Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Vi tackar David Huss för hjälpsamma insikter i detta arbete. Detta arbete stöddes delvis av Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) och USC Provost ' s undergrad Research Fellowship to MT, den Saban Research Institute intramural utbildning pre-doc Award till MD, och University of Southern California Grundutbildning Research Associates program Award till R.L.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med godkända riktlinjer från Children ' s Hospital Los Angeles och University of Southern California institutionella djuromsorg och använda kommittéer.
1. generation pCS2-baserade uttryck vektorer
<ol><li>
För att klona pCS2. Lifeact-eGFP, Förbered Vector Backbone genom att smälta 2 μg pCS2. CycB1-GFP (en konstruktion som innehåller en annan insats) med BamHI (10 U) och BsrGI (10 U) i lämplig rötnings buffert (se tabell över material...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

I detta protokoll, vi gav steg för steg instruktioner om hur man exakt microinjicera och elektroporate mRNA i cellerna i gastrulating vaktel embryon. Vi visade att in vitro syntetiserade mRNA elektroporation möjliggör snabb och effektiv uttryck för fluorescerande proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryon (figur 2 och 3). Fluorescens från H2B-Citrin protein översatt från electroporated mRNAs kunde upptäckas av konfokalmikroskopi inom ~ 20 min och ökade i FP-fluor...

Electroporation är en fysisk transfection metod som använder en elektrisk puls för att skapa övergående porer i plasmamembranet, vilket gör att ämnen som nukleinsyror eller kemikalier att passera in i cytosolen. Elektroporation används ofta för att leverera DNA till bakterier, jäst, växter, och däggdjursceller1,2,3. Det används rutinmässigt för att införa genetiska nyttolaster i målceller och vävnader inom det framtagande aviär embryot för att studera genetisk kontroll av utveckling eller etikett som migrerar populationer av celler4,5,6, 7. Emellertid, flera experimentella begränsningar finns också med DNA-elektroporation8. Till exempel introducerar DNA-elektroporation ofta mycket varierande antal uttrycks vektorer per cell och därefter de mRNAs och proteiner de kodar. Denna variation kan leda till betydande cellcellers heterogenitet som kompliserar både bildanalys och data tolkning9,10. Dessutom, proteiner från DNA-elektroporation börjar bara att uttrycka ~ 3 h post-elektroporation och inte når den maximala effektiviteten i cell nummer och fluorescens intensitet tills 12 h, sannolikt på grund av den tid som krävs för att överföra till kärnan och komplett både transkription och översättning in vivo11.
Däremot har mRNA transfektion använts effektivt i en mängd olika modellsystem, inklusive Xenopus laevis oocyter av görs12,13, omprogrammering mänskliga stamceller av mRNA lipofectamine transfection14 , och electroporating motsträvt neurala stamceller hos vuxna möss15. Vi testade förmågan hos mRNA elektroporation att effektivt märka celler under tidig aviär embryonal utveckling med in vitro syntetiserade mrnas som kodar distinkta fluorescerande proteiner (FPS). För våra studier använde vi pCS2 + Vector, en mångsidig uttrycks vektor som ofta används för att uttrycka proteiner i embryon från Xenopus och zebrafiskar. De SP6-och T7 RNA-polymerasinitiativtagarna i pCS2 + tillåter syntesen av mRNA och protein från någon klonad gen när den används i en in vitro-transkription/översättningssystem.
Här visar vi att mRNA elektroporation möjliggör snabb och effektiv uttryck för fluorescerande proteiner (FPS) i gastrulating vaktel embryon. Vi utformade och genererade många av de uttryck vektorer som används i dessa studier. Till exempel subklonade vi LifeAct-eGFP Gene16 i pCS2 + Vector17 för att uttrycka från CMV promotorn och SP6 promotorn. Den insatta genen ligger nedströms av den SP6 promotorn och upstream av SV40 poly (A) Svanen18. I embryon Co-electroporated med mRNA och DNA, FPs kodade från in vitro transkriberas mRNAs upptäcktes först inom 20 min av Electroporation, medan FPs från DNA-uttryck vektorer upptäcktes först efter 3 h. flera mRNAs-kodning för Nuclear, Golgi och membranproteiner kan elektroporeras till ett embryo samtidigt, vilket resulterar i ett snabbt och effektivt uttryck av flera proteiner i enskilda celler. Slutligen, med hjälp av en in vivo fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) assay, visar vi att en majoritet av den elektroporerade mRNAs förfall inom 2 h. Således, snabb initial proteinproduktion kombinerat med begränsad ny protein översättning gör mRNA elektroporation en värdefull teknik när temporala kontroll av uttrycket är nödvändigt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

Vi rapporterar att mRNA elektroporation tillåter fluorescerande proteiner för att märka celler i levande vaktel embryon snabbare och bredare än DNA-elektroporation. Den höga transfektionseffektiviteten tillåter minst 4 distinkta mRNAs att co-transfected med ~ 87% effektivitet. De flesta av de elektroporerade mRNAs bryts ned under de första 2 h post-elektroporation, tillåter tidskänsliga experiment som skall utföras i det växande embryot. Slutligen beskriver vi hur man dynamiskt bild levande embryon electroporated med mRNAs som kodar olika subcellulära riktade fluorescerande proteiner.

mRNA elektroporation är effektivare än DNA-elektroporation
Vi använde pCS2 +. H2B-Citrin att förbereda in vitro transkriberas mRNA. Eftersom DNA-elektroporation vanligen utförs på 1-2 μg/μl, använde vi en ekvimolära koncentration av mRNA (beräknas vara runt 0,25-0,5 μg/μl för H2B-Citrin) för mRNA elektroporation. Vi testade först elektroporation effektiviteten av pCS2 +. H2B-Citrin DNA jämfört ...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Vi rapporterar Messenger RNA (mRNA) elektroporation som en metod som möjliggör snabb och effektiv uttryck för flera proteiner i vaktel embryo modellsystem. Denna metod kan användas för att fluorescerande etikettceller och registrera deras in vivo rörelser av Time-lapse mikroskopi kort efter elektroporation.

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNA-elektroporation ger ett snabbt, effektivt, och rumsligt och tidsmässigt kontrollerat uttryck av flera proteiner inom aviär modellsystemet. Denna metod möjliggör ett bredare och snabbare uttryck för fluorescerande proteiner än den märkning som uppnås genom standard-DNA-elektroporation. Elektroporation underlättar övergående öppning av porer i plasmamembranet som fungerar som ledningar för överföring av genetiska nyttolaster som RNA och DNA till cellerna i många modellorganismer.För de inledande experimenten arbetar med embryon som är äldre än en dag gammal eftersom de är härdigare och mer motståndskraftiga mot yttre manipulationer som elektroporation. Vid lämpligt embryonalt utvecklingsstadium försiktigt bryta och häll vaktel ägg innehållet i en 10 centimeter Petriskål. Använd en överföringspipett för att ta bort majoriteten av det tjocka albumet.Använd ett labb vävnad för att försiktigt torka ytan av oket för att ta bort de återstående tjocka albumen runt embryot för att säkerställa att embryot kommer att hålla tätt till pappersringen. Låg precut filterpapper över embryot och använda sax för att smidigt skära runt omkretsen av embryot. Använd en Pasteur pipetter för att lager PPS under embryot med hjälp av mjuka strömmar för att utrymma något ok som fastnar på vävnaden.Dra långsamt embryot papper ringen i en sned vinkel upp och av oket. Placera papperet i en petriskål fylld med PBS för vidare rengöring. När de flesta av oket har tagits bort, placera embryot ventrala sidan upp i en 35 millimeter Petriskål täckt med en halvsammad blandning av agar och albumen.Förbered elektroporationskammaren genom att ansluta den svarta elektroden som fyller den med PBS och placera embryot inuti. Använd en mikrokapillär av glas för att injicera en bolus av 200 nanoliter mRNA i hålrummet mellan epiblast och vitellinemembranet som täcker den önskade regionen. Och sedan använda den röda elektroden för att elektroportera embryot.Placera det elektroporerade embryot tillbaka till agar-albumen-blandningen och inkubera i 38 grader Celsius tills det önskade utvecklingsstadiet. För avbildning av elektroporation-kodade fluorescent proteiner observera alla elektroporerade embryon under en fluorescerande dissekera stereoscope att välja den friskaste och bästa elektroporerade embryot för den dynamiska imaging experiment. Fortsätt att ruva de andra elektropläterade embryona och icke-elektropläterade embryon i en separat inkubator.Skölj kortfattat det valda embryot med PBS för att avlägsna eventuella bubblor som kan ha bildats på embryots ryggsida under elektroporationen. Placera det rengjorda embryot direkt i en avbildningsskål som innehåller ett tunt lager av cirka 150 mikroliter albumen-agar och är noga med att inte generera några bubblor på embryots ryggyta. Lägg till en liten fuktig hoprullad bit av mjukpapper längs insidan kanterna av avbildning skålen.Täta skålen med paraffinfilm för att minimera avdunstning under bildtagningen och inkubationen. Flytta skålen snabbt till det förkrigstidens stadium av ett konfokalmikroskop och använd brightfield-kanalen för att lokalisera det färgade färgämnet i embryot. Ställ in bildhanteringsprogrammet till det önskade målet, dikroisk spegel och emissionsspektra, och slå på en lämplig laser.Var försiktig så att cellerna kommer att förbli i bilden vision för hela filmen. Använd en tillräckligt hög bildåtergivningsupplösning, och se till att bildförhållandena inte kommer att orsaka fototoxicitet. Klicka på Live i bildhanteringsprogrammet och justera lasereffekten till en inställning som är lämplig för fluorescensintensiteten beroende på varje mikroskoplaserkraft.Börja avbilda embryot med 1%laserkraft och en 800 vinst, öka lasereffekten långsamt med 1%steg tills mättade pixlar ses. När mättade pixlar observeras minska lasereffekten något tills inga mättade pixlar kan visualiseras. Bild embryot var tredje till femte minut för att kontrollera migrationen av enskilda celler över olika tidpunkter med hjälp av fem mikrometer Z-stackar av hela elektropläterade området med lite extra utrymme mot botten av Z-stacken om embryot sjunker in i agarosbädden under bildbehandlingssessionen.För att observera hur snabbt cellerna rör sig kontrollera de första tidpunkterna i den första filmen. Om cellerna rör sig i snabb takt kan du överväga att utöka zoomen för det avbildade området eller avbilda en annan region. När hela elektropläterade regionen av embryot har avbildats, bild i unelectroplated regionen av samma embryot att bestämma autofluorescens nivåer.För att bestämma hur länge transfekterad mRNA kan översättas till fluorescerande proteiner efter att ha bekräftat elektroporation av genen av intresse på stereomikroskopet, placera embryot på ett förvärmt stadium av det inverterade konfokalmikroskopet och använd 405 nanometerlasern med en 70%lasereffekt, 100 iterationer, och en skanningshastighet på fyra till fotobleach större delen av den cellulära fluorescensen från den galvaniserade genen vid en mängd olika tidpunkter. Fortsätt att ruva embryona på scenen i 36 grader Celsius efter foto blekning, var noga med att uppmärksamma de aktivt dela celler inom den fotoblekta regionen som vanligtvis bara ses i friska embryon och därmed visar att elektroporationen inte skada embryonala celler. Förvärva post-bleka Z-stack bilder av den elektropläterade regionen för en önskad tid på regelbundna tre till fem minuters tidsintervall.För att säkerställa att bildförhållandena inte skadligt påverkar embryots överlevnad samtidigt inkubera elektropläterade embryon som inte är fotobleached att fungera som en kontroll för bildåtergivningen. För att kvantifiera fotoblekningsresultaten för mRNA-sönderfallsanledningsanvationen Användning ImageJ för att mäta fluorescensintensiteten hos en 7,5 mikrometercirkel i mitten av det elektropläterade området i varje cell för att spåra cellens fluorescens över varje tre till fem minuters intervall. När alla celler i den fotoblekta regionen som inte genomgår mitos och har varit helt fotobleached har mätts, rita fluorescens intensitet över tiden post-blekmedel vid varje tidpunkter embryot var fotobleached.Även om DNA-elektroporation leder till en ljusare fluorescens i vissa elektropläterade celler, är effektiviteten hos DNA-elektroporation synbart lägre jämfört med de allmänt uttryckta mRNA-kodade fluorescerande proteiner. Vid jämförelse av DNA och mRNA co-electroporation inom samma embryo är dna som uttrycker fluorescerande proteineffektivitet också betydligt och konsekvent mindre effektivt än det hos det mRNA som uttrycker fluorescerande protein. Kvantifiering av alla embryon som elektroplats med endast mRNA, DNA eller en kombination av de två, avslöjar att mRNA-transfekter cirka 75%av cellerna i en viss region, medan DNA endast transfects cirka 25%av cellerna.Den transfekterade mRNA bör leda till en snabbare proteinproduktion jämfört med transfekterat DNA eftersom mRNA omedelbart kan kännas igen av cytosolic översättningsmaskineri. Även om co-electroporation av flera DNAs har tidigare visat sig vara relativt ineffektiva, co-electroporation av fyra mRNAs i detta experiment resulterade i en 87%transfection effektivitet av alla fyra mRNAs inom alla de galvaniserade regionerna. Även om photobleaching minskar initialt fluorescens intensiteten i de photobleached cellerna med ca 95%vissa celler kvar som återvinner deras förmåga att dela och uttrycka fluorescerande proteiner strax efter elektroporation.Denna kapacitet minskar över fem timmar post-electroporation emellertid. Ta dig tid att optimera de bästa bildförhållandena och fortsätt att mixtra även efter att ha startat filmen är redo att göra några justeringar om det behövs.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Tillvägagångssätt

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Uttryck av fluorescerande proteiner i<em&gt; Lansettfisk</em&gt; Av mRNA Injektion i Obefruktade Oocyter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hela Retinala Explantat från kycklingembryon för elektroporering och kemiskt reagens Behandlingar

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Ljusinducerat GFP-uttryck i zebrafiskembryon med optogenetisk TAEL/C120-system

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

I Ovo Intravaskulär injektion i kycklingembryon

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av normal och avvikande cytosinmetylering inom intakta zebrafiskembryon

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...