإزالة الألبومين السميك المتبقي حول الجنين لضمان أن الجنين سيلتصق بإحكام بحلقة الورق. وضع ما قبل قص ورقة التصفية على الجنين واستخدام مقص لقطع بسلاسة حول محيط الجنين. استخدام ماصة باستور لطبقة PPS تحت الجنين باستخدام تيارات لطيف لإخلاء أي نير التمسك الأنسجة.سحب ببطء حلقة ورقة الجنين في زاوية مائلة صعودا و الخروج من نير. ضع الورق في طبق بيتري مليء بـ PBS لمزيد من التنظيف. بمجرد إزالة معظم النير ، ضع الجانب البطني للجنين في طبق بيتري من 35 ملليمتر مغطى بمزيج نصف أولي من أجار وألبومين.إعداد غرفة الكهربائي عن طريق ربط القطب الأسود ملء مع برنامج تلفزيوني ووضع الجنين في الداخل. استخدام الزجاج microcapillary لحقن bolus من 200 نانويترات من مرنا في تجويف بين epiblast والغشاء vitelline تغطي المنطقة المطلوبة. ثم استخدم القطب الأحمر لكهرباء الجنين.ضع الجنين الكهربائي مرة أخرى على خليط agar-albumen وحضن في درجة حرارة 38 درجة مئوية حتى مرحلة النمو المرغوب فيها. لتصوير البروتينات الفلورية المشفرة بالكهربية مراقبة جميع الأجنة الكهربائية تحت منظار تشريح الفلورسنت لتحديد أصح وأفضل الجنين الكهربائي لتجارب التصوير الديناميكية. الاستمرار في احتضان الأجنة الأخرى مطلية بالكهرباء والأجنة غير الكهربائية في حاضنة منفصلة.شطف لفترة وجيزة الجنين المختار مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي فقاعات التي قد تكونت على الجانب الظهري من الجنين أثناء الكهربة. ضع الجنين الذي تم تنظيفه مباشرة في طبق تصوير يحتوي على طبقة رقيقة من حوالي 150 ميكرولتر من الألبومين-أجار مع الحرص على عدم توليد أي فقاعات على السطح الظهري للجنين. أضف قطعة صغيرة رطبة ملفوفة من ورق الأنسجة على طول الحواف الداخلية لطبق التصوير.ختم الطبق مع فيلم البارافين للحد من التبخر أثناء التصوير والاحتضان. نقل الطبق بسرعة إلى مرحلة ما قبل الدفء من المجهر confocal واستخدام قناة brightfield لتحديد موقع الصبغة الملونة في الجنين. تعيين برنامج التصوير إلى الهدف المنشود، مرآة dichroic، وأطياف الانبعاثات، وتشغيل الليزر المناسبة.الحرص على أن الخلايا سوف تبقى في رؤية الصورة لكامل الفيلم. استخدم دقة تصوير عالية بما فيه الكفاية، وتأكد من أن ظروف التصوير لن تسبب السمية الضوئية. انقر على Live في برنامج التصوير وضبط طاقة الليزر إلى إعداد مناسب لكثافة الفلوريسكين اعتماداً على كل قوة ليزر مجهرية.ابدأ تصوير الجنين باستخدام قوة ليزر 1٪، ومكسب 800، مما يزيد من قوة الليزر ببطء بزيادات 1٪، حتى يتم رؤية وحدات البكسل المشبعة. عندما يتم ملاحظة وحدات البكسل المشبعة، تقل طاقة الليزر قليلاً حتى لا يمكن تصور أي بيكسلات مشبعة. صورة الجنين كل ثلاث إلى خمس دقائق للتحقق من هجرة الخلايا الفردية عبر نقاط زمنية مختلفة باستخدام خمس ميكرومتر Z-اكوام من المنطقة الكهربائية بأكملها مع بعض الغرفة الإضافية نحو الجزء السفلي من Z المكدس في حالة غرق الجنين في سرير agarose خلال جلسة التصوير.لمراقبة مدى سرعة الخلايا تتحرك تحقق من النقاط الزمنية القليلة الأولى من الفيلم الأول. إذا كانت الخلايا تتحرك بمعدل سريع، ففكر في توسيع التكبير/التصغير لمنطقة الصور أو تصوير منطقة مختلفة. عندما تم تصوير المنطقة الكاملة من الطلاء الكهربائي للجنين، صورة في منطقة غير مُنصفة لنفس الجنين لتحديد مستويات الفلورس التلقائي.لتحديد المدة التي يمكن أن ينتَوَّر فيها مرنا المُصاب بالعدوى إلى بروتينات فلورية بعد التأكد من الإكتِرْك للجينة ذات الأهمية على المجهر الاستريوي، ضع الجنين على مرحلة محمّدة مسبقًا من المجهر المقلوب واستخدم الليزر 405 نانومتر مع قوة ليزر 70٪ ، و100 تكرار ، وسرعة مسح من أربعة لphotobleach معظم الفلورسينسي الخلوي من الجين الكهربائي في مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية. الاستمرار في احتضان الأجنة على المسرح عند 36 درجة مئوية بعد تبييض الصور ، مع الحرص على الانتباه إلى الخلايا المنقسمة بنشاط داخل المنطقة ذات الضوئية التي عادة ما ينظر إليها فقط في الأجنة السليمة وبالتالي تشير إلى أن الكهرباء لم تضر الخلايا الجنينية. الحصول على ما بعد التبييض Z المكدس الصور من المنطقة الكهربائية لمدة زمنية المطلوب في فترات زمنية منتظمة من ثلاث إلى خمس دقائق.لضمان أن ظروف التصوير لا تؤثر بشكل ضار على بقاء الجنين في وقت واحد في حضن الأجنة ذات الطلاء الكهربائي غير المُحَمَّن ضوئيًا لتكون بمثابة عنصر تحكم في التصوير. لكميات نتائج photobleaching لخرض مرنا بعد electroporation استخدام ImageJ لقياس كثافة الفلوريسنس من دائرة 7.5 ميكرومتر في وسط المنطقة الكهربائية من كل خلية لتتبع الفلورية الخلية على مدى كل فترة زمنية من ثلاث إلى خمس دقائق. عندما تم قياس جميع الخلايا داخل المنطقة ذات البقعة الضوئية التي لا تخضع للتصلب الضوئي وتم تحسسها بالكامل ، قم برسم شدة الفلوريس مع مرور الوقت بعد التبييض في كل نقطة من النقاط الزمنية التي تم فيها تصوير الجنين ضوئيًا.على الرغم من أن ال DNA electroporation يؤدي إلى فلورا أكثر إشراقا في بعض الخلايا الكهربائية، وكفاءة كهربائي الحمض النووي هو أقل بشكل واضح بالمقارنة مع البروتينات الفلورية المشفرة مرنا أعرب على نطاق واسع. عند مقارنة الحمض النووي والميرنا المشترك الكهربائي داخل نفس الجنين، فإن الحمض النووي الذي يعبر عن كفاءة البروتين الفلورسنت هو أيضاً أقل كفاءة بشكل كبير وثابت من الحمض النووي الريبي (MRNA) الذي يعبر عن البروتين الفلوري. ويكشف القياس الكمي لجميع الأجنة التي يتم رسمها بـ MRNA أو الحمض النووي أو مزيج من الاثنين، أن مرنا عبر حوالي 75٪ من الخلايا في منطقة معينة، في حين أن الحمض النووي لا يُحول سوى حوالي 25٪ من الخلايا.وينبغي أن يؤدي الرنا عبر المصابين إلى إنتاج أسرع للبروتين مقارنة بالحمض النووي المتحول لأن الرنا يمكن التعرف عليه على الفور من قبل آلات الترجمة الخلوية. على الرغم من أن الإكتـارة المشتركـة للعديد من DNAs قد ثبت سابقًا أنها غير فعالة نسبيًا ، فقد أدى الإكتـر المـُـرَكَمـيـّة لأربعة من الـ mRNAs في هذه التجربة إلى كفاءة نقل 87٪ لجميع الـ mRNAs الأربعة في جميع المناطق ذات الطلاء الكهربائي. على الرغم من أن photobleaching يقلل في البداية من شدة الفلوريس في الخلايا المضاءة من قبل حوالي 95٪ تبقى بعض الخلايا التي تسترد قدرتها على تقسيم والتعبير عن البروتينات الفلورية بعد وقت قصير من الكهربائي.هذا قدرة ينخفض على خمسة ساعات بعد electroporation مهما. خذ وقتك في تحسين أفضل ظروف التصوير والاستمرار في العبث حتى بعد بدء الفيلم يجري على استعداد لإجراء أي تعديلات إذا لزم الأمر.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

التعبير عن البروتينات الفلورية في<em&gt; السهيم</em&gt; من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

إإكسبلنتس الشبكية كاملة من الدجاج الأجنة لعلاج Electroporation للوالكيميائية الكاشف

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

في أوفو الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

المراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...