Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils at JoVE.com

J. W. C. è supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Chunxiang Sun per la sua assistenza nell'esecuzione della colorazione blu trypan.

Tutti gli studi murine rispettavano i pertinenti regolamenti etici e sono stati approvati dall'Università di Toronto Animal Care Committee e dal Research Ethics Board (Protocollo 20011930).
1. Installazione della legatura
NOTA: Questa è una procedura chirurgica non sterile che può essere eseguita in una sala operatoria standard. L'uso di animali privi di germi (non qui trattato) impone la manipolazione all'interno di un armadio di biosicurezza, l'uso di strumenti s...

L'elemento più critico associato all'uso del modello di parodontite indotta dalla legatura murina è centrato intorno alla ritenzione della legatura fino al momento del sacrificio o della rimozione intenzionale. La legatura biofilm-retentiva installata è in grado di indurre una significativa perdita di altezza ossea alveolare in appena 6 giorni, plateauing tra il periodo di 11-16 giorni39. La decisione di sacrificare i soggetti animali prima del periodo massimo di perdita ossea, rendendo questo ...

La malattia parodontale (PD) è una condizione osteolitica associata a una significativa morbilità dell'ospite e onere economico, che si manifesta con infiammazione gengivale e perdita sia dell'attaccamento dei tessuti molli che del supporto osseo per la dentizione interessata1,2,3,4. Questo processo è regolato dalle interazioni tra il microbiota orale e il sistema immunitario innato dell'ospite. È anche associato con esacerbazione di altre malattie infiammatorie sistemiche tra cui il diabete, malattie cardiovascolari, e il cancro5,6,7,8. Storicamente, è stato ipotizzato che la patogenesi della PD dipende da grandi quantità di batteri specifici come Porphyromonas gingivalis9. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che la componente microbica della PD è mediata dal biofilm dentale. Il biofilm è una comunità organizzata e complessa di numerosi microrganismi che possono esistere in sani stati simbiotici e distruttivi disbiotici10,11. Il biofilm orale normalmente offre resistenza all'ospite impedendo la creazione di foci di batteri patogeni e promuove la struttura e la funzione del tessuto gengivale ideale attraverso la regolazione della risposta immunitaria dell'ospite12,13. Le perturbazioni della relazione equilibriosa tra gli organismi commensali all'interno della cavità orale e il sistema immunitario ospite possono portare ad alterazioni dell'omeostasi dei tessuti, con conseguente disbatteriosi e sviluppo del segno distintivo delle comparse cliniche e radiografiche di PD5,10,12,13,14.
È interessante notare che la creazione di una disbatteriosi orale, sebbene necessaria per l'avvio della PD, non è sufficiente per guidare la PD in tutti gli individui, eludendo verso la capacità della risposta immunitaria dell'ospite di sovvertire la transizione del microbiota tra stati simbiotici e disbiotici15. Questo pone un particolare riflettore sui mezzi attraverso i quali la PD influenza uno dei principali caratteri del sistema immunitario innato, vale a dire il granulocito polimorfonucleare (PMN), o neutrofilo, da prospettive locali e sistemiche16,17.
Nell'uomo, le PNN vengono reclutate dalla circolazione ad un tasso di 2 x 106 cellule/h nei tessuti connettivi parodontali sani, dove sono la popolazione di leucociti predominante. Qui, vengono successivamente espulsi dal solco gengivale nella cavità orale come componente del liquido crevicolare gengivale. In presenza della PD, la neutrofilia si manifesta all'interno della circolazione e della cavità orale, dove queste cellule eftori possiedono un fenotipo iperinfiammatorio che porta alla suddetta distruzione del parontium17,18,19,20,21,22. Pertanto, comprendere il ruolo delle PMN nella PD e in altre condizioni infiammatorie sistemiche è della massima importanza.
Anche se è ampiamente riconosciuto che le malattie croniche sono reciprocamente legate alla PD, i meccanismi sottostanti devono ancora essere chiariti, contribuendo a difficoltà nella gestione di queste condizioni sistemiche morbose e potenzialmente fatali. Diversi modelli animali sperimentali, ciascuno con vantaggi e svantaggi unici, sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia del PD23,24. Concentrandosi in particolare sui modelli murini, ci sono una varietà di protocolli attraverso i quali lo studio della PD è facilitato; tuttavia, essi possiedono diverse carenze tecniche e fisiologiche25,26,27,28,29,30,31.
In primo luogo, il modello di topo gavage orale richiede numerose inoculazioni orali di patogeni parodontali umani per generare infiammazione gengivale e perdita ossea. Inoltre, è generalmente preceduto da un periodo di trattamento antibiotico per sovvertire la flora orale murinacommensale 25. Questo modello spesso richiede una formazione specializzata per eseguire in modo sicuro il gavage orale, utilizza solo una piccola frazione di patogeni parodontali dal più complesso microbioma orale umano e richiede diversi mesi per stabilire la perdita ossea alveolare.
Al contrario, i modelli murini indotti chimicamente utilizzano la consegna orale di acido solforico trinitrobenzene (TNBS) o sodio solfato dextran (DSS), agenti comunemente utilizzati nella creazione di modelli murini di colite per un periodo di diversi mesi per indurre la perdita ossea periodoontale26. Sono disponibili modelli a base di ascesso intraorale ed extraorale, che coinvolgono rispettivamente gli incisivi murini e i tessuti del dorsum e il calvario. Nel modello precedente di ascesso, vengono somministrate diverse iniezioni di batteri, creando ascessi gingivali multipli e una carenza di perdita ossea alveolare, limitando il loro uso nello studio della PD. Questi ultimi modelli di ascesso sono significativamente più adatti allo studio della virulenza batterica, dell'infiammazione e del riassorbimento osseo in siti al di fuori della cavità orale, che elimina la valutazione del paroto e del microbioma orale27,28,29,30,31.
Utilizzando il modello indotto dalla legatura della parodontite, una sutura di seta intrecciata è stata comunemente installata ciferenzialmente intorno al secondo molare. In alternativa, è possibile inserire un singolo segmento lineare di materiale di sutura tra il primo e il secondo molari32,33. L'obiettivo del posizionamento della legatura è quello di facilitare l'accumulo batterico e generare disbiosi all'interno del sulci gengivale, con conseguente infiammazione del tessuto parodontale e distruzione dei tessuti che compongono il parodonto. In particolare, questo modello è in grado di produrre significativamente più perdita ossea alveolare rispetto al modello di gavage orale più comunemente usato34. A complicare ulteriormente l'uso del modello di gavage orale è la resistenza naturale da parte di diversi ceppi di topi (cioè C57BL/6) allo sviluppo della perdita ossea alveolare. Questo è anche problematico, in quanto questo ceppo è il più frequentemente utilizzato nella ricerca animale a base di murini35.
Le procedure esistenti descritte da Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis sono state ideate per semplificare l'atto tecnico di collocare la legatura33,36. Purtroppo, il primo protocollo richiede attrezzature specializzate stampate in 3D e possiede il potenziale per la perdita prematura delle legature, aumentando così l'uso degli animali e i costi associati al tempo aggiuntivo trascorso in sala operatoria. Inoltre, entrambi i protocolli generano solo piccole regioni del parodonto malato disponibili per uno studio.
I vantaggi che si trovano con questa tecnica sono radicati nello studio simultaneo della disbiosi orale e dell'immunologia che governano il parodonto, l'utilizzo di animali a basso costo con diversi background genetici e semplici pratiche abitative e allevamento. Come tale, gli obiettivi dovrebbero essere di massimizzare i volumi di tessuto malato e, nel tentativo di praticare i principi di riduzione della ricerca animale, ridurre il consumo di animali a un livello il più basso possibile. Ciò richiede che tutti gli animali siano in grado di essere inclusi nelle analisi sperimentali37. Tuttavia, va notato che non importa quale modello animale della malattia parodontale viene utilizzato, non esiste un singolo modello che comprenda ogni elemento della fisiopatologia della PD.
Questo nuovo protocollo impiega il posizionamento di una legatura intorno a più denti molari mascellare utilizzando strumentazione e materiali che si trovano all'interno della maggior parte dei laboratori. Permette una quantità sufficiente di tempo per installare facilmente e con sicurezza una legatura che è improbabile che si amvulsi prematuramente. Infine, poiché le PMN coordinano la distruzione del parodonto nella PD, viene presentata anche una nuova metodologia per recuperare i neutrofili orali in modo analogo agli esseri umani.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

I principali vantaggi dello studio della fisiopatologia della malattia parodontale utilizzando modelli murini sono la riduzione del costo degli animali, la gamma di ceppi geneticamente modificati, il gran numero di analisi che possono essere eseguite su tessuti molli e duri raccolti. Tuttavia, molti di questi sistemi sono oggetto di critiche procedurali. In alternativa, può essere impiegato il modello di malattia parodontale indotta dalla legatura, guidata dallo sviluppo localizzato e dalla ritenzione di un microbioma orale disbiotico, che è rapidamente indotto e relativamente affidabile. Purtroppo, le varianti del protocollo di parodontite murina indotta dalla legatura sono isolate nelle regioni focali del parodonto e soggette ad avulsione prematura della legatura installata. Questo riduce al minimo la quantità di tessuto disponibile per le analisi successive e aumenta il numero di animali necessari per lo studio. Questo protocollo descrive le manipolazioni precise necessarie per inserire legature molare estese con una migliore ritenzione e l'uso di una nuova tecnica di risciacquo per recuperare i neutrofili orali nei topi con un approccio alternativo che mitiga i suddetti sfide tecniche.

Vengono forniti dati relativi alla citometria di flusso rappresentativo proveniente da campioni di risciacquo orale di un'ingenua (Figura 3A) e infiammata (Figura 3B) di cavità orale che si trovano secondaria mente alla parodontite indotta dalla legatura. Viene inoltre illustrato il ripristino di PMN da una legatura installata (Figura 3C). Le tensioni del canale del citometro di fl...

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Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Questo articolo presenta un protocollo per stabilire un modello di parodontite indotta da legatura di parodontite murina che coinvolge molari maxillari multipli, con conseguente aree più grandi del tessuto gengivale e dell'osso coinvolti per l'analisi successiva, nonché l'uso ridotto degli animali. Viene descritta anche una tecnica per valutare i neutrofili orali in modo analogo ai soggetti umani.

Robust osufilazione modello di Murine Periodontitis per la valutazione dei neutrofili orali

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Il protocollo qui descritto fornisce agli investigatori un metodo per studiare i neutrofili orali all'interno di un modello animale indotto dalla legatura della malattia parodontale in modo analogo ai partecipanti umani. Il principale vantaggio di questa tecnica è evidenziato dall'aumento del volume di tessuti gengivali infiammati disponibili per l'analisi successiva, che riduce l'uso degli animali. La nostra capacità di recuperare le legature rivestite di biofilm da intorno ai denti consente la simulazione di un trattamento efficace di una malattia parodontale localizzata.L'uso di questo modello potrebbe essere applicato nello studio degli effetti sistemici della parodontite in un modello animale, a causa dell'aumento delle aree dei tessuti gengivali infiammati. Si consiglia vivamente di familiarizzare con l'uso di strumenti microchirurgici e microscopi a dissezione, nonché di legare i nodi del chirurgo prima di maneggiare soggetti animali vivi. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale per ridurre la lunghezza della curva di apprendimento necessaria per ottenere un posizionamento competente della legatura.A dimostrare la procedura sarà Jeff Chadwig, uno studente laureato del mio laboratorio. Inizia posizionando il mouse su una piattaforma chirurgica riscaldata. Dopo aver fatto in modo che il mouse sia adeguatamente anestetizzato, stabilizzare la mascella e la mascella in posizione aperta utilizzando elastici.Puntellare il collo con un rotolo di cotone per mantenere la mascella in posizione orizzontale e coprire il corpo e la coda per mitigare la perdita di calore. Posizionare il microscopio chirurgico all'ingrandimento e all'illuminazione desiderati sulla cavità orale. Utilizzare le forcelle scheggia per installare una sutura di seta intrecciata sterile 50 o più piccola intorno ai molari mascellari M1 e M2 all'interno del solco gengivale.Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentizione e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M2 e M3. Quindi, avvolgerlo intorno alla superficie buccale di M2 e inserirlo tra il contatto di M1 e M2. Assicurarsi che entrambe le estremità della sutura siano tirate saldamente per guidarla verso il solco gengivale. Avvolgere il segmento di sutura prossimale intorno a M1 sotto la sua altezza di contorno e inserirlo tra il contatto di M1 e M2. Tirare saldamente la coda prossimale della sutura per rimuovere tutto il margine di flessibilità. Legare le estremità della sutura con il nodo di un chirurgo e tagliare le code il più in modo possibile.Posizionare il nodo nell'embrasure gengivale tra M1 e M2 sul lato palatale della dentatura mascellare. È fondamentale che il nodo utilizzato per fissare la legatura sia sicuro e in posizione in cui non irriterà l'animale o interferirà con la masticazione. Dopo l'installazione della legatura, rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico e posizionarlo in una gabbia pulita sotto una lampada termica, assicurandosi di monitorarlo fino a completo recupero.Sterilizzare gli strumenti chirurgici nello sterilizzatore di perline di vetro caldo tra ogni soggetto animale. Ospitare singolarmente ogni topo con l'adeguato arricchimento ambientale e consentire l'accesso ad libitum all'acqua filtrata e al purè di chow standard in un ambiente controllato da temperatura e umidità per sette-11 giorni. Quando è pronto per raccogliere campioni, utilizzare una pipetta per risciacquare la cavità orale con 100 microlitri di PBS sterilizzato di quattro gradi Celsius senza calcio e magnesio per 10 secondi.Ripetere il risciacquo altre due volte, posizionando ogni risciacquo nella stessa provetta sterile conica da 15 millilitri per ogni animale. Eseguire il contenuto di ogni tubo da 15 millilitri attraverso un filtro a rete di nylon da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e trasferire il filtrato in una nuova provetta da 15 millilitri. Aggiungere 33,3 microlitri di paraformaldeide al 16% per facilitare la fissazione del campione.Vortice immediatamente i campioni e incubarli sul ghiaccio per 15 minuti. La paraformaldeide è il reagente più pericoloso utilizzato nel protocollo e deve essere maneggiata con i dispositivi di protezione individuale raccomandati dal produttore. Dopo l'incubazione, riempire il tubo a 15 millilitri con PBS, quindi centrifugarlo a 1000xg e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Aspirare il supernatante, sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di tampone FACS a quattro gradi Celsius e contare le cellule su un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Ripetere la centrifugazione e aspirare il supernatante. Quindi, sospendere di nuovo il pellet di cellule in un volume appropriato di tampone FACS per una concentrazione finale da 500.000 a 1 milione di celle per 50 microlitri di tampone FACS e trasferire le celle nel tubo FACS.Aggiungere un microlitro di siero di ratto e due microlitri di anticorpi IGG anti-topo a 50 microlitri del campione. Vortice immediatamente il campione e bloccarlo sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi, aggiungere gli anticorpi appropriati a ciascun campione.Vortice e incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, lavare i campioni con un millilitro di tampone FACS, vortice brevemente e centrifugare per cinque minuti a 1000xg e quattro gradi Celsius. Scaricare il supernatante e bloccare delicatamente l'apertura del tubo FACS.Ripetere il lavaggio due volte, quindi sospendere di nuovo i campioni in 250 microlitri di buffer FACS per la conservazione. Coprire i tubi con pellicola di paraffina, avvolgerli in un foglio di alluminio e conservarli a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'analisi. La citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare i neutrofili recuperati da un risciacquo orale da un topo ingenuo, così come un risciacquo orale e una legatura recuperata da un topo con parodontite indotta dalla legatura.Per valutare la perdita ossea alveolare, i livelli ossei alveolari sono stati misurati dalla cresta ossea alveolare alla giunzione cementoenamel per topi sani e legati. Quindi, sono state calcolate le differenze di misurazione. Sebbene non venga esaminata qui, la valutazione istopatologica, immunoistochimica e morfometrica del parodonto e dell'osso alveolare può anche essere intrapresa a seconda della domanda di ricerca.Questo modello è attualmente utilizzato nel mio laboratorio per studiare gli effetti del sistema immunitario innato orale sulla salute e sulle malattie sistemiche.

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