Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Vi takker David Huss for nyttig innsikt i dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet delvis av Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) og USC Provost ' s undergrad Research Fellowship til M.T., den Saban Research Institute intramural Training pre-doktor Award til MD, og University of Southern California Undergraduate Research Associates program prisen til R.L.

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med godkjente retningslinjer fra Children ' s Hospital Los Angeles og University of Southern California institusjonelle Animal Care og bruk komiteer.
1. generasjon pCS2-basert uttrykk vektorer
<ol><li>
Å klone pCS2. Lifeact-eGFP, forberede vektoren ryggraden ved å fordøye 2 μg av pCS2. CycB1-GFP (en konstruksjon som inneholder en annen innsats) med BamHI (10 U) og BsrGI (10 U) i riktig fordøyelsen buffer (se tabell over materialer) forty...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

I denne protokollen, ga vi steg for steg instruksjoner om hvordan du presist microinject og electroporate mRNA inn i cellene i gastrulating vaktel embryo. Vi viste at in vitro syntetisert mRNA electroporation gir rask og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryo (figur 2 og 3). Fluorescens fra H2B-Citrin protein oversatt fra electroporated mRNAs kan oppdages av konfokalmikroskopi mikroskopi innen ~ 20 min og økt i FP-fluorescens i time...

Electroporation er en fysisk transfeksjoner metode som bruker en elektrisk puls for å skape forbigående porer i plasma membranen, slik at stoffer som nukleinsyre syrer eller kjemikalier går over i stoffer. Electroporation er mye brukt til å levere DNA til bakterier, gjær, planter og pattedyrceller1,2,3. Det er rutinemessig brukt til å innføre genetisk nyttelast i målceller og vev innenfor utviklingsland fugle embryo å studere genetisk kontroll av utvikling eller etikett migrere bestander av celler4,5,6, 7i. Imidlertid finnes det også flere eksperimentelle begrensninger med DNA-electroporation8. For eksempel, DNA electroporation ofte introduserer svært variable antall uttrykk vektorer per celle og deretter mRNAs og proteiner de kodes. Denne variasjonen kan føre til betydelig celle celle heterogenitet som kompliserer både bildeanalyse og data tolkning9,10. I tillegg proteiner fra DNA electroporation bare begynne å uttrykke ~ 3 h post-electroporation og ikke nå maksimal effektivitet i celle tall og fluorescens intensitet til 12 h, sannsynligvis på grunn av den tiden som kreves for å overføre til kjernen og fullføre både transkripsjon og oversettelse in vivo11.
I kontrast har mRNA transfeksjoner blitt effektivt brukt i en rekke modellsystemer, inkludert Xenopus laevis oocytter av microinjection12,13, omprogrammering humane stamceller ved mRNA lipofectamine transfeksjoner14 , og electroporating gjenstridige nevrale stamceller i voksne mus15. Vi testet evnen til mRNA electroporation å effektivt merke celler under tidlig avian embryoutvikling med in vitro syntetisert mRNAs som koder distinkte fluorescerende proteiner (FPs). For våre studier, vi brukte pCS2 + vektor, en Multipurpose uttrykk vektor som vanligvis brukes for å uttrykke proteiner i Xenopus og sebrafisk embryo. Den SP6 og T7 RNA polymerase arrangører i pCS2 + tillater syntese av mRNA og protein fra alle klonet genet når det brukes i en in vitro transkripsjon/Translation system.
Her viser vi at mRNA electroporation gir rask og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryo. Vi har designet og generert mange av uttrykket vektorer som brukes i disse studiene. For eksempel subcloned vi LifeAct-eGFP genet16 i pCS2 + Vector17 å uttrykke fra CMV promoter og SP6 promoter. Den innsatte genet ligger nedstrøms av SP6 promoter og oppstrøms av SV40 Poly (A) hale18. I embryo co-electroporated med mRNA og DNA, ble FPs kodet fra in vitro kopieres mRNAs først oppdaget innen 20 min av electroporation, mens FPs fra DNA uttrykk vektorer ble oppdaget først etter 3 h. flere mRNAs-koding for kjernekraft, Golgi og membran proteiner kan electroporated inn i et embryo samtidig, noe som resulterer i rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i individuelle celler. Til slutt, ved hjelp av en in vivo fluorescens Recovery etter photobleaching (FRAP) analysen, viser vi at et flertall av electroporated mRNAs forfall innen 2 t. Dermed vil den raske, første protein produksjonen kombinert med begrenset ny protein oversettelse gjøre mRNA electroporation til en verdifull teknikk når det er nødvendig med timelig kontroll av uttrykket.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

Vi rapporterer at mRNA electroporation tillater fluorescerende proteiner å merke celler i levende vaktel embryo raskere og grovt enn DNA-electroporation. Den høye transfeksjoner effektivitet tillater minst 4 distinkte mRNAs å være co-transfekterte med ~ 87% effektivitet. De fleste av electroporated mRNAs er degradert i løpet av de første 2 h post-electroporation, tillater tidsfølsomme eksperimenter som skal utføres i utviklingsland embryo. Til slutt beskriver vi hvordan du dynamisk bilde Live embryo electroporated med mRNAs som koder ulike subcellulære målrettede fluorescerende proteiner.

mRNA electroporation er mer effektiv enn DNA-electroporation
Vi brukte pCS2 +. H2B-Citrin for å klargjøre in vitro mRNA. Siden DNA-electroporation vanligvis utføres ved 1-2 μg/μL, brukte vi en ekvimolare konsentrasjon av mRNA (beregnet til å være rundt 0,25-0,5 μg/μL for H2B-Citrin) for mRNA electroporation. Vi først testet electroporation effektiviteten av pCS2 +. H2B-Citrin DNA sammenlignet med H2B-C...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Vi rapporterer Messenger RNA (mRNA)-electroporation som en metode som tillater rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i modell systemet vaktel embryo. Denne metoden kan brukes å fluorescensmerkete avmerke celler og fortegnelse deres inne vivo bevegelser av tid-lapse mikroskopi kort etter electroporation.

Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNA elektroporasjon gir et raskt, effektivt og romlig og tidsmessig kontrollert uttrykk for flere proteiner i avian modellsystemet. Denne metoden gir et bredere og raskt uttrykk for fluorescerende proteiner enn merkingen oppnådd ved standard DNA-elektroporasjon. Elektroporasjon letter forbigående åpning av porer i plasmamembranen som tjener som kanaler for overføring av genetiske nyttelaster som RNA og DNA inn i cellene til mange modellorganismer.For de første eksperimentene fungerer med embryoer som er eldre enn en dag gammel siden de er vanskeligere og mer motstandsdyktige mot eksterne manipulasjoner som elektroporasjon. På riktig embryonal utviklingsstadium bryter du forsiktig og hell vaktelegginnholdet i en 10 centimeter petriskål. Bruk en overføringspipette til å fjerne mesteparten av det tykke albumet.Bruk et laboratorievev til å forsiktig tørke overflaten av åket for å fjerne den gjenværende tykke albumen rundt embryoet for å sikre at embryoet vil holde seg tett til papirringen. Legg forhåndskuttet filterpapir over embryoet og bruk saks for å kutte jevnt rundt omkretsen av embryoet. Bruk en Pasteur pipette til å lag PPS under embryoet ved hjelp av milde bekker for å forlate ethvert åk som stikker til vevet.Trekk langsomt embryopapirringen i skrå vinkel opp og ut av åket. Legg papiret i en petriskål fylt med PBS for videre rengjøring. Når det meste av åket er fjernet, plasser embryoet ventral side opp i en 35 millimeter Petriskål dekket med en halvsolid blanding av agar og albumen.Forbered elektroporasjonskammeret ved å koble den svarte elektroden fylle den med PBS og plassere embryoet inni. Bruk et glassmikrokapillær til å injisere en bolus på 200 nanoliter mRNA i hulrommet mellom epiblast og vitellinmembran som dekker ønsket region. Og bruk deretter den røde elektroden til å elektroporate embryoet.Plasser det elektroporatede embryoet tilbake på agar-albumenblandingen og inkuber ved 38 grader Celsius til ønsket utviklingsstadium. For avbildning av elektroporasjonskodede fluorescerende proteiner observerer du alle de elektroporerte embryoene under et fluorescerende disseksjonsteroskoskop for å velge det sunneste og beste elektroporerte embryoet for de dynamiske bildeeksperimentene. Fortsett å inkubere de andre galvaniserte embryoene og ikke-galvaniserte embryoene i en egen inkubator.Skyll det valgte embryoet kort med PBS for å fjerne eventuelle bobler som kan ha dannet seg på dorsalsiden av embryoet under elektroporasjonen. Plasser det rengjorte embryoet direkte i en bilderett som inneholder et tynt lag på ca. 150 mikroliter albumen-agar, og ta vare på å ikke generere noen bobler på embryoets dorsale overflate. Tilsett et lite fuktig rullet opp stykke vevpapir langs innsiden av bilderetten.Forsegle parabolen med parafinfilm for å minimere fordampning under avbildning og inkubasjon. Flytt parabolen raskt til den forvarmede fasen av et konfokalt mikroskop og bruk brightfield-kanalen til å finne det fargede fargestoffet i embryoet. Sett bildeprogramvaren til ønsket objektiv, dichroic speil, og utslipp spectra, og slå på en passende laser.Vær forsiktig med at cellene vil forbli i bildevisjonen for hele filmen. Bruk en høy nok bildeoppløsning, og sørg for at bildeforholdene ikke vil forårsake fototoksisitet. Klikk Live i bildebehandlingsprogramvaren og juster laserkraften til en innstilling som passer for fluorescensintensiteten, avhengig av hver mikroskoplaserkraft.Begynn å forestille embryoet ved hjelp av 1% laserkraft og en 800 gevinst, øke laserkraften sakte med 1% trinn til mettede piksler er sett. Når mettede piksler observeres redusere laserkraften litt til ingen mettede piksler kan visualiseres. Bilde embryoet hvert tredje til fem minutt for å sjekke migrering av individuelle celler over forskjellige tidspunkter ved hjelp av fem mikrometer Z-stabler av hele galvanisert område med litt ekstra plass mot bunnen av Z-stabelen i tilfelle embryoet synker inn i agarose sengen under bildebehandling økten.For å observere hvor fort cellene beveger seg, sjekk de første tidspunktene i den første filmen. Hvis cellene beveger seg raskt, bør du vurdere å utvide zoomen til det avbildede området eller forestille seg et annet område. Når hele det galvaniserte området av embryoet er avbildet, bilde i uvalgt område av samme embryo for å bestemme autofluorescence nivåer.For å finne ut hvor lenge transfecteded mRNA kan oversettes til fluorescerende proteiner etter å ha bekreftet elektroporasjon av genet av interesse på stereomikroskopet, plasser embryoet på et forvarmet stadium av det inverterte konfokale mikroskopet og bruk 405 nanometerlaseren med en 70% laserkraft, 100 iterasjoner og en skannehastighet på fire for å fotobles det meste av cellulær fluorescens fra det galvaniserte genet på en rekke tidspunkter. Fortsett å inkubere embryoene på scenen ved 36 grader Celsius etter fotobleking, vær forsiktig med å ta hensyn til de aktivt delte cellene i den fotoblede regionen som vanligvis bare ses i sunne embryoer og dermed indikerer at elektroporasjonen ikke skadet de embryonale cellene. Få etterblekemiddel Z-stabel bilder av galvanisert regionen for en ønsket tidsperiode med regelmessige tre til fem minutters tidsintervaller.For å sikre at bildeforholdene ikke påvirker embryooverlevelsen samtidig inkubere elektroplatede embryoer som ikke er fotobleached for å tjene som en kontroll for avbildningen. For å kvantate fotobleaching resultatene for mRNA forfall etter elektroporasjon bruk ImageJ for å måle fluorescensintensiteten av en 7,5 mikrometer sirkel i midten av det galvaniserte området av hver celle for å spore cellefluorescens over hvert tre til fem minutters intervall. Når alle cellene i den fotobleached regionen som ikke gjennomgår mitose og har blitt fullstendig fotobleached har blitt målt, plott fluorescensintensiteten over tid etter blekemiddel på hvert av tidspunktene embryoet ble fotobleached.Selv om DNA-elektroporasjon fører til en lysere fluorescens i noen galvaniserte celler, er effektiviteten av DNA-elektroporasjon synlig lavere sammenlignet med de mye uttrykte mRNA-kodede fluorescerende proteinene. Ved sammenligning av DNA og mRNA-koelektroporasjon i samme embryo, er DNA som uttrykker fluorescerende proteineffektivitet også betydelig og konsekvent mindre effektiv enn mRNA som uttrykker fluorescerende protein. Kvantifisering av alle embryoene galvanisert med bare mRNA, DNA eller en kombinasjon av de to, avslører at mRNA transfects ca 75% av cellene i en gitt region, mens DNA bare transfects ca 25% av cellene.Den trans infiserte mRNA bør føre til en raskere proteinproduksjon sammenlignet med trans infisert DNA siden mRNA umiddelbart kan gjenkjennes av cytosoliske oversettelsesmaskiner. Selv om koelektroporasjonen av flere DNAer tidligere har vist seg å være relativt ineffektiv, resulterte koelektroporasjonen av fire mRNAer i dette eksperimentet i en 87% transfection effektivitet av alle fire av mRNAs innenfor alle de galvaniserte regionene. Selv om fotobleaching i utgangspunktet reduserer fluorescensintensiteten i de fotobleached cellene med ca 95% forblir noen celler som gjenoppretter deres evne til å dele og uttrykke fluorescerende proteiner kort tid etter elektroporasjon.Denne evnen reduseres imidlertid over fem timer etter elektroporasjon. Ta deg tid til å optimalisere de beste bildeforholdene og fortsett å tinker selv etter at filmen er klar til å gjøre eventuelle justeringer om nødvendig.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Uttrykk for Fluorescent Proteiner i<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Av mRNA Injeksjon i ubefruktet Oocytter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hele Retinal eksplantater fra kylling embryoer for Electroporation og kjemisk reagens behandlinger

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Lysindusert GFP-uttrykk i sebrafiskembryoer ved hjelp av Optogenetic TAEL/C120-systemet

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

I Ovo Intravaskulær injeksjon i kyllingembryoer

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Rask og effektiv spatiotemporal overvåking av normal og avvikende cytosinmetylering i intakte sebrafiskembryoer

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...