Name: spatial and temporal control of murine melanoma initiation from mutant melanocyte stem cells
Uploaded: 2019-06-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי Office של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות, באמצעות התוכנית לחקר הסרטן שנסקרו עמית תחת הפרס W81XWH-16-1-0272. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחברים ואינן בהכרח מיוחסות על-ידי משרד ההגנה. עבודה זו הייתה נתמכת גם על ידי מענק זרע מהתוכנית הגזע קורנל לייט. H. Moon נתמך על ידי מרכז קורנל על תוכנית המלומדים בעלי חוליות גנומיקה.

כל ההליכים בעלי החיים מבוצעים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קורנל ולהשתמש בוועדה (IACUC).
1. הכנה
<ol><li>
לאסוף קטעי זנב מ 12 יום עכברים לידתיים ולעכל ב 400 μL של 0.05 N NaOH ב 95 ° צ' עבור 1 h. מערבולת ולהוסיף 32 μL של 1 M טריס-HCl, pH 7. עכברים גנוטיפ על פי פרוטוקולי ה-PCR שסופקו דרך ...

<ol>
	<li>Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+skin+cancer+in+adults:+updated+evidence+report+and+systematic+review+for+the+US+preventive+services+task+force.">Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force.</a> The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>White, A. C., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+role+for+adult+stem+cells+as+cancer+cells+of+origin.">Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin.</a> Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).</li><li>Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer+cells+of+origin+in+cutaneous+tumors.">Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors.</a> Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).</li><li>Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+cellular+origin+of+cancer.">Tracing the cellular origin of cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).</li><li>Moon, H., Donahue, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Moon, H., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+path+from+melanocyte+stem+cells+to+cutaneous+melanoma+illuminated+by+UVB.">A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB.</a> Molecular &#38; Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).</li><li>Rabbani, P., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+activation+of+Wnt+in+epithelial+and+melanocyte+stem+cells+initiates+pigmented+hair+regeneration.">Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration.</a> Cell. 145 (6), 941-955 (2011).</li><li>Chou, W. C., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+migration+of+follicular+melanocyte+stem+cells+to+the+epidermis+after+wounding+or+UVB+irradiation+is+dependent+on+Mc1r+signaling.">Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling.</a> Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).</li><li>Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+orchestrates+aging+in+hair+follicle+stem+cells.">Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), (2013).</li><li>M&#252;ller-R&#246;ver, S., Handjiski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages.">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).</li><li>Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrospective+study+of+idiopathic+ulcerative+dermatitis+in+mice+with+a+C57BL/6+background.">A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science&#8239;: JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).</li><li>Vultur, A., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+melanoma.">SnapShot: melanoma.</a> Cancer Cell. 23 (5), (2013).</li><li>Dankort, D., Curley, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+radiation+accelerates+BRAF-driven+melanomagenesis+by+targeting+TP53.">Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53.</a> Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).</li></ol>

ההיכר שינויים גנטיים לעתים קרובות למצוא גידולים מלנומה עורית כבר תיאר היטב13. המוטציה הדומיננטית ביותר הנהג הוא BrafV600E, ומודל מהונדסים גנטית העכבר עבור brafV600E-תיווך מלנומה נוצר על ידי קבוצת Bosenberg14 והופקד במעבדה ג'קסון. באמצעות מודל זה של העכבר, ?...

מלנומה, הצורה המממנת של גידולים מלנולוציפטיים, הוא הסרטן האגרסיבי ביותר בעור עם מלנומה עורית אחראי על רוב מקרי המוות של סרטן העור1. בארצות הברית, מלנומה מאובחנת בדרך כלל; הוא הוקרן להיות 5 עד 6th הסרטן הנפוץ ביותר בקרב המקרים המשוער סרטן חדש ב 20182. יתר על כן, בעוד מקרי סרטן הכולל הראו את המגמה של צמצום הדרגתי בעשורים האחרונים, מלנומה עורית שיעור שיעור במהלך העשורים האחרונים להפגין עלייה רציפה ומהירה בשני המינים2.
כדי להילחם מלנומה עורית ביעילות רבה יותר, חשוב להבין בבירור את האירועים המוקדמים של פיתוח מלנומה מתאי המוצא שלהם לזהות טוב יותר קלינית שיטות מניעה יעיל. ידוע כיום כי בתאי גזע בוגרים יכולים לתרום באופן משמעותי להיווצרות הגידול כמקורות הסלולר של סרטן בסוגים רבים ושונים של איברים כולל רקמות העור3,4,5. באופן דומה, מבוגרים תאי גזע מלנוציט (MCSCs) בעור המורין הישן יכול לעבוד כתאי מלנומה של המקור על הפעלה חריגה של Ras/חיל הארץ ו akt מסלולים6. עם זאת, אלה מוטציות אונגניים לבד אינם מסוגלים ביעילות לגרום להיווצרות הגידול מן השקט MCSCs. גידולים מלנולוציפטיים בסופו של דבר להתפתח כאשר MCSCs להיות פעיל במהלך רכיבה על שיער טבעי. עם זאת, בפרוטוקול זה, נתאר שיטות כדי לגרום באופן מלאכותי הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול, ובכך להקל על שליטה מדויקת של חניכה מלנומה6,7.
באמצעות השיטות המתוארות כאן, שליטה מרחבית וטמפורלית של חניכה מלנומה עורית מפני גידול MCSCs ביטוי אונגניים BrafV600E יחד עם אובדן של ביטוי pten ניתן לבצע בהצלחה, כמו שאנחנו דיווחו בעבר על6. שיטה זו משלבת ממצאים קודמים כי הפגנת שיער זקיק גזע הפעלה של תא דרך הסרת שיער כמו גם איך חשיפה של העור murine ל-UV-B יכול להקל על ההפעלה של MCSCs תושב זקיק השיער וטרנסלוקציה של הסלולר הזה אוכלוסיית המשנה לאפידרמיס הפוליקולרית6,8,9,10. אלה במערכות מודל vivo יכול לספק מידע חשוב לגבי איך שינויים פיסיולוגיים וסביבתיים יכולים לשנות את הסטטוס התאי של מלנומה נוטה MCSCs, אשר בתורו יכול לגרום לחניכה משמעותית של מלנומה בעור.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13258</td>
			<td>For systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45-C8267-2.5L-EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4OH-tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904-25MG</td>
			<td>For topical treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26g 1/2&#34; needles</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet hair trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>09990-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removal cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available at most drug stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet light bulb</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0042-08</td>
			<td>model XX-15M midrange UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>pure ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast PE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td>paraffin pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td>xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23730571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassette</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>89199-430</td>
			<td>for FFPE processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td>25 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE metal mold</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803082</td>
			<td>24 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia inhalation system</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Veterinary grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14085-09</td>
			<td>Straight, sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14558-09</td>
			<td>Straight, sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum</td>
			<td>FST</td>
			<td>14018-13</td>
			<td>Straight, blunt/blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td>Micro-Adson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>13590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSL-tdTomato</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>007914</td>
			<td>ai14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braf-V600E-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braf-V600E-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CTCTGCTGGGAAAGCGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kras-G12D-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kras-G12D-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>ACTCAAGGCAGGGATGAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>AATCTAGGGCCTCTTGTGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten-3</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-1</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-2</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CCGAAAATCTGTGGGAAGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-3</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>GGCATTAAAGCAGCGTATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-4</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>CTGTTCCTGTACGGCATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of murine melanoma initiation from mutant melanocyte stem cells

מלנומה עורית ידועה כסרטן העור האגרסיבי ביותר. למרות גורמי הסיכון ושינויים גנטיים העיקריים להמשיך להיות מתועד עם עומק הגוברת, שיעור השכיחות של מלנומה עורית הראה עלייה מהירה ורציפה במהלך העשורים האחרונים. כדי למצוא שיטות מניעה יעיל, חשוב להבין את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה בעור. הנתונים הקודמים הוכיחו כי בתאי גזע מלנוציט הזקיקים (MCSCs) ברקמות העור המבוגר יכול לשמש כתאי מלנומה של המקור בעת המבטא מוטציות אונגניים ושינויים גנטיים. Tuמוריגנזה הנובעים MCSCs נוטה מלנומה יכול להיגרם כאשר MCSCs מעבר מן השקט למצב פעיל. מעבר זה מלנומה נוטה MCSCs ניתן לקדם על ידי אפנון של או שיער זקיק תאי גזע המדינה פעילות או באמצעות גורמים סביבתיים חיצוניים כגון אולטרה סגול-B (UV-B). גורמים אלה יכולים להיות מניפולציות באופן מלאכותי במעבדה על ידי depilation כימיים, מה שגורם מעבר של תאי גזע שיער זקיק ו מן השקט למצב פעיל, ועל ידי חשיפה UV-B באמצעות אור שספסל העליון. שיטות אלה מספקות שליטה מרחבית מוצלחת והטמפורלית של חניכה מלנומה עורית בעור מוריין. לכן, אלה במערכות מודל vivo יהיה בעל ערך להגדיר את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה עורית יכול לשמש כדי לבדוק שיטות פוטנציאליות למניעת גידול.

מלנומה עורית חניכה הנגרמת על ידי שיער כימי
הליך ההסרת שיער כימי מתואר באיור 2. כאשר העכברים הם 7-שבועות לאחר הלידה, העור הטייתי שלהם הוא בטלגן. במהלך טלעוגן, תאי גזע שיער זקיק ו MCSCs ידועים להיות בשקט, מצב מנוחה. העור ?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells at JoVE.com

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

מלנומה מאובחנת באופן נרחב ברחבי העולם, עם שכיחות גוברת. פרוטוקולים אלה מאפשרים את השלבים המוקדמים של ייזום מלנומה להיות נשלט בקפידה, להקל על המחקר של הפיתוח שלה. על ידי שליטה בזמן ובמיקום של הפעלת תאי גזע מלנוציטים, יש לנו את היכולת להבחין בשינויים בתוך אוכלוסיית תאי הגזע וייזום המלנומה הזן החדש שלה.הדגמת ההליך תהיה דאהים קים ולואיאן, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה. יומיים עד שלושה ימים לפני תחילת ההליך, השתמש גוזם חשמלי לגלח את העור הגבי מכל עכבר הרדמה בן שבעה שבועות. ביום הניסוי, השתמש ספוגית כותנה להחיל שכבה דקה של קרם depilatory על העור החשוף.לאחר הקרם כבר מיושם באופן שווה, להשתמש במטליות כותנה נקיות כדי להסיר את השמנת, ואחריו ניגוב עדין עם מטלית לחה כדי להסיר כל קרם שיורית. ואז להחזיר כל עכבר לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. להקרנת UV-B, מכסים את העור הגבי בחומר מגן UV-B כך שרק האזור הרצוי ייחשף, ומכסים את תא ה- UV במכסה עמיד בפני UV.לאחר מכן הפעל את מנורת UV-B כדי להקרנת העכבר לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה לפני החזרת העכבר לכלוב ריק עם ניטור עד להחלמה מלאה. כדי לבודד את דגימות העור, השתמש גוזם חשמלי כדי להסיר כל שערה מאזור העור הגבי של העכברים מוקרנים המתת חסד, ולהבריש קלות את העור החשוף עם רקמה ללא מוך כדי לנקות את האזור. בצע חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל בסיס הזנב והכנס מספריים גדולים וקהים לחתך כדי להפריד את רקמות החיבור התת עוריות.באמצעות מספריים חדים, לחתוך בזהירות לאורך קצה אזור העור של עניין לבודד את דגימת הרקמה ומניחים את רקמת העור excised על מגבת נייר נקי. לאחר מכן השתמש מטלפים עמומים כדי למתוח את העור, כך שהוא דבק במגבת והוא מתוח. כאשר כל הדגימות נקצרו, מניחים דגימת עור ומגבת נייר בחזרה לתוך פיסת נייר מסנן מקופל מיד סמוך לקמט, דואג כי המדגם הוא חלק ולא מקופל או מקומט.סגור את צידי נייר הסינון עם סיכות הידוק וקצץ את הנייר. לאחר מכן תוכלו להטביע את הדגימות בפורמלין חיץ ניטרלי של 10% למשך שלוש עד חמש שעות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הרקמות עם שתי שטיפות של חמש דקות במים מיונים. לאחר הכביסה השנייה, להסיר בזהירות כל חומר שיורית מרקמות העור, לקצץ את הקצוות של הדגימות, כך שהם לא משוננים.לאחר מכן, בצע שלושה חתכים קשתיים בכל מדגם, כך רוחב הרצועות הוא לא יותר מחמישה מילימטרים, ולעשות חתכים רוחביים, כך הדגימות הם לא יותר מ 20 מילימטרים רוחב. מקם תבנית קריו המכילה טמפרטורת חיתוך אופטימלית או מדיום OCT בכיוון לאורך, והצב ארבע עד חמש חתיכות עור על גבי OCT. כאשר כל החלקים נמצאים במקום, להשתמש בשני זוגות של מדפים עדין להביא את הקצה הארוך של כל פיסת עור לתחתית עובש cryo, כך הדגימות הן אנכיות בתוך OCT בניצב לבסיס התבנית.לאחר מכן מלאו את התבנית ב- OCT נוסף בשפה השנייה וה מניחים את התבנית על משטח שטוח של חתיכת קרח יבש, תוך שימוש במטחנים כדי להתאים את כל חתיכות העור שאולי עברו במהלך ההעברה כאשר הבלוק מתחיל לקפוא לפי הצורך. כאשר עכברים הם שבעה שבועות לאחר הלידה, העור הגבי שלהם הוא בטלוגן. במהלך טלוגן, זקיק השיער ותאי גזע מלנוציטים ידועים להיות במצב מנוחה רזה, ואת העור צריך להראות שום צמיחת שיער משמעותית לאחר הגילוח.דפילציה כימית, עם זאת, יכול לגרום להפעלת תאי גזע זקיק השיער, גרימת צמיחת שיער משמעותית בתוך האזור של עניין. כמו depilation כימי יכול לגרום באופן משמעותי את ההפעלה של זקיק השיער ותאי גזע מלנוציטים, תאי גזע מלנוציטים נוטה מלנומה במצב פעיל יכול ליצור גידולים חניכה מלנומה מיקרוסקופית ניתן לראות בתוך שבועיים של depilation כימי. הקרנה UV-B יכול גם לגרום חניכה הגידול מן ההפוגה, גידול נוטה מלנוציטים תאי גזע.חשוב לציין, UV-B גורם טרנסלוקציה ישירה של תאי גזע מלנוציטים מן נישה תאי גזע זקיקי שלהם האפידרמיס בין הזקיקים. יתר על כן, UV-B יכול לגרום תאי גזע מלנוציטים שמקורם היווצרות מלנומה עורית לאורך האפידרמיס interfollicular. בדומה לעור הגבי, חניכת מלנומה הנגרמת על ידי UV-B ניתן לראות בעיקר באזורי עור אחרים, כגון עור האוזן.ואכן, בהשוואה לעור האוזן שליטה, מכוסה בד עמיד UV, עור האוזן חשוף UV-B מדגים פיגמנטציה גבוהה יותר בשל נטל גבוה יותר של חניכת מלנומה. מינונים שונים של UV-B עשויות להיות השפעות שונות על העור של העכבר ופעילות melanocyte. לכן, חשוב לקבוע ולייעל את מינון ההקרנה לפני תחילת הניסוי.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

רתימת DNA- מופעלות בצד האוכלוסייה פנוטיפ לזהות ולטהר תאי גזע סרטניים מ דוגמאות ביולוגיות

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

הכנת מיטוכונמיטומיה של רקמות סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטאומוניקס כמותיים

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...