Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Wir danken David Huss für die hilfreichen Einblicke in diese Arbeit. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) und das USC Provost es Undergrad Research Fellowship an M.T., das Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award an M.D. und die University of Southern California Undergraduate Research Associates Program Award an R.L.

Alle tierischen Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien des Children es Hospital Los Angeles und des Institutional Animal Care and Use Committees der University of Southern California durchgeführt.
1. Generierung pCS2-basierter Expressionsvektoren
<ol><li>
Um pCS2.Lifeact-eGFP zu klonen, bereiten Sie das Vektor-Backbone vor, indem Sie 2 g pCS2.CycB1-GFP (ein Konstrukt, das einen anderen Einsatz enthält) mit BamHI (10 U) und BsrGI (10 U) in einem geeigne...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

In diesem Protokoll haben wir Schritt für Schritt Anleitungen gegeben, wie man mRNA präzise in die Zellen von gastrulating quail embryos injizieren und elektroporate. Wir haben gezeigt, dass in vitro synthetisierte mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht (Abbildung 2 und 3). Fluoreszenz aus H2B-Citrin-Protein, das aus elektroporated mRNAs übersetzt wurde, konnte durch konfokale ...

Elektroporation ist ein physikalisches Transfektionsverfahren, das einen elektrischen Impuls verwendet, um transiente Poren in der Plasmamembran zu erzeugen, wodurch Substanzen wie Nukleinsäuren oder Chemikalien in das Zytosol gelangen können. Elektroporation ist weit verbreitet, um DNA in Bakterien, Hefe, Pflanzen und Säugetierzellen zu liefern1,2,3. Es wird routinemäßig verwendet, um genetische Nutzlasten in Zielzellen und Gewebe innerhalb des sich entwickelnden Aviären Embryos einzuführen, um die genetische Kontrolle der Entwicklung zu untersuchen oder wandernde Populationen der Zellen4,5,6, 7. Allerdings gibt es auch bei der DNA-Elektroporation8mehrere experimentelle Einschränkungen. Zum Beispiel führt die DNA-Elektroporation oft eine sehr variable Anzahl von Expressionsvektoren pro Zelle und anschließend die von ihnen kodierenden mRNAs und Proteine ein. Diese Variabilität kann zu einer erheblichen Zell-Zell-Heterogenität führen, die sowohl die Bildanalyse als auch die Dateninterpretation9,10erschwert. Darüber hinaus beginnen Proteine aus der DNA-Elektroporation erst nach der Elektroporation 3 h auszudrücken und erreichen erst 12 h die maximale Effizienz der Zellzahl und Fluoreszenzintensität, wahrscheinlich aufgrund der Zeit, die für die Übertragung in den Kern und die vollständige Transkription und Übersetzung in vivo11.
Im Gegensatz dazu wurde die mRNA-Transfektion effektiv in einer Vielzahl von Modellsystemen eingesetzt, einschließlich Xenopus laevis Oozyten durch Mikroinjektion12,13, Umprogrammierung menschlicher Stammzellen durch mRNA Lipofectamin-Transfektion14 , und elektroporating widerspenstigen neuronalen Stammzellen bei erwachsenen Mäusen15. Wir testeten die Fähigkeit der mRNA-Elektroporation, Zellen während der frühen aviären embryonalen Entwicklung effizient zu kennzeichnen, indem wir in vitro synthetisierte mRNAs verwenden, die verschiedene fluoreszierende Proteine (FPs) kodieren. Für unsere Studien verwendeten wir den pCS2+-Vektor, einen Mehrzweckexpressionsvektor, der häufig zum Extieren von Proteinen in Xenopus- und Zebrafischembryonen verwendet wird. Die SP6- und T7-RNA-Polymerase-Promotoren im pCS2+ ermöglichen die Synthese von mRNA und Protein aus jedem geklonten Gen, wenn sie in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem verwendet werden.
Hier zeigen wir, dass die mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht. Wir haben viele der in diesen Studien verwendeten Expressionsvektoren entwickelt und generiert. Zum Beispiel haben wir das LifeAct-eGFP-Gen16 in den pCS2+ Vektor17 subkloniert, um es vom CMV-Promotor und SP6-Promoter auszudrücken. Das eingefügte Gen liegt flussabwärts des SP6-Promotors und vor dem SV40-Poly(A)-Schwanz18. Bei Embryonen, die mit mRNA und DNA kopodiert wurden, wurden FPs, die aus in vitro transkribierten mRNAs kodiert wurden, erstmals innerhalb von 20 min elektroporation nachgewiesen, während FPs aus DNA-Expressionsvektoren erst nach 3 h nachgewiesen wurden. Membranproteine können gleichzeitig zu einem Embryo elektropoiert werden, was zu einer schnellen und effizienten Expression mehrerer Proteine in einzelnen Zellen führt. Schließlich zeigen wir mit einer In-vivo-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleicharbeiten (FRAP) Assay, dass ein Großteil der elektroporated mRNAs innerhalb von 2 h zerfällt. So macht eine schnelle anfängliche Proteinproduktion in Kombination mit einer begrenzten neuen Proteintranslation die mRNA-Elektroporation zu einer wertvollen Technik, wenn eine zeitliche Kontrolle der Expression notwendig ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

Wir berichten, dass die mRNA-Elektroporation fluoreszierende Proteine ermöglicht, Zellen in lebenden Wachtelembryonen schneller und breiter zu kennzeichnen als DNA-Elektroporation. Die hohe Transfektionseffizienz ermöglicht es, mindestens 4 verschiedene mRNAs mit einer Effizienz von 87 % zu transfizieren. Die meisten elektroporated mRNAs werden während der ersten 2 h Nachelektroporation abgebaut, so dass zeitempfindliche Experimente am sich entwickelnden Embryo durchgeführt werden können. Schließlich beschreiben wir, wie man lebende Embryonen dynamisch mit mRNAs elektropoliert, die verschiedene subzelluläre zielgerichtete fluoreszierende Proteine kodieren.

mRNA-Elektroporation ist effizienter als DNA-Elektroporation
Wir haben pCS2+ verwendet. H2B-Citrin zur Herstellung von in vitro transkribierter mRNA. Da die DNA-Elektroporation in der Regel bei 1-2 g/l durchgeführt wird, verwendeten wir eine äquimolare Konzentration von mRNA (berechnet auf etwa 0,25-0,5 g/l für H2B-Citrine) für die mRNA-Elektroporation. Wir haben zuerst die Elektroporationseffizienz von pCS2...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Wir berichten von der Botal-RNA-Elektroporation (mRNA) als methode, die eine schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine im Wachtel-Embryo-Modellsystem ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen fluoreszierend zu kennzeichnen und ihre In-vivo-Bewegungen durch Zeitraffermikroskopie kurz nach der Elektroporation aufzuzeichnen.

Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

die mRNA-Elektroporation ermöglicht eine schnelle, effiziente und räumlich und zeitlich gesteuerte Expression mehrerer Proteine innerhalb des Aviären Modellsystems. Diese Methode ermöglicht eine breitere und schnellere Expression fluoreszierender Proteine als die Durch standard-DNA-Elektroporation erreichte Kennzeichnung. Elektroporation erleichtert die transiente Öffnung von Poren in der Plasmamembran, die als Leitungen für die Übertragung von genetischen Nutzlasten wie RNA und DNA in die Zellen zahlreicher Modellorganismen dienen.Für die ersten Experimente arbeiten mit Embryonen, die älter als einen Tag alt sind, da sie härter und resistenter gegen externe Manipulationen wie Elektroporation sind. Im entsprechenden embryonalen Entwicklungsstadium vorsichtig brechen und den Wachteleiinhalt in eine 10 Zentimeter lange Petrischale gießen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Großteil des dicken Albumens zu entfernen.Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Oberfläche des Jochs sanft abzuwischen, um das verbleibende dicke Album um den Embryo zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Embryo fest am Papierring klebt. Legen Sie vorgeschnittenes Filterpapier über den Embryo und verwenden Sie eine Schere, um den Umfang des Embryos sanft zu schneiden. Verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um PPS unter dem Embryo mit sanften Strömen zu schichten, um jedes Joch zu räumen, das am Gewebe klebt.Ziehen Sie den Embryo-Papierring langsam in einem schrägen Winkel nach oben und außerhalb des Jochs. Legen Sie das Papier zur weiteren Reinigung in eine mit PBS gefüllte Petrischale. Sobald der größte Teil des Jochs entfernt wurde, legen Sie die embryoventrale Seite in eine 35 Millimeter Petrischale, die mit einer halbfesten Mischung aus Agar und Albumen bedeckt ist.Bereiten Sie die Elektroporationskammer vor, indem Sie die schwarze Elektrode mit PBS füllen und den Embryo darin platzieren. Verwenden Sie eine Glasmikrokapillare, um einen Bolus von 200 Nanoliterm mRNA in den Hohlraum zwischen Dem Epiblast und der Vitelline-Membran zu injizieren, die die gewünschte Region abdeckt. Und dann verwenden Sie die rote Elektrode, um den Embryo zu elektroporate.Den elektropolierten Embryo wieder auf die Agar-Albumen-Mischung legen und bei 38 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium brüten. Zur Abbildung der elektroporationscodierten fluoreszierenden Proteine beobachten Sie alle elektroporated Embryonen unter einem fluoreszierenden Sezierendereoskop, um den gesündesten und besten elektroporated Embryo für die dynamischen bildgebenden Experimente auszuwählen. Die anderen galvanisierte n.A. und nicht-galvanisierte Embryonen in einem separaten Inkubator weiter inkubieren.Spülen Sie den ausgewählten Embryo kurz mit PBS ab, um Alle Blasen zu entfernen, die sich während der Elektroporation auf der Rückenseite des Embryos gebildet haben könnten. Legen Sie den gereinigten Embryo direkt in eine bildgebende Schale, die eine dünne Schicht von etwa 150 Mikrolitern Albumen-Agar enthält und darauf achtet, keine Blasen auf der dorsalen Oberfläche des Embryos zu erzeugen. Fügen Sie ein kleines feuchtes aufgerolltes Stück Tissuepapier entlang der Innenkanten der bildgebenden Schale hinzu.Versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie, um die Verdunstung während der Bildgebung und Inkubation zu minimieren. Bewegen Sie die Schale schnell in das vorgewärmte Stadium eines konfokalen Mikroskops und verwenden Sie den Hellfeldkanal, um den farbigen Farbstoff im Embryo zu lokalisieren. Stellen Sie die Bildverarbeitungssoftware auf das gewünschte Objektiv, den dichroitischen Spiegel und die Emissionsspektren ein, und schalten Sie einen geeigneten Laser ein.Achten Sie darauf, dass die Zellen während des gesamten Films in der Bildsicht bleiben. Verwenden Sie eine ausreichend hohe bildgebende Auflösung, und stellen Sie sicher, dass die bildgebenden Bedingungen keine Phototoxizität verursachen. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Live und passen Sie die Laserleistung an eine Einstellung an, die je nach Mikroskoplaserleistung für die Fluoreszenzintensität geeignet ist.Beginnen Sie mit der Bildgebung des Embryos mit 1%Laserleistung und einer 800-Verstärkung, wodurch die Laserleistung langsam um 1% erhöht wird, bis gesättigte Pixel zu sehen sind. Wenn gesättigte Pixel beobachtet werden, verringern Sie die Laserleistung leicht, bis keine gesättigten Pixel visualisiert werden können. Stellen Sie den Embryo alle drei bis fünf Minuten vor, um die Migration einzelner Zellen über verschiedene Zeitpunkte mit fünf Mikrometer-Z-Stacks des gesamten galvanischen Bereichs mit etwas zusätzlichem Platz zum Boden des Z-Stacks zu überprüfen, falls der Embryo während der Bildgebungssitzung in das Agarosebett sinkt.Um zu beobachten, wie schnell sich die Zellen bewegen, überprüfen Sie die ersten Zeitpunkte des ersten Films. Wenn sich die Zellen schnell bewegen, sollten Sie den Zoom des abgebildeten Bereichs erweitern oder einen anderen Bereich bebildern. Wenn der gesamte galvanisierte Bereich des Embryos abgebildet wurde, Bild in nicht elektropneurierten Bereich des gleichen Embryos, um die Autofluoreszenzspiegel zu bestimmen.Um zu bestimmen, wie lange transfizierte mRNA nach Bestätigung der Elektroporation des Gens auf dem Stereomikroskop in fluoreszierende Proteine übersetzt werden kann, platzieren Sie den Embryo auf einer vorgeheizten Stufe des invertierten konfokalen Mikroskops und verwenden Sie den 405-Nanometer-Laser mit einer Laserleistung von 70 %, 100 Iterationen und einer Scangeschwindigkeit von vier, um den größten Teil der zellulären Fluoreszenz aus dem galvanischen Gen an einer Vielzahl von Zeitpunkten zu photobleichen. Bebrütet die Embryonen nach dem Photobleichen bei 36 Grad Celsius weiter und befällt darauf, dass die aktiv teilenden Zellen innerhalb des photolleichten Bereichs, die typischerweise nur bei gesunden Embryonen zu sehen sind, darauf achten, dass die Elektroporation den embryonalen Zellen nicht geschadet hat. Erfassen Sie postbleichen Z-Stack-Bilder des galvanischen Bereichs für eine gewünschte Zeitdauer in regelmäßigen Zeitintervallen von drei bis fünf Minuten.Um sicherzustellen, dass die bildgebenden Bedingungen das Überleben des Embryos nicht schädlich beeinträchtigen, brütet gleichzeitig galvanisierte Embryonen, die nicht photobleached sind, um als Kontrolle für die Bildgebung zu dienen. Um die Photobleichergebnisse für den mRNA-Zerfall nach der Elektroporation zu quantifizieren, verwenden Sie ImageJ, um die Fluoreszenzintensität eines 7,5-Mikrometer-Kreises in der Mitte des galvanischen Bereichs jeder Zelle zu messen, um die Zellfluoreszenz über jedes Drei- bis Fünf-Minuten-Intervall zu verfolgen. Wenn alle Zellen innerhalb der photogebleichten Region, die sich keiner Mitose unterziehen und vollständig photobleached sind, gemessen wurden, zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit nach der Bleiche zu jedem der Zeitpunkte, an denen der Embryo photobleached wurde.Obwohl die DNA-Elektroporation in einigen galvanivernierten Zellen zu einer helleren Fluoreszenz führt, ist die Effizienz der DNA-Elektroporation im Vergleich zu den weit exprimierten mRNA-kodierten fluoreszierenden Proteinen sichtbar geringer. Beim Vergleich von DNA und mRNA-Ko-Elektroporation innerhalb desselben Embryos ist die DNA-Expression fluoreszierender Proteineffizienz ebenfalls signifikant und konsistent weniger effizient als die der mRNA, die fluoreszierendes Protein exezieren. Die Quantifizierung aller Embryonen, die nur mit mRNA, DNA oder einer Kombination aus beiden galvanisierte, zeigt, dass mRNA etwa 75 % der Zellen in einer bestimmten Region transfekt, während die DNA nur etwa 25 % der Zellen transfekt.Die transfizierte mRNA sollte zu einer schnelleren Proteinproduktion im Vergleich zu transfizierter DNA führen, da die mRNA sofort von zytosolischen Translationsmaschinen erkannt werden kann. Obwohl sich die Ko-Elektroporation mehrerer DNAs bisher als relativ ineffizient erwiesen hat, führte die Ko-Elektroporation von vier mRNAs in diesem Experiment zu einer Transfektionseffizienz von 87 % aller vier mRNAs in allen galvanierten Regionen. Obwohl photobleaching zunächst die Fluoreszenzintensität in den photobleached Zellen um etwa 95% reduziert, bleiben einige Zellen übrig, die ihre Fähigkeit, fluoreszierende Proteine kurz nach der Elektroporation zu teilen und auszudrücken, wiederherstellen.Diese Fähigkeit nimmt jedoch über fünf Stunden nach der Elektroporation ab. Nehmen Sie sich Zeit, die besten Bildgebungsbedingungen zu optimieren und basteln Sie weiter, auch nachdem der Film bei Bedarf bereit ist, Anpassungen vorzunehmen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression von fluoreszierenden Proteinen in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Lichtinduzierte GFP-Expression in Zebrafischembryonen mit dem optogenetischen TAEL/C120-System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravaskuläre Injektion in Hühnerembryonen

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...