Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

We danken David Huss voor het nuttige inzicht in dit werk. Dit werk werd deels gesteund door de Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) en de undergrad Research Fellowship van USC Provost aan M.T., het Saban Research Institute Intramural training pre-Doctoral Award aan M.D., en de Universiteit van Southern California Undergraduate Research Associates programma Award aan R.L.

Alle dier procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van het Children's Hospital Los Angeles en de comités voor institutionele Dierenzorg en-gebruik van de Universiteit van Zuid-Californië.
1. generatie pCS2-gebaseerde expressie vectoren
<ol><li>
Om pCS2. Lifeact-eGFP te klonen, bereidt u de vector ruggengraat voor door 2 μg pCS2. CycB1-GFP (een constructie met een ander wisselplaat) te verteren met BamHI (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

In dit protocol hebben we stap voor stap instructies gegeven voor het nauwkeurig microinjecteren en elektroporeren van mRNA in de cellen van gastrulerende kwartel embryo's. We hebben aangetoond dat in vitro gesynthetiseerde mRNA-elektroporation een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (FPs) in gastrulerende kwartel embryo's (Figuur 2 en 3) mogelijk maakt. Fluorescentie van H2B-Citrien eiwit vertaald uit elektroporated Mrna's kan worden gedetecteerd doo...

Elektroporation is een fysieke transfectie methode die een elektrische puls gebruikt om voorbijgaande poriën in het plasma membraan te creëren, waardoor stoffen zoals nucleïnezuren of chemicaliën in de cytosol kunnen overgaan. Elektroporation wordt veel gebruikt om DNA te leveren in bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen1,2,3. Het wordt routinematig gebruikt om genetische ladingen in doelcellen en weefsels in te voeren binnen het ontwikkelende aviaire embryo om de genetische controle van de ontwikkeling of de migratie populaties van cellen4,5,6te bestuderen, 7. Er bestaan echter ook verschillende experimentele beperkingen met DNA-elektroporation8. DNA-elektroporation introduceert bijvoorbeeld vaak zeer variabele aantallen expressie vectoren per cel en vervolgens de Mrna's en eiwitten die ze coderen. Deze variabiliteit kan leiden tot een aanzienlijke celcellige heterogeniteit die zowel beeldanalyse als gegevens interpretatie van9,10compliceert. Bovendien beginnen eiwitten van DNA-elektroporation slechts ~ 3 h post-elektroporation en bereiken ze niet de maximale efficiëntie in het aantal cellen en de intensiteit van de fluorescentie tot 12 uur, waarschijnlijk als gevolg van de tijd die nodig is om over te brengen in de Nucleus en volledige zowel transcriptie als vertaling in vivo11.
MRNA transfectie is daarentegen effectief gebruikt in een verscheidenheid van modelsystemen, waaronder Xenopus laevis oocyten door Microinjection12,13, herprogrammatie menselijke stamcellen door mRNA lipofectamine transfectie14 , en elektroporerende recalcitrante neurale stamcellen bij volwassen muizen15. We testten het vermogen van mRNA electroporatie om cellen efficiënt te labelen tijdens de vroege aviaire embryonale ontwikkeling met behulp van in vitro gesynthetiseerde mrna's die verschillende fluorescerende eiwitten (fps) coderen. Voor onze studies gebruikten we de pCS2 + vector, een multifunctionele expressie vector die vaak wordt gebruikt voor het uitdrukken van eiwitten in Xenopus en zebravis embryo's. De SP6 en T7-RNA-polymerase bevorderaar in de pCS2 + staan de synthese toe van mRNA en eiwitten uit elk gekloond gen bij gebruik in een in vitro transcriptie/vertaalsysteem.
Hier tonen we aan dat mRNA electroporatie een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (fps) in gastrulerende kwartel embryo's mogelijk maakt. We ontwierpen en genereerden veel van de expressie vectoren die in deze studies werden gebruikt. Zo hebben we de LifeAct-eGFP Gene16 in de pCS2 + Vector17 gesubgekloond om uit te drukken van de promotor en de SP6 Promoter van CMV. Het ingebrachte gen ligt stroomafwaarts van de SP6 promoter en stroomopwaarts van de SV40 poly (A) tail18. In embryo's co-elektroporated met mRNA en DNA, FPs gecodeerd uit in vitro getranscribeerd Mrna's werden voor het eerst gedetecteerd binnen 20 min van electroporation, terwijl FPs van DNA-expressie vectoren werden gedetecteerd pas na 3 h. meervoudige mRNAs-codering voor nucleaire, Golgi en membraan proteïnen kunnen gelijktijdig in een embryo worden geëvacueerd, wat resulteert in een snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in individuele cellen. Ten slotte, met behulp van een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) Assay, tonen we aan dat een meerderheid van de electroporated mRNAs verval binnen 2 h. Dus, snelle initiële eiwitproductie in combinatie met een beperkte nieuwe eiwit vertaling maakt mRNA elektroporation een waardevolle techniek wanneer temporele beheersing van de uitdrukking noodzakelijk is.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

We melden dat mRNA-elektroporation fluorescerende eiwitten toelaat om cellen in levende kwartel embryo's sneller en in het algemeen te labelen dan DNA-elektroporation. De hoge transfectie-efficiëntie maakt het mogelijk om ten minste 4 verschillende Mrna's te co-transport met ~ 87% efficiëntie. De meeste van de elektroporated Mrna's worden afgebroken tijdens de eerste 2 h post-elektroporation, waardoor tijdgevoelige experimenten kunnen worden uitgevoerd in het zich ontwikkelende embryo. Ten slotte beschrijven we hoe u dynamische beelden van levende embryo's elektroporated met Mrna's die verschillende subcellulaire gerichte fluorescerende eiwitten coderen.

mRNA-elektroporation is efficiënter dan DNA-elektroporation
We gebruikten pCS2 +. H2B-Citrien ter voorbereiding van de in vitro getranscribeerd mRNA. Aangezien DNA-elektroporatie gewoonlijk wordt uitgevoerd bij 1-2 μg/μL, gebruikten we een equimolaire concentratie van mRNA (berekend als ongeveer 0,25-0,5 μg/μL voor H2B-Citrien) voor mRNA-elektroporation. We testten eerst de elektroporation efficiency van pC...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNA-elektroporatie zorgt voor een snelle, efficiënte en ruimtelijk en tijdelijk gecontroleerde expressie van meerdere eiwitten binnen het vogelmodelsysteem. Deze methode zorgt voor een bredere en snellere expressie van fluorescerende eiwitten dan de etikettering bereikt door standaard DNA-elektroporatie. Elektroporatie vergemakkelijkt de tijdelijke opening van poriën in het plasmamembraan die dienen als leidingen voor de overdracht van genetische ladingen zoals RNA en DNA in de cellen van talrijke modelorganismen.Voor de eerste experimenten werken met embryo's die ouder zijn dan een dag oud, omdat ze sterker en beter bestand zijn tegen externe manipulaties zoals elektroporatie. In het juiste embryonale ontwikkelingsstadium breek en giet de kwarteleiinhoud in een 10 centimeter Petrischaal. Gebruik een transferpipet om het grootste deel van het dikke album te verwijderen.Gebruik een laboratoriumweefsel om het oppervlak van het juk voorzichtig af te vegen om het resterende dikke albumen rond het embryo te verwijderen om ervoor te zorgen dat het embryo stevig aan de papieren ring blijft plakken. Leg voorgesneden filterpapier over het embryo en gebruik een schaar om soepel rond de omtrek van het embryo te snijden. Gebruik een Pasteur pipet om PPS laag onder het embryo met behulp van zachte stromen om een juk vasthouden aan het weefsel te verlaten.Trek langzaam de embryopapierring onder een schuine hoek omhoog en af van het juk. Plaats het papier in een petrischaal gevuld met PBS voor verdere reiniging. Zodra het grootste deel van het juk is verwijderd, plaats de embryo ventrale kant omhoog in een 35 millimeter Petri schotel bedekt met een halfsolid mengsel van agar en albumen.Bereid de elektroporatiekamer voor door de zwarte elektrode aan te sluiten die deze vult met PBS en het embryo erin plaatst. Gebruik een glazen microcapillair om een bolus van 200 nanoliters mRNA in de holte tussen het epiblast en vitelline membraan te injecteren dat het gewenste gebied bedekt. En gebruik dan de rode elektrode om het embryo te elektroreren.Plaats het geëlektreerde embryo terug op het agar-albumen mengsel en incubaal op 38 graden Celsius tot de gewenste ontwikkelingsfase. Voor beeldvorming van de elektroporatie-gecodeerde fluorescerende eiwitten observeren alle geëlektrooeerde embryo's onder een fluorescerende ontleden stereoscoop om de gezondste en beste elektrogepoed embryo voor de dynamische imaging experimenten te selecteren. Blijf de andere geëlektrificeerde embryo's en niet-geëlektrificeerde embryo's in een aparte couveuse uitbroeden.Spoel het geselecteerde embryo kort af met PBS om eventuele bellen te verwijderen die zich tijdens de elektroporatie aan de rugzijde van het embryo kunnen hebben gevormd. Plaats het gereinigde embryo direct in een beeldvormingsschotel met een dunne laag van ongeveer 150 microliter albumen-agar die ervoor zorgt dat er geen bellen op het dorsale oppervlak van het embryo worden gegenereerd. Voeg een klein vochtig opgerold stuk tissuepapier langs de binnenranden van de beeldvorming schotel.Verzegel de schotel met paraffinefolie om verdamping tijdens de beeldvorming en incubatie te minimaliseren. Verplaats de schotel snel naar de voorverwarmde fase van een confocale microscoop en gebruik het brightfield kanaal om de gekleurde kleurstof in het embryo te lokaliseren. Stel de beeldsoftware op het gewenste doel, dichroic spiegel, en emissie spectra, en zet een geschikte laser.Zorg ervoor dat de cellen blijven in het beeld visie voor het geheel van de film. Gebruik een hoog genoeg beeldresolutie en zorg ervoor dat de beeldvormingscondities geen fototoxiciteit veroorzaken. Klik op Live in de beeldsoftware en pas de laserkracht aan op een instelling die geschikt is voor de fluorescentieintensiteit, afhankelijk van elke laserkracht van de microscoop.Begin met het imaging van het embryo met behulp van 1%laservermogen en een 800-winst, waardoor de laserkracht langzaam met 1% wordt verhoogd totdat verzadigde pixels worden gezien. Wanneer verzadigde pixels worden waargenomen, neemt het laservermogen iets af totdat er geen verzadigde pixels kunnen worden gevisualiseerd. Beeld het embryo om de drie tot vijf minuten om de migratie van individuele cellen over verschillende tijdspunten te controleren met behulp van vijf micrometer Z-stacks van het gehele geëlektrificeerde gebied met wat extra ruimte naar de onderkant van de Z-stack in het geval het embryo tijdens de beeldvormingssessie in het agarosebed zinkt.Om te zien hoe snel de cellen bewegen controleer de eerste paar keerpunten van de eerste film. Als de cellen snel bewegen, u overwegen de zoom van het afgebeelde gebied uit te breiden of een andere regio te beelden. Wanneer het hele geëlektrificeerde gebied van het embryo is afgebeeld, beeld in niet-geëlektrroplateerd gebied van hetzelfde embryo om de autofluorescentie niveaus te bepalen.Om te bepalen hoe lang doorfected mRNA kan worden vertaald in fluorescerende eiwitten na bevestiging van elektroporatie van het gen van belang op de stereomicroscoop, plaats het embryo op een voorverwarmd stadium van de omgekeerde confocale microscoop en gebruik de 405 nanometer laser met een 70%laservermogen, 100 iteraties, en een scansnelheid van vier om het grootste deel van de cellulaire fluorescentie van het geëlektrificeerde gen op verschillende tijdstippen te fotobleach. Blijf de embryo's op het podium uitbroeden bij 36 graden Celsius na fotobleken, waarbij u aandacht besteedt aan de actief delende cellen binnen het gefotobleekte gebied dat doorgaans alleen in gezonde embryo's wordt gezien en dus erop wijst dat de elektroporatie de embryonale cellen niet schaadde. Verkrijg post-bleekste Z-stack beelden van het geëlektrificeerde gebied voor een gewenste tijdsduur bij regelmatige tijdsintervallen van drie tot vijf minuten.Om ervoor te zorgen dat de beeldvormingscondities de overleving van het embryo niet schadelijk beïnvloeden, worden gelijktijdig geëlektrificeerde embryo's geïncedeerd die niet worden gefotobleekt om te dienen als controle voor de beeldvorming. Om de fotobleaching resultaten voor het mRNA verval post-elektroporatie te kwantificeren gebruik ImageJ om de fluorescentie intensiteit van een 7,5 micrometer cirkel in het midden van het geëlektroopte gebied van elke cel te meten om de cel fluorescentie te volgen over elk interval van drie tot vijf minuten. Wanneer alle cellen binnen het gefotobleekte gebied dat geen mitose ondergaan en volledig gefotobleached zijn gemeten, plot de fluorescentie intensiteit na verloop van tijd post-bleekmiddel op elk van de tijd punten van het embryo werd fotobleached.Hoewel DNA-elektroporatie leidt tot een helderdere fluorescentie in sommige geëlektrificeerde cellen, is de efficiëntie van DNA-elektroporatie zichtbaar lager in vergelijking met de breed uitgedrukte mRNA-gecodeerde fluorescerende eiwitten. Bij het vergelijken van DNA en mRNA co-elektroporatie binnen hetzelfde embryo, is het DNA dat fluorescerende eiwitefficiëntie uitdrukt ook aanzienlijk en consequent minder efficiënt dan dat van het mRNA dat fluorescerend eiwit uitdrukt. Kwantificering van alle embryo's geëlektroplateerd met alleen mRNA, DNA of een combinatie van de twee, blijkt dat mRNA transfects ongeveer 75% van de cellen in een bepaald gebied, terwijl DNA slechts transfects ongeveer 25% van de cellen.Het transfected mRNA moet leiden tot een snellere eiwitproductie in vergelijking met transfected DNA, omdat het mRNA onmiddellijk kan worden herkend door cytosolische vertaalmachines. Hoewel de co-elektroporatie van meerdere NC's eerder relatief inefficiënt bleek te zijn, resulteerde de co-elektroporatie van vier mRNAs in dit experiment in een transfectie-efficiëntie van 87% van alle vier de mRNAs binnen alle geëlektrificeerde gebieden. Hoewel fotobleaching in eerste instantie vermindert de fluorescentie intensiteit in de gefotobleached cellen met ongeveer 95%sommige cellen blijven die hun vermogen om te verdelen en uit te drukken fluorescerende eiwitten kort na elektroporatie te herstellen.Deze capaciteit vermindert meer dan vijf uren post-elektroporatie nochtans. Neem de tijd het optimaliseren van de beste beeldvorming voorwaarden en blijven sleutelen, zelfs na het starten van de film klaar om eventuele aanpassingen te maken indien nodig.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expressie van fluorescerende eiwitten in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Lichtgeïnduceerde GFP-expressie in zebravisembryo's met behulp van het optogenetische TAEL/C120-systeem

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...