Name: spatial and temporal control of murine melanoma initiation from mutant melanocyte stem cells
Uploaded: 2019-06-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Büro des stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsfragen durch das Peer Reviewed Cancer Research Program unter der Auszeichnung W81XWH-16-1-0272 unterstützt. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Saatgutstipendium des Cornell Stem Cell Program an A.C. White unterstützt. H. Moon wurde vom Cornell Center for Vertebrate Genomics Scholar Program unterstützt.

Alle tierischen Verfahren werden nach dem Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University (IACUC) durchgeführt.
1. Vorbereitung
<ol><li>
Sammeln Sie Schwanzklammern von 12 Tagen postnatalen Mäusen und verdauen in 400 μL von 0,05 N NaOH bei 95 ° C für 1 h. Vortex und fügen Sie 32 μL von 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotyp-Mäuse nach PCR-Protokollen, die durch das Jackson Laboratory zur Verfügung gestellt werden und Mäusen mit demGenotyp von Interesse 6 ...

<ol>
	<li>Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+skin+cancer+in+adults:+updated+evidence+report+and+systematic+review+for+the+US+preventive+services+task+force.">Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force.</a> The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>White, A. C., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+role+for+adult+stem+cells+as+cancer+cells+of+origin.">Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin.</a> Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).</li><li>Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer+cells+of+origin+in+cutaneous+tumors.">Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors.</a> Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).</li><li>Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+cellular+origin+of+cancer.">Tracing the cellular origin of cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).</li><li>Moon, H., Donahue, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Moon, H., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+path+from+melanocyte+stem+cells+to+cutaneous+melanoma+illuminated+by+UVB.">A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB.</a> Molecular &#38; Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).</li><li>Rabbani, P., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+activation+of+Wnt+in+epithelial+and+melanocyte+stem+cells+initiates+pigmented+hair+regeneration.">Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration.</a> Cell. 145 (6), 941-955 (2011).</li><li>Chou, W. C., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+migration+of+follicular+melanocyte+stem+cells+to+the+epidermis+after+wounding+or+UVB+irradiation+is+dependent+on+Mc1r+signaling.">Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling.</a> Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).</li><li>Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+orchestrates+aging+in+hair+follicle+stem+cells.">Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), (2013).</li><li>M&#252;ller-R&#246;ver, S., Handjiski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages.">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).</li><li>Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrospective+study+of+idiopathic+ulcerative+dermatitis+in+mice+with+a+C57BL/6+background.">A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science&#8239;: JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).</li><li>Vultur, A., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+melanoma.">SnapShot: melanoma.</a> Cancer Cell. 23 (5), (2013).</li><li>Dankort, D., Curley, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+radiation+accelerates+BRAF-driven+melanomagenesis+by+targeting+TP53.">Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53.</a> Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).</li></ol>

Hallmarkische genetische Veränderungen, die häufig bei Hautmelanomtumoren vorkommen, wurden gutbeschrieben. Die dominanteste Fahrermutation ist BrafV600E, und ein gentechnisch verändertes Mausmodell für BrafV600E-vermitteltes Melanom wurde von der Bosenberg-Gruppe14 erzeugt und im Jackson Laboratory deponiert. Anhand dieses Mausmodells hat unsere aktuelle Studie die Notwendigkeit einer zellulären Aktivierung von tumoranfälligen ...

Das Melanom, die bösartige Form von melanozytischen Tumoren, ist die aggressivste Krebserkrankung in der Haut, bei dem das kälteste Melanom für dieMehrzahl der Hautkrebssterben verantwortlich ist. In den Vereinigten Staaten wird Melanom häufig diagnostiziert; Es wird prognostiziert, dass es die 5. bis 6. häufigste Krebsart unter den geschätzten neuen Krebsfällen 20182 seinwird. Darüber hinaus zeigen die Inzidenz der Hautveränderungen in den letzten Jahrzehnten zwar den Trend zur allmählichen Reduktion, doch die inkutanen Melanominzizessraten in den letzten Jahrzehnten zeigen einenkontinuierlichen und raschen Anstieg beider Geschlechter.
Um das kahreale Melanom effizienter zu bekämpfen, ist es wichtig, die frühen Ereignisse der Melanomentwicklung aus ihren Ursprungszellen klar zu verstehen, um klinisch wirksame Präventionsmethoden besser zu identifizieren. Es ist inzwischen bekannt, dass adulte Stammzellen wesentlich zur Tumorbildung beitragen können, da die zelluläre Herkunft von Krebserkrankungen in vielen verschiedenen Arten von Organen, einschließlich Hautgewebe3,4,5. In ähnlicher Weise können adulte Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) in der Murin-Sruckhaut bei aberwitziger Aktivierung der Ras/Raf und Fort-Wege 6als Melanomzellen des Ursprungs wirken. Diese onkogenen Mutationen allein sind jedoch nicht in der Lage, die Tumorbildung aus ruhigen MCSCs effizient zu induzieren. Melanozytische Tumoren entwickeln sich schließlich, wenn MCSCs beim natürlichen Haarfahren aktiv werden. In diesem Protokoll werden wir jedoch Methoden beschreiben, um die zelluläre Aktivierung von tumoranfälligen MCSCs künstlich zu induzieren und so eine genaue Kontrolle der Melanominitiation6,7zuermöglichen.
Durch die hier beschriebenen Methoden kann die räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanom-Initiation von tumoranfälligen MCSCs, die onkogene BrafV600E ausdrücken , zusammen mit dem Verlust des Pten-Ausdrucks erfolgreich durchgeführt werden, da wir Haben zuvor berichtet6. Diese Methode beinhaltet frühere Befunde, die die Aktivierung von Haarfollikel-Stammzellen durch Depilation sowie die Exposition von Murinhaut gegenüber UV-B die Aktivierung von MCSCs, die sich auf die Haarfollikel stützen, erleichtern und die Translokation dieser Zelle Untervölkerung der interfollikulärenEpidermis6,8, 9,10. Diese in vivo-Modellsystemen können wertvolle Informationen darüber liefern, wie physiologische und ökologische Veränderungen den zellulären Status von melanomafreundlichen MCSCs verändern können, was wiederum zu einer signifikanten Initiation von Melanomen in der Haut führen kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13258</td>
			<td>For systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45-C8267-2.5L-EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4OH-tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904-25MG</td>
			<td>For topical treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26g 1/2&#34; needles</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet hair trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>09990-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removal cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available at most drug stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet light bulb</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0042-08</td>
			<td>model XX-15M midrange UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>pure ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast PE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td>paraffin pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td>xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23730571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassette</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>89199-430</td>
			<td>for FFPE processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td>25 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE metal mold</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803082</td>
			<td>24 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia inhalation system</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14085-09</td>
			<td>Straight, sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14558-09</td>
			<td>Straight, sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum</td>
			<td>FST</td>
			<td>14018-13</td>
			<td>Straight, blunt/blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td>Micro-Adson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>13590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSL-tdTomato</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>007914</td>
			<td>ai14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braf-V600E-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braf-V600E-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CTCTGCTGGGAAAGCGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kras-G12D-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kras-G12D-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>ACTCAAGGCAGGGATGAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>AATCTAGGGCCTCTTGTGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten-3</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CCGAAAATCTGTGGGAAGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-3</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GGCATTAAAGCAGCGTATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-4</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CTGTTCCTGTACGGCATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of murine melanoma initiation from mutant melanocyte stem cells

Das kutane Melanom gilt als der aggressivste Hautkrebs. Obwohl die Risikofaktoren und großen genetischen Veränderungen weiterhin mit zunehmender Tiefe dokumentiert werden, hat sich die Inzidenzrate des kutanen Melanoms in den letzten Jahrzehnten rasant und kontinuierlich erhöht. Um wirksame Präventionsmethoden zu finden, ist es wichtig, die frühen Schritte der Melanominitiation in der Haut zu verstehen. Frühere Daten haben gezeigt, dass follikuläre Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) im erwachsenen Hautgewebe als Melanomzellen des Ursprungs wirken können, wenn sie onkogene Mutationen und genetische Veränderungen ausdrücken. Die Tumorigenese, die aus melanoma-anfälligen MCSCs entsteht, kann beim Übergang von MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand induziert werden. Dieser Übergang in melanoma-anfälligen MCSCs kann durch die Modulation des Aktivitätszustandes von Haarfollikelstammzellen oder durch extrinsische Umweltfaktoren wie Ultraviolett-B-Werte (UV-B) gefördert werden. Diese Faktoren können im Labor durch chemische Enthaarung künstlich manipuliert werden, was den Übergang von Haarfollikelstammzellen und MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand und durch UV-B-Exposition mit einem Benchtop-Licht bewirkt. Diese Methoden ermöglichen eine erfolgreiche räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanominitiation in der Murin-Srufenhaut. Daher werden diese in vivo-Modellsystemen wertvoll sein, um die frühen Schritte der Hautmelanom-Initiation zu definieren und könnten verwendet werden, um mögliche Methoden zur Tumorprävention zu testen.

Hautmelanom-Initiation durch chemische Depilation
Das Verfahren der chemischen Depilation ist in Abbildung2 dargestellt. Wenn Mäuse 7-Wochen postnatal sind, ist ihre Rückenhaut in Telogen. Bei Telogen sind Haarfalzen-Stammzellen und MCSCs in einem ruhigen, ruhenden Zustand. Die Haut sollte nach der Rasur kein signifikantes Haarwachstum aufweisen. Auf der anderen Seite kann die che...

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Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Melanom ist weltweit weit verbreitet, mit zunehmender Inzidenz. Diese Protokolle ermöglichen es, die frühen Stadien der Melanominitiierung sorgfältig zu kontrollieren, was das Studium seiner Entwicklung erleichtert. Durch die Kontrolle der Zeit und des Ortes der Melanozyten-Stammzellaktivierung haben wir die Fähigkeit, die Veränderungen innerhalb der Stammzellpopulation und ihre neue Stammmelanom-Initiierung zu erkennen.Demonstrieren daterieren das Verfahren dahihm Kim und Luye An, Absolventen des Labors. Zwei bis drei Tage vor Beginn des Eingriffs verwenden Sie einen elektrischen Trimmer, um die dorsale Haut von jeder anästhesierten sieben Wochen alten Maus zu rasieren. Verwenden Sie am Tag des Experiments einen Wattestäbchen, um eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die exponierte Haut aufzutragen.Sobald die Creme gleichmäßig aufgetragen wurde, verwenden Sie saubere Wattestäbchen, um die Creme zu entfernen, gefolgt von sanftem Wischen mit einem feuchten Tuch, um Restcreme zu entfernen. Dann kehren Sie jede Maus in ihren Hauskäfig mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung zurück. Für die UV-B-Bestrahlung die Rückenhaut mit UV-B-Schutzmaterial bedecken, so dass nur der gewünschte Bereich freigelegt wird, und die UV-Kammer mit einem UV-beständigen Deckel bedecken.Schalten Sie dann die UV-B-Lampe ein, um die Maus für den entsprechenden Versuchszeitraum zu bestrahlen, bevor Sie die Maus in einen leeren Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung zurückbringen. Um die Hautproben zu isolieren, verwenden Sie einen elektrischen Trimmer, um haare aus dem dorsalen Hautbereich der eingeschläferten bestrahlten Mäuse zu entfernen, und bürsten Sie die exponierte Haut leicht mit einem fusselfreien Gewebe, um den Bereich zu räumen. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit scharfer Schere knapp über der Basis des Schwanzes und legen Sie große, stumpfe Schere in den Schnitt ein, um das subdermale Bindegewebe zu trennen.Mit einer scharfen Schere vorsichtig am Rand des von Interesse interessierten Hautbereichs schneiden, um die Gewebeprobe zu isolieren und das ausgeschnittene Hautgewebe auf ein sauberes Papiertuch zu legen. Dann verwenden Sie stumpfe Zange, um die Haut so zu dehnen, dass sie am Handtuch haftet und straff ist. Wenn alle Proben geerntet sind, legen Sie eine Hautprobe und papiertuchträger in ein Stück gefaltetes Filterpapier unmittelbar neben der Falte, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe glatt und nicht gefaltet oder zerknittert ist.Schließen Sie die Seiten des Filterpapiers mit Heftklammern, und schneiden Sie das Papier. Dann tauchen Sie die Proben drei bis fünf Stunden bei Raumtemperatur vollständig in 10% neutral gepuffertes Formalin ein, bevor Sie das Gewebe mit zwei fünfminütigen Wärten in entionisiertem Wasser waschen. Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie vorsichtig restliches Material aus dem Hautgewebe, und trimmen Sie die Ränder der Proben, so dass sie nicht gezackt werden.Als nächstes machen Sie drei sagittale Schnitte in jeder Probe, so dass die Breite der Streifen nicht mehr als fünf Millimeter beträgt, und machen Querschnitte, so dass die Proben nicht mehr als 20 Millimeter breit sind. Positionieren Sie eine Kryoform mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Medium in einer Hochformatausrichtung, und legen Sie vier bis fünf Hautstücke auf das OCT. Wenn alle Teile an Ort und Stelle sind, verwenden Sie zwei Paare von feinen Zangen, um die lange Kante jedes Stück hautauf den Boden der Kryoform zu bringen, so dass die Proben innerhalb des OCT vertikal und senkrecht zur Basis der Form sind.Dann füllen Sie die Form mit zusätzlichem OCT auf die zweite Lippe und legen Sie die Form auf eine flache Oberfläche eines Stücks Trockeneis, mit Zangen, um alle Hautteile einzustellen, die während der Übertragung verschoben haben können, wenn der Block beginnt, nach Bedarf zu gefrieren. Wenn Mäuse sieben Wochen nach der Geburt sind, ist ihre dorsale Haut in Telogen. Während Telogen, Haarfollikel und Melanozyten Stammzellen sind bekannt, in einem ruhigen Ruhezustand zu sein, und die Haut sollte kein signifikantes Haarwachstum nach der Rasur zeigen.Chemische Enthaarung kann jedoch haarfollikel Stammzellaktivierung induzieren, was zu einem signifikanten Haarwachstum innerhalb der Region des Interesses. Da die chemische Enthaarung die Aktivierung sowohl von Haarfollikel als auch von Melanozytenstammzellen signifikant induzieren kann, können Melanom-anfällige Melanozyten-Stammzellen in einem aktiven Zustand Tumore bilden und mikroskopische Melanominitierung kann innerhalb von zwei Wochen nach der chemischen Enthaarung beobachtet werden. UV-B-Bestrahlung kann auch Tumorinitiierung von stillen, tumoranfälligen Melanozytenstammzellen induzieren.Wichtig ist, dass UV-B die direkte Translokation von Melanozyten-Stammzellen aus ihrer follikulären Stammzellnische in die interfollikuläre Epidermis induziert. Darüber hinaus kann UV-B eine melanozyte Stammzell-Ursprung bei der Bildung von kutanem Melanom in der gesamten interfollikulären Epidermis induzieren. Ähnlich wie bei der dorsalen Haut kann die UV-B-induzierte Melanominitiierung insbesondere in anderen Hautbereichen, wie z. B. der Ohrenhaut, beobachtet werden.Im Vergleich zur Kontroll-Ohrhaut, die mit UV-resistentem Tuch bedeckt ist, zeigt die UV-B-infektionsfreie Ohrenhaut eine höhere Pigmentierung aufgrund einer höheren Belastung durch Melanominitierung. Verschiedene Dosen von UV-B können unterschiedliche Auswirkungen auf die Maushaut und Melanozytenaktivität haben. Daher ist es wichtig, die Bestrahlungsdosis vor Beginn des Experiments zu bestimmen und zu optimieren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Forschung

Krebsforschung

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Die DNA-Farbstoff-ausgelöste Seitenbevölkerung Phänotyp zur Erkennung und Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...