Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
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この作品に役立つ洞察をデビッド・ハスに感謝します。この研究は、ローズヒルズ財団サマーリサーチフェローシップ(2016-2018)とUSCプロボストのM.T.、サバン研究所内壁画研修前博士賞、および大学の一部で支援されました。南カリフォルニア学部研究員プログラム賞

すべての動物の手順は、小児病院ロサンゼルスと南カリフォルニア大学機関動物ケアおよび使用委員会からの承認されたガイドラインに従って行われました。
1. 生成 pCS2 ベースの式ベクトル
<ol><li>
pCS2.Lifeact-eGFPをクローンするには、適切な消化バッファー(材料の表を参照)でBamHI(10U)とBsrGI(10 U)を用いてpCS2.CycB1-GFP(異なるインサートを含む構造体)の2μgを消化してベ...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. 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C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

このプロトコルでは、ウズラ胚をガストレーションする細胞にmRNAを正確にマイクロインジェクトして電気ポレートする方法について段階的に説明しました。インビトロ合成mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証した(図2および3)。電気起電mRNAから翻訳さ...

エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用されています。これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 7.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一性につながる可能性があります。さらに、DNAエレクトロポレーションからのタンパク質は、エレクトロポレーション後3時間しか発現し始め、12時間まで細胞数と蛍光強度の最大効率に達せず、核への転移に要する時間が原因で完了する可能性が高い。生体内11の転写と翻訳の両方.
対照的に、mRNAトランスフェクションは、マイクロインジェクション12、13によるキセノプス・レービス卵母細胞、mRNAリポフェクタミントランスフェクション14によるヒト幹細胞の再プログラミングを含む様々なモデルシステムで効果的に使用されている。、成体マウス15における再石灰性神経幹細胞を電気的にする。我々は、異なる蛍光タンパク質(GP)をコードするインビトロ合成mRNAを用いて、初期の鳥類胚発生時に細胞を効率的に標識するmRNAエレクトロポレーションの能力を試験した。我々の研究では、キセノプスおよびゼブラフィッシュ胚のタンパク質を発現するために一般的に使用される多目的発現ベクターであるpCS2+ベクターを用いて使用した。pCS2+におけるSP6およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、インビトロ転写/翻訳システムで使用した場合、任意のクローン遺伝子からのmRNAおよびタンパク質の合成を可能にします。
ここでは、mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証する。我々は、これらの研究で使用される発現ベクターの多くを設計し、生成した。例えば、LifeAct-eGFP遺伝子16をpCS2+ベクター17にサブクローニングし、CMVプロモーターおよびSP6プロモーターから発現した。挿入された遺伝子は、SP6プロモーターの下流にあり、SV40ポリ(A)テール18の上流にある。mRNAとDNAと共にエレクトロポレートされた胚では、インビトロ転写されたmRNAからコードされた胎児は、最初にエレクトロポレーションの20分以内に検出されたが、DNA発現ベクターからのGPは、核、ゴルジ、および核をコードする複数のmRNAの3時間後にのみ検出された。膜タンパク質は同時に胚にエレクトロポレートされ、個々の細胞内の複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現をもたらす。最後に、光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収を用いて、電ポレートされたmRNAの大部分が2時間以内に崩壊することを示す。したがって、限られた新しいタンパク質翻訳と組み合わせた高速初期タンパク質産生は、発現の時間的制御が必要な場合にmRNAエレクトロポレーションを貴重な技術にする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

我々は、mRNAエレクトロポレーションにより、生きているウズラ胚の細胞にDNAエレクトロポレーションよりも迅速かつ広範に標識する蛍光タンパク質を可能にすることを報告する。高いトランスフェクション効率は、少なくとも4つの異なるmRNAを~87%の効率で共生することを可能にします。電化mRNAのほとんどは、最初の2時間のエレクトロポレーションの間に分解され、発達中の胚で時間に敏感な実験を行うことを可能にする。最後に、様々な細胞内標的蛍光タンパク質をコードするmRNAでエレクトロポレートされた生きた胚を動的に画像化する方法について述べた。

mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的
私たちはpCS2+を使用しました。H2B-シトリンは、mRNAをインビトロで調製する。DNAエレクトロポレーションは通常1-2 μg/μLで行われるため、mRNAエレクトロポレーションにはmRNAの等化濃度(H2B-シトリンの場合は約0.25-0.5 μg/μL)を用いました。ま?...

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Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNAエレクトロポレーションは、鳥類モデルシステム内の複数のタンパク質の迅速、効率的、および空間的および時間的に制御された発現を提供します。この方法は標準的なDNAエレクトロポレーションによって達成される標識より蛍光タンパク質のより広く、速い表現を可能にする。エレクトロポレーションは、RNAやDNAなどの遺伝的ペイロードを多数のモデル生物の細胞に移管するための導管として機能する原形質膜中の細孔の一過性の開口部を促進する。最初の実験では、エレクトロポレーションのような外部操作に対してより硬く、より耐性があるため、1日齢の胚で動作します。適切な胚発生段階で、ウズラの卵の内容物を穏やかに分解し、10センチメートルのペトリ皿に注ぎます。転送ピペットを使用して、厚いアルブミンの大部分を取り除きます。ラボ組織を使用してヨークの表面を静かに拭き取り、胚の周りの残りの厚いおとびんを取り除き、胚が紙のリングにしっかりとくっつくことを確認します。プレカット濾紙を胚の上に置き、はさみを使って胚の周囲を滑らかに切断する。パスツールピペットを使用して、穏やかな流れを使用して胚の下にPPSを重ね、組織に付着するヨークを空にします。卵子の斜めの角度でゆっくりと胚紙リングを引っ張ります。さらにクリーニングするためにPBSで満たされたペトリ皿に紙を置きます。ヨークの大部分を取り除いたら、胚腹側を寒天と卵形の半固体混合物で覆われた35ミリメートルのペトリ皿に上に置きます。黒い電極をPBSで満たし、胚を内部に置いて、エレクトロポレーションチャンバーを準備します。ガラスマイクロキャピラリーを使用して、所望の領域を覆うエピブラストとビテリン膜の間の空洞に200ナノリットルのmRNAのボーラスを注入します。そして、赤い電極を使用して胚を電気ポレートします。電気ポレートされた胚を寒天アルブミン混合物の上に戻し、所望の発達段階まで摂氏38度でインキュベートする。エレクトロポレーションコード化された蛍光タンパク質のイメージングのために、蛍光解剖ステレオスコープの下ですべての電気ポレート胚を観察し、動的イメージング実験のための最も健康的で最良のエレクトロポレート胚を選択します。他の電気メッキ胚と非電気メッキ胚を別のインキュベーターにインキュベートし続ける。選択した胚をPBSで簡単にすすいで、エレクトロポレーション中に胚の後側に形成された可能性のある気泡を除去する。洗浄された胚を、胚の後部表面に気泡を発生しないように注意して、約150マイクロリットルのアルブミン寒天の薄い層を含むイメージング皿に直接入れます。イメージング皿の内側の端に沿ってティッシュペーパーを巻き上げた小さな湿った部分を追加します。画像化およびインキュベーション中の蒸発を最小限に抑えるために、パラフィンフィルムで皿を密封します。皿を共焦点顕微鏡の前温められた段階に素早く動かし、明視野チャネルを使用して胚の色染料を見つける。イメージングソフトウェアを目的の目的、二色性ミラー、発光スペクトルに設定し、適切なレーザーをオンにします。細胞は、映画全体の画像ビジョンに残ることを注意してください。十分な高いイメージング解像度を使用し、画像処理条件が光毒性を引き起こさないことを確認してください。イメージングソフトウェアでLiveをクリックし、各顕微鏡レーザーパワーに応じて蛍光強度に適した設定にレーザーパワーを調整します。1%レーザーパワーと800ゲインを使用して胚のイメージングを開始し、飽和ピクセルが見えるまでレーザーパワーを1%ずつゆっくりと増加させます。飽和ピクセルが観測されると、飽和ピクセルが可視化されなくなるまでレーザーパワーをわずかに低下させます。イメージングセッション中に胚がアガロースベッドに沈んだ場合に備えて、3~5分ごとに胚を画像化し、エレクトロメッキ領域全体の5マイクロメートルZスタックを使用して、Zスタックの底に向かって余分なスペースを持つ個々の細胞の移動をチェックします。セルの移動速度を観察するには、最初のムービーの最初の数ポイントを確認します。セルが高速で移動している場合は、画像領域のズームを拡大するか、別の領域をイメージングすることを検討してください。胚の電気メッキ領域全体が画像化された場合、同じ胚の無電気メッキ領域における画像は、自己蛍光レベルを決定する。ステレオ顕微鏡上で目的の遺伝子のエレクトロポレーションを確認した後、トランスフェクトされたmRNAを蛍光タンパク質に翻訳できる期間を決定するには、胚を反転共焦点顕微鏡の予熱段階に置き、70%レーザーパワー、100回の反復、および4つのスキャン速度を使用して、エレクトロプレートから蛍光を4回使用します。写真の漂白後に36°Cでステージ上の胚をインキュベートし続け、健康な胚でのみ一般的に見られる光漂白領域内の積極的に分裂する細胞に注意を払い、したがってエレクトロポレーションが胚細胞に害を与えなかったことを示す。電気メッキ領域のポスト漂白剤Zスタック画像を、通常の3〜5分の時間間隔で所望の時間の長さで取得します。イメージング条件が、画像化のためのコントロールとして機能するようにフォトブリーチされていない電気メッキ胚を同時にインキュベートする胚生存に有害な影響を与えないことを保証する。mRNA崩壊後エレクトロポレーションの光漂白結果を定量化するには、ImageJを使用して、各セルのエレクトロメッキ領域の中心にある7.5マイクロメートル円の蛍光強度を測定し、3~5分間の間隔で細胞蛍光を追跡します。有糸分裂を受けておらず、完全に光漂白された光漂白領域内の全ての細胞が測定された場合、胚をフォトブリーチした各時点で経時の漂白後の蛍光強度をプロットする。DNAエレクトロポレーションは一部の電気メッキ細胞において蛍光を明るくするが、広く発現しているmRNAコード化された蛍光タンパク質に比べてDNAエレクトロポレーションの効率は目に見えて低い。同じ胚内のDNAとmRNAの共エレクトロポレーションを比較すると、蛍光タンパク質効率を発現するDNAも、蛍光タンパク質を発現するmRNAのそれと比べて効率が著しく一貫して低い。mRNA、DNA、または2つの組み合わせだけで電気メッキされたすべての胚の定量化は、mRNAが所定の領域の細胞の約75%をトランスフェクトし、DNAは細胞の約25%しかトランスフェクトしならないことを明らかにします。トランスフェクトされたmRNAは、細胞質翻訳機によってmRNAをすぐに認識できるため、トランスフェクトされたDNAに比べてタンパク質産生が速くなるはずです。複数のDNAの共エレクトロポレーションは比較的非効率的であることが以前に示されていましたが、この実験で4つのmRNAのコエレクトロポレーションを行うと、すべての電気メッキ領域内の4つのmRNAすべてについて87%のトランスフェクション効率が得られた。光漂白は、最初は約95%の細胞によって光漂白細胞の蛍光強度を減少させるが、エレクトロポレーションの直後に蛍光タンパク質を分裂し、発現する能力を回復する細胞の一部が残っている。しかし、この能力はエレクトロポレーション後5時間にわたって低下します。最適なイメージング条件を最適化し、必要に応じて調整する準備ができて映画を開始した後も、いじり続けてください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

蛍光タンパク質の発現において<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt;未受精卵へのmRNA注入による

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

無傷ゼブラフィッシュ胚における正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリング

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...