Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Agradecemos a David Huss por insights úteis sobre este trabalho. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de pesquisa de Verão de Rose Hills Foundation (2016-2018) e bolsista de pesquisa de graduação da USC Provost para a MT, o prêmio de pré-doutorado de treinamento intramural da Saban Research Institute para M.D., e a Universidade de Prêmio do programa de iniciação científica do Sul da Califórnia à R.L.

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas do Children ' s Hospital los Angeles e da Universidade do Sul da Califórnia institucional cuidados com animais e comitês de uso.
1. geração de vetores de expressão baseada em pCS2
<ol><li>
Para clonar pCS2. Lifeact-eGFP, prepare a espinha dorsal do vetor digerindo 2 μg de pCS2. CycB1-GFP (um constructo contendo uma pastilha diferente) com BamHI (10 U) e BsrGI (10 U) em tampão de digestão ade...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. 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C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

Neste protocolo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre como precisamente microinjetar e electroporate mRNA nas células de embriões de codorniz gastrulating. Demonstramos que a eletroporação de mRNA sintetizada in vitro permite expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulantes de codorniz (Figura 2 e 3). A fluorescência da proteína H2B-citrina traduzida de mRNAs em podia ser detectada pela microscopia confocal dentro d...

O electroporation é um método físico do transfection que use um pulso elétrico para criar pores transientes na membrana de plasma, permitindo que as substâncias como ácidos nucleicos ou produtos químicos passem no cytosol. O electroporation é amplamente utilizado para entregar o ADN nas bactérias, no fermento, nas plantas, e nas pilhas mamíferos1,2,3. É rotineiramente usado para introduzir cargas genéticas em células-alvo e tecidos dentro do embrião aviário em desenvolvimento para estudar o controle genético do desenvolvimento ou rotular populações migratórias de células4,5,6, o 7. Entretanto, várias limitações experimentais também existem com a eletroporação do DNA8. Por exemplo, o electroporation do ADN introduz frequentemente números altamente variáveis de vetores da expressão por a pilha e subseqüentemente o mRNAs e as proteínas que codificam. Essa variabilidade pode levar a uma considerável heterogeneidade celular que complica tanto a análise de imagem quanto a interpretação dos dados9,10. Adicionalmente, as proteínas do Electroporation do ADN começam somente expressar ~ 3 h borne-Electroporation e não alcangam a eficiência máxima no número de pilha e na intensidade da fluorescência até 12 h, provável devido ao tempo exigido para transferir no núcleo e terminar transcrição e tradução in vivo11.
Em contraste, o transfection de mRNA foi usado eficazmente em uma variedade de sistemas modelo, incluindo oócitos de Xenopus laevis pelo microinjection12,13, reprogramando pilhas de haste humanas pelo transfection 14 do Lipofectamine do mRNA , e electroporating pilhas de haste neural recalcitrantes em ratos adultos15. Nós testamos a habilidade do Electroporation do mRNA para etiquetar eficientemente pilhas durante o desenvolvimento embrionário aviário adiantado usando in vitro os mRNAs sintetizados que codificam proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nossos estudos, utilizamos o vetor pCS2 +, um vetor de expressão multiuso que é comumente usado para expressar proteínas em embriões de Xenopus e zebrafish. Os promotores da polimerase do RNA SP6 e T7 no pCS2 + permitem a síntese de mRNA e proteína de qualquer gene clonado quando utilizado em um sistema de transcrição/tradução in vitro.
Aqui, Nós demonstramos que o electroporation de mRNA permite a expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulating da codorniz. Nós projetamos e gerou muitos dos vetores de expressão utilizados nesses estudos. Por exemplo, subclonamos o gene LifeAct-eGFP16 para o pCS2 + vector17 para expressar do promotor CMV e promotor SP6. O gene introduzido encontra-se a jusante do promotor SP6 e a montante da cauda de SV40 Poly (A)18. Nos embriões co-electroporated com mRNA e ADN, os FPs codificados de mRNAs transcritos in vitro foram detectados primeiramente dentro de 20 minutos do Electroporation, visto que os FPs dos vetores da expressão do ADN foram detectados somente após 3 h. codificação múltipla de mRNAs para nuclear, Golgi, e as proteínas da membrana podem ser em em um embrião simultaneamente, tendo por resultado a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas em pilhas individuais. Finalmente, usando uma recuperação in vivo da fluorescência após o ensaio do photobranqueamento (Frap), nós mostramos que uma maioria da deterioração em dos mRNAs dentro de 2 h. Assim, a produção inicial rápida da proteína combinada com a tradução nova limitada da proteína faz a Electroporation do mRNA uma técnica valiosa quando o controle temporal da expressão é necessário.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

Nós relatamos que o electroporation de mRNA permite proteínas fluorescentes etiquetar pilhas em embriões de codorniz vivos mais rapidamente e amplamente do que o electroporation do ADN. A eficiência elevada do transfection permite pelo menos 4 mRNAs distintos ser co-transfected com eficiência do ~ 87%. A maioria dos mRNAs em é degradada durante os primeiros 2 h borne-Electroporation, permitindo que os experimentos tempo-sensíveis sejam realizados no embrião tornando-se. Finalmente, nós descrevemos como dinamicamente imagem embriões vivos em com os mRNAs que codificam várias proteínas fluorescentes alvejadas subcellular.

o electroporation do mRNA é mais eficiente do que o electroporation do ADN
Nós usamos pCS2 +. H2B-Citrine para preparar in vitro transcrito mRNA. Como a eletroporação de DNA geralmente é realizada em 1-2 μg/μL, utilizou-se uma concentração equimolar de mRNA (calculada para ser em torno de 0,25-0,5 μg/μL para H2B-citrino) para eletroporação de mRNA. Nós testamos primeiramente a eficiência do Electr...

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Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A eletroporação mRNA fornece uma expressão rápida, eficiente e espacialmente e temporalmente controlada de múltiplas proteínas dentro do sistema modelo aviário. Este método permite uma expressão mais ampla e rápida de proteínas fluorescentes do que a rotulagem alcançada pela eletroporação padrão de DNA. A eletroporação facilita a abertura transitória de poros na membrana plasmática que servem como conduítes para a transferência de cargas genéticas como RNA e DNA para as células de numerosos organismos modelo.Para os experimentos iniciais, trabalham com embriões com mais de um dia de idade, pois são mais resistentes e resistentes a manipulações externas como a eletroporação. No estágio de desenvolvimento embrionário apropriado, quebre suavemente e despeje o conteúdo do ovo de codorna em uma placa de Petri de 10 centímetros. Use uma pipeta de transferência para remover a maioria do albumen grosso.Use um tecido de laboratório para limpar suavemente a superfície do jugo para remover o albumeno de espessura restante ao redor do embrião para garantir que o embrião grude firmemente no anel de papel. Coloque papel filtro precut sobre o embrião e use uma tesoura para cortar suavemente ao redor do perímetro do embrião. Use uma pipeta Pasteur para camada PPS sob o embrião usando fluxos suaves para desocupar qualquer jugo grudado no tecido.Puxe lentamente o anel de papel embrião em um ângulo oblíquo para cima e para fora do jugo. Coloque o papel em uma placa de Petri cheia de PBS para limpeza posterior. Uma vez que a maior parte do jugo tenha sido removido, coloque o lado ventral do embrião em uma placa de Petri de 35 milímetros coberta com uma mistura semisóida de ágar e albumen.Prepare a câmara de eletroporação conectando o eletrodo preto enchendo-o com PBS e colocando o embrião dentro. Use um microcapilar de vidro para injetar um bolus de 200 nanoliters de mRNA na cavidade entre o epiblasto e a membrana vitelline que cobre a região desejada. E então use o eletrodo vermelho para eletroporar o embrião.Coloque o embrião eletroporado de volta na mistura ágar-albumen e incubar a 38 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado. Para a imagem das proteínas fluorescentes codificadas por eletroporação, observe todos os embriões eletroporados sob um estereoscópio de dissecação fluorescente para selecionar o embrião eletroporado mais saudável e melhor para os experimentos de imagem dinâmica. Continue a incubar os outros embriões eletroplados e embriões não eletroplatados em uma incubadora separada.Enxágue brevemente o embrião selecionado com PBS para remover quaisquer bolhas que possam ter se formado no lado dorsal do embrião durante a eletroporação. Coloque o embrião limpo diretamente em um prato de imagem contendo uma fina camada de cerca de 150 microliters de albumen-ágar tomando cuidado para não gerar bolhas na superfície dorsal do embrião. Adicione um pequeno pedaço úmido de papel de tecido enrolado ao longo das bordas internas do prato de imagem.Sele o prato com filme de parafina para minimizar a evaporação durante a imagem e incubação. Mova o prato rapidamente para o estágio pré-ensaquerado de um microscópio confocal e use o canal brightfield para localizar o corante colorido no embrião. Defina o software de imagem para o objetivo desejado, espelho dicroico e espectro de emissões, e ligue um laser apropriado.Tome cuidado para que as células permaneçam na visão de imagem durante toda a filmagem. Use uma resolução de imagem alta o suficiente e certifique-se de que as condições de imagem não causarão fototoxicidade. Clique em Live no software de imagem e ajuste a potência do laser para uma configuração apropriada para a intensidade da fluorescência, dependendo de cada potência laser do microscópio.Comece a imaginar o embrião usando 1% de potência laser e um ganho de 800, aumentando a potência do laser lentamente em incrementos de 1% até que pixels saturados sejam vistos. Quando pixels saturados são observados diminuem ligeiramente a potência do laser até que nenhum pixel saturado possa ser visualizado. Imagem o embrião a cada três ou cinco minutos para verificar a migração de células individuais em diferentes pontos de tempo usando cinco pilhas de micrômetros de toda a área eletroplada com algum espaço extra em direção ao fundo da pilha Z no caso do embrião afundar na cama de agarose durante a sessão de imagem.Para observar a velocidade com que as células estão se movendo, verifique os primeiros pontos de tempo do primeiro filme. Se as células estiverem se movendo rapidamente, considere expandir o zoom da área de imagem ou imagem de uma região diferente. Quando toda a região eletroplada do embrião foi imagen, imagem em região não seletiva do mesmo embrião para determinar os níveis de autofluorescência.Para determinar quanto tempo o mRNA transfectado pode ser traduzido em proteínas fluorescentes depois de confirmar a eletroporação do gene de interesse no microscópio estéreo, coloque o embrião em um estágio pré-aquecido do microscópio confocal invertido e use o laser de 405 nanômetros com uma potência laser de 70%, 100 iterações e uma velocidade de varredura de quatro para fotobleach a maior parte da fluorescência celular do gene eletroplatado em uma variedade de pontos de tempo. Continue a incubar os embriões no palco a 36 graus Celsius após o branqueamento da foto, tomando cuidado para prestar atenção às células ativamente divisórias dentro da região fotobleachada que normalmente são vistas apenas em embriões saudáveis e, assim, indicam que a eletroporação não prejudicou as células embrionárias. Adquira imagens de pilha Z pós-alvejante da região eletroplada por um período de tempo desejado em intervalos de tempo regulares de três a cinco minutos.Para garantir que as condições de imagem não afetem deletério a sobrevivência do embrião incubar simultaneamente embriões eletroplaqueados que não são fotobleachados para servir como controle para a imagem. Para quantificar os resultados de fotobleachamento para a decadência mRNA pós-eletroporação use ImageJ para medir a intensidade da fluorescência de um círculo de 7,5 micrômetros no centro da área eletroplacada de cada célula para rastrear a fluorescência celular durante cada intervalo de três a cinco minutos. Quando todas as células dentro da região fotobleached que não estão passando por mitose e foram completamente fotobleachadas foram medidas, plote a intensidade da fluorescência ao longo do tempo pós-alvejante em cada um dos pontos de tempo em que o embrião foi fotobleachado.Embora a eletroporação de DNA leve a uma fluorescência mais brilhante em algumas células eletroplacais, a eficiência da eletroporação de DNA é visivelmente menor em comparação com as proteínas fluorescentes amplamente expressas codificadas pelo mRNA. Ao comparar o DNA e a co-eletroporação mRNA dentro do mesmo embrião, o DNA que expressa eficiência proteica fluorescente também é significativa e consistentemente menos eficiente do que o do mRNA expressando proteína fluorescente. A quantificação de todos os embriões eletroplatados apenas com mRNA, DNA ou uma combinação dos dois, revela que o mRNA transfecta cerca de 75% das células em uma determinada região, enquanto o DNA só transfecta cerca de 25% das células.O mRNA transfectado deve levar a uma produção de proteína mais rápida em comparação com o DNA transfectado, uma vez que o mRNA pode ser imediatamente reconhecido por máquinas de tradução citosóica. Embora a co-eletroporação de DNAs múltiplos tenha sido anteriormente demonstrada como relativamente ineficiente, a co-eletroporação de quatro mRNAs neste experimento resultou em uma eficiência de transfecção de 87% de todos os quatro mRNAs dentro de todas as regiões eletropladas. Embora o fotobleaching inicialmente reduza a intensidade da fluorescência nas células fotobleachadas em cerca de 95% algumas células permanecem que recuperam sua capacidade de dividir e expressar proteínas fluorescentes logo após a eletroporação.No entanto, essa habilidade diminui ao longo de cinco horas após a eletroporação. Tome seu tempo otimizando as melhores condições de imagem e continue mexendo mesmo depois de começar o filme estar pronto para fazer quaisquer ajustes, se necessário.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expressão de proteínas fluorescentes em<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...