Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Vi takker David Huss for nyttige indblik i dette arbejde. Dette arbejde blev delvist støttet af Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) og USC Provosts undergrad Research Fellowship til M.T., Saban Research Institute Intramural Training pre-doktor Award til M.D., og University of Southern California bachelor forskning Associates program Award til R.L.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med godkendte retningslinjer fra children's Hospital Los Angeles og University of Southern California institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg.
1. generation, pCS2-baserede, udtryk vektorer
<ol><li>
At klone pCS2. Lifeact-eGFP, Forbered vektor rygraden ved at fordøje 2 μg pCS2. CycB1-GFP (en konstruktion, der indeholder et andet skær) med BamHI (10 U) og BsrGI (10 U) i passende fordøjelses buffer (se tabel over materialer) fortynde...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

I denne protokol, vi gav trin for trin instruktioner om, hvordan man præcist mikroinjicere og elektroporat mRNA i cellerne i gastrulerende vagtler embryoner. Vi påviste, at in vitro syntetiseret mRNA elektroporation giver hurtig og effektiv ekspression af fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulerende vagtler embryoner (figur 2 og 3). Fluorescens fra H2B-Citrine protein oversat fra elektro porteret mRNAs kunne påvises ved Konfokal mikroskopi inden for ~ 20 min og steg i F...

Elektro poration er en fysisk transfektering metode, der bruger en elektrisk puls til at skabe forbigående porer i plasma membranen, så stoffer som nukleinsyre eller kemikalier til at passere ind i cytosol. Elektro poration anvendes i vid udstrækning til at levere DNA til bakterier, gær, planter og pattedyrsceller1,2,3. Det bruges rutinemæssigt til at introducere genetiske nyttelast i målceller og væv inden for det udviklende aviær embryo for at studere den genetiske kontrol med udvikling eller mærke migrerende populationer af celler4,5,6, 7. Der findes dog også flere eksperimentelle begrænsninger med DNA-elektroporation8. For eksempel introducerer DNA-elektro portering ofte meget varierende antal udtryks vektorer pr. celle og efterfølgende mRNAs og proteiner, som de koder. Denne variation kan føre til en betydelig celle celle heterogenitet, der komplicerer både billedanalyse og data tolkning9,10. Desuden, proteiner fra DNA-elektroporation kun begynde at udtrykke ~ 3 h post-elektro poration og ikke når den maksimale effektivitet i celle nummer og fluorescens intensitet indtil 12 h, sandsynligvis på grund af den tid, der kræves for at overføre til kernen og komplet både transskription og oversættelse in vivo11.
I modsætning hertil har mRNA transfektering været anvendt effektivt i en række forskellige modelsystemer, herunder xenopus laevis oocytter ved mikroinjektion12,13, omprogrammering af humane stamceller ved mRNA lipofectamintransfection14 og elektroporerende genstridige neurale stamceller i voksne mus15. Vi testede mRNA electroporations evne til effektivt at mærke celler under tidlig aviær embryonal udvikling ved hjælp af in vitro syntetiserede Mrna'er, der indkoder distinkte fluorescerende proteiner (FPs). Til vores studier brugte vi pCS2 + Vector, en multifunktions ekspressions vektor, der almindeligvis anvendes til at udtrykke proteiner i xenopus og Zebra embryoner. SP6-og T7 RNA-polymerasepromotorerne i pCS2 + tillader syntesen af mRNA og protein fra ethvert klonet gen, når det anvendes i et in vitro-transskription/oversættelsessystem.
Her viser vi, at mRNA elektroporation giver mulighed for hurtig og effektiv ekspression af fluorescerende proteiner (fps) i gastrulerende vagtler embryoner. Vi designede og genererede mange af de udtryks vektorer, der anvendes i disse studier. For eksempel under klappede vi LifeAct-eGFP gene16 i pCS2 + Vector17 for at udtrykke fra CMV promoter og SP6 Promoter. Det indsatte gen ligger nedstrøms for SP6-promotoren og opstrøms for SV40 poly (A) hale18. I embryoner Co-elektroporeret med mRNA og DNA, FPs kodet fra in vitro transkriberet mRNAs blev først detekteret inden for 20 min af elektro poration, hvorimod FPs fra DNA-udtryks vektorer blev detekteret først efter 3 h. multiple mRNAs kodning for nuklear, Golgi, og membran proteiner kan elektroporeres ind i et embryon samtidigt, hvilket resulterer i hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i individuelle celler. Endelig, ved hjælp af en in vivo fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) assay, viser vi, at et flertal af de elektro porterede mRNAs forfald inden for 2 h. Således, hurtig indledende protein produktion kombineret med begrænset ny protein oversættelse gør mRNA elektro poration en værdifuld teknik, når tidsmæssig kontrol af udtryk er nødvendig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

Vi rapporterer, at mRNA elektroporation tillader fluorescerende proteiner til at mærke celler i levende vagtler embryoner hurtigere og bredt end DNA-elektroporation. Den høje transfektering effektivitet tillader mindst 4 særskilte mRNAs at blive Co-transfected med ~ 87% effektivitet. De fleste af de elektro porterede mRNAs nedbrydes i løbet af de første 2 h post-elektro poration, hvilket tillader tidsfølsomme eksperimenter, der skal udføres i det udviklende embryon. Endelig beskriver vi, hvordan man dynamisk billede levende embryoner elektroporeret med mRNAs at indkode forskellige subcellulære målrettede fluorescerende proteiner.

mRNA elektroporation er mere effektiv end DNA-elektroporation
Vi brugte pCS2 +. H2B-Citrine til at forberede in vitro transkriberet mRNA. Da DNA-elektroporation sædvanligvis udføres ved 1-2 μg/μL, brugte vi en equimolær koncentration af mRNA (beregnet til at være omkring 0,25-0,5 μg/μL for H2B-citrin) til mRNA-elektroporation. Vi testede først elektroporations effektiviteten af pCS2 +. H2B-Citrine DNA s...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Vi rapporterer Messenger RNA (mRNA) elektroporation som en metode, der tillader hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i vagtler embryo modelsystemet. Denne metode kan anvendes til fluorescently label celler og registrere deres in vivo bevægelser ved time-lapse mikroskopi kort efter elektroporation.

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNA-elektroporation giver et hurtigt, effektivt og rumligt og tidsmæssigt kontrolleret udtryk for flere proteiner i aviær modelsystemet. Denne metode giver mulighed for et mere bredt og hurtigt udtryk for fluorescerende proteiner end den mærkning, der opnås ved standard DNA-elektroporation. Elektroporation letter den forbigående åbning af porer i plasmamembranen, der tjener som kanaler til overførsel af genetiske nyttelast som RNA og DNA i cellerne i mange modelorganismer.For de første eksperimenter arbejde med embryoner, der er ældre end en dag gammel, da de er hårdere og mere modstandsdygtige over for eksterne manipulationer som elektroporation. På passende embryonale udviklingsmæssige fase forsigtigt bryde og hæld vagtel æg indhold i en 10 centimeter petriskål. Brug en overførselspipette til at fjerne størstedelen af det tykke album.Brug et laboratorievæv til forsigtigt at tørre overfladen af åget for at fjerne de resterende tykke albumen omkring fosteret for at sikre, at fosteret vil holde sig tæt til papirringen. Læg forskæring filterpapir over fosteret og bruge saks til jævnt skære omkring omkredsen af fosteret. Brug en Pasteur pipette til lag PPS under embryon ved hjælp af blide vandløb til at forlade ethvert åg stikning til vævet.Træk langsomt fosterpapirringen i en skrå vinkel op og ud af åget. Placer papiret i en petriskål fyldt med PBS til yderligere rengøring. Når det meste af åget er blevet fjernet, skal du placere fosterets ventrale side op i en 35 millimeter petriskål dækket med en halvsolide blanding af agar og albumen.Forbered elektroporationskammeret ved at forbinde den sorte elektrode fylde det med PBS og placere fosteret inde. Brug en glasmikrokapillær til at injicere en bolus på 200 nanoliters mRNA i hulrummet mellem epiblast og vitellinemembranen, der dækker det ønskede område. Og derefter bruge den røde elektrode til elektroporate fosteret.Placer det elektroporerede embryo tilbage på agar-albumen blandingen og inkubere ved 38 grader Celsius indtil den ønskede udviklingsfase. Til billeddannelse af elektroporationskodede lysstofrør observere alle de elektroporerede embryoner under en fluorescerende dissekere stereoscope at vælge de sundeste og bedste elektroporerede embryo for dynamisk billeddannelse eksperimenter. Fortsætte med at inkubere de andre elektroplerede embryoner og ikke-elektroperede embryoner i en separat rugemaskine.Skyl kort det valgte foster med PBS for at fjerne eventuelle bobler, der kan have dannet på fosterets dorsale side under elektroporationen. Placer det rensede embryon direkte i en billedbehandlingsskål, der indeholder et tyndt lag på ca. 150 mikroliter albumen-agar, og pas på ikke at generere bobler på fosterets dorsale overflade. Tilføj en lille fugtig rullet op stykke silkepapir langs de indvendige kanter af billedbehandling fad.Forsegl skålen med paraffinfilm for at minimere fordampning under billeddannelse og inkubation. Flyt skålen hurtigt til den forvarmede fase af et konfokal mikroskop og bruge brightfield kanal til at finde den farvede farvestof i fosteret. Indstil billedbehandlingssoftwaren til det ønskede mål, det dicriske spejl og emissionsspektre, og tænd en passende laser.Pas på, at cellerne forbliver i billedvisionen for hele filmen. Brug en tilstrækkelig høj billedopløsning, og sørg for, at billedforholdene ikke forårsager fototoksicitet. Klik på Live i billedbehandlingssoftwaren, og juster lasereffekten til en indstilling, der passer til fluorescensintensiteten, afhængigt af hver mikroskoplasereffekt.Begynd at billedrende fosteret ved hjælp af 1%laserkraft og en 800 gevinst, hvilket øger lasereffekten langsomt med 1 %, indtil mættede pixel ses. Når mættede pixel observeres, skal lasereffekten reduceres en smule, indtil der ikke kan visualiseres mættede pixel. Image embryon hver tre til fem minutter for at kontrollere migration af de enkelte celler på tværs af forskellige tidspunkter ved hjælp af fem mikrometer Z-stakke af hele elektroplated område med nogle ekstra plads mod bunden af Z-stack, hvis fosteret synker ind i agarose sengen under billedbehandling session.At observere, hvor hurtigt cellerne bevæger sig kontrollere de første par tidspunkter i den første film. Hvis cellerne bevæger sig hurtigt, kan du overveje at udvide zoomen i det afbildede område eller billeddannelse et andet område. Når hele embryonets elektroplerede område er afbildet, afbildes billedet i det samme embryons ikke-elektrolerede område for at bestemme autofluorescensniveauet.For at bestemme, hvor længe transficeret mRNA kan oversættes til fluorescerende proteiner efter bekræftelse af elektroporation af genet af interesse på stereomikroskopet, anse embryonet på et forvarmet trin i det omvendte konfokale mikroskop og bruge 405 nanometerlaseren med en 70% lasereffekt, 100 gentagelser og en scanningshastighed på fire for at fotoblere det meste af det cellulære fluorescens fra det elektroperede gen på en række forskellige tidspunkter. Fortsæt med at inkubere embryonerne på scenen ved 36 grader Celsius efter fotoblegning, idet du skal være opmærksom på de aktivt at opdele celler i den fotobleached region, der typisk kun ses i sunde embryoner og dermed indikerer, at elektroporationen ikke skadede de embryonale celler. Erhverve post-blegemiddel Z-stack billeder af den elektroplerede region for en ønsket længde af tid med regelmæssige tre til fem minutters tidsintervaller.For at sikre, at billeddannelsesbetingelserne ikke skadelig påvirker embryoets overlevelse samtidig inkuber elektroperede embryoner, der ikke fotobleachs, der kan fungere som kontrol for billeddannelsen. For at kvantificere fotobleaching resultaterne for mRNA henfald efter elektroporation bruge ImageJ til at måle fluorescens intensiteten af en 7,5 mikrometer cirkel i midten af det elektroplerede område af hver celle til at spore cellen fluorescens over hver tre til fem minutters interval. Når alle celler i det fotobleachede område, der ikke gennemgår mitose og er blevet fuldstændig fotobleached er blevet målt, plot fluorescens intensitet over tid efter blegemiddel på hvert af de tidspunkter fosteret blev fotobleached.Selvom DNA-elektroporation fører til en lysere fluorescens i nogle elektroperede celler, er effektiviteten af DNA-elektroporation synligt lavere sammenlignet med de bredt udtrykte mRNA-kodede fluorescerende proteiner. Når man sammenligner DNA og mRNA co-elektroporation inden for samme embryo, dna'et udtrykker fluorescerende protein effektivitet er også betydeligt og konsekvent mindre effektiv end den mRNA udtrykke fluorescerende protein. Kvantificering af alle embryoner, der er elektropleret med kun mRNA, DNA eller en kombination af de to, viser, at mRNA-transfects omkring 75% af cellerne i en given region, mens DNA kun transfects omkring 25% af cellerne.Den transfekterede mRNA bør føre til en hurtigere proteinproduktion sammenlignet med transficeret DNA, da mRNA straks kan genkendes ved hjælp af cyklisk oversættelsesmaskiner. Selv om co-electroporation af flere DNAs tidligere har vist sig at være relativt ineffektiv, resulterede co-electroporation af fire mRNA'er i dette eksperiment i en 87% transfektionseffektivitet for alle fire mRNA'er inden for alle de elektroplerede områder. Selv om fotobleaching i første omgang reducerer fluorescens intensitet i de fotobleached celler med omkring 95% nogle celler tilbage, at genvinde deres evne til at opdele og udtrykke fluorescerende proteiner kort efter elektroporation.Denne evne falder over fem timer efter elektroporation dog. Tag dig tid til at optimere de bedste billeddannelsesforhold og fortsætte med at pille, selv efter at filmen er klar til at foretage justeringer, hvis det er nødvendigt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Ekspression af fluorescerende proteiner i<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Af mRNA Injektion i befrugtede oocytter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hele Retinale Eksplantater fra kylling Embryoner til Elektroporation og kemisk reagens Behandlinger

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Lysfremkaldt GFP-udtryk i zebrafiskembryoner ved hjælp af det optogenetiske TAEL/C120-system

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

I Ovo Intravaskulær injektion i kyllingembryoner

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af normal og afvigende cytosinmethylering i intakte zebrafiskembryoner

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...