Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
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J. W. C. はカナダ保健研究所 (CIHR) の支援を受けています。著者たちは、トリパンブルー染色を行う際の彼女の支援に対して、春祥孫博士に感謝したいと思います。

すべてのマウス研究は、関連する倫理規定に準拠し、トロント大学動物ケア委員会と研究倫理委員会(プロトコル20011930)によって承認されました。
1. 合字のインストール
注:これは標準的な手術室で行うことができる非無菌の外科処置である。生殖不能動物の使用(ここではカバーされていない)は、生体安全キャビネット内での取り扱い、無菌器具の使?...

歯周炎のマウス合字誘発モデルの使用に関連する最も重要な要素は、犠牲または意図的な除去の時まで合字の保持を中心とする。設置されたバイオフィルム-リテンション合字は、わずか6日間で歯槽骨の高さの有意な損失を誘導することができ、11〜16日周期39の間に高原化する。骨損失の最大期間の前に動物の被験者を犠牲にするという決定は、合字誘発歯炎のはるかに短?...

歯周病(PD)は、有意な宿主罹患率および経済的負担に関連する骨溶解状態であり、歯肉の炎症および軟部組織結合および患部の骨の支持の両方の喪失によって現れる1、2、3、4である。このプロセスは、宿主の経口微生物叢と自然免疫系との相互作用によって支配される。また、糖尿病、心血管疾患、および癌5、6、7、8を含む他の全身性炎症性疾患の悪化に関連する。歴史的に、PD病因はポルフィロモナス・ギンギバリス9のような特定の細菌に大量に依存していると仮定した。しかしながら、最近の証拠は、PDの微生物成分が歯科バイオフィルムによって媒介されることを示唆している。バイオフィルムは、健康な共生および破壊的な生生物状態10、11に存在し得る多数の微生物の組織化された複雑なコミュニティである。経口バイオフィルムは、通常、病原性細菌の病巣の樹立を防止することによって宿主に耐性を与え、宿主免疫応答12、13の調節を通じて理想的な歯肉組織の構造および機能を促進する。口腔内の単一生物と宿主免疫系との間の平衡関係の摂動は、組織恒常性の変化をもたらし、その結果、PD5、10、12、13、14の顕著な臨床および放射線出現の特徴的な臨床および放射線出現の発症をもたらし得る。
興味深いことに、経口ジスバクテリア症の確立は、PDの開始に必要であるが、全ての個体においてPDを駆動するのに十分ではなく、共生およびジビオティック状態間の微生物叢の移行を覆す宿主免疫応答の能力に向かって排除する15。これは、PDが先天性免疫系の主要なキャラクターの1つ、すなわち多形核顆粒球(PMN)、または好中球に影響を与える手段に特定のスポットライトを置き、局所的および全身的な観点から16、17を置く。
ヒトでは、PMNは、健康な歯周結合組織において〜2x106細胞/hの割合で循環からリクルートされ、そこでは白血球集団が優勢である。ここで、それらは、その後、歯肉管管液の成分として口腔内に歯肉溝から排出される。PDの存在下で、好中球症は循環および口腔内に現れ、これらのエフェクター細胞は、歯周期17、18、19、20、21、22の前述の破壊につながる過剰炎症表現型を有する。したがって、PDおよび他の全身性炎症状態におけるPMNの役割を理解することは最も重要である。
慢性疾患がPDと相互に関連していることは広く受け入れられているが、根本的なメカニズムはまだ解明されておらず、これらの病的で致命的な全身状態の管理における困難に寄与している。複数の実験動物モデルは、それぞれ独自の長所と短所を有し、PD23、24の病態生理学を研究するために利用されている。特にマウスモデルに焦点を当てて、PDの研究が容易になる様々なプロトコルがあります。しかし、彼らはいくつかの技術的および生理学的な欠点を持っています25,26,27,28,29,30,31.
まず、口腔ガバゲージマウスモデルは、歯肉炎症および骨損失を生成するためにヒト歯周病原体の多数の経口接種を必要とする。加して、一般に、マウスの口腔内細菌叢25を覆す抗生物質治療の期間が先行する。このモデルは、多くの場合、経口ガベを安全に行うために専門的な訓練を必要とし、より複雑なヒト経口微生物から歯周病原体のほんの一部のみを使用し、肺胞骨喪失を確立するために数ヶ月を必要とします。
対照的に、化学的に誘導されたマウスモデルは、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)またはデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の経口送達を利用し、歯周骨損失26を誘発するために数ヶ月にわたって大腸炎のマウスモデルを確立するのに一般的に使用される薬剤である。口腔内および口腔外膿瘍ベースのモデルは、それぞれカルバリウムと同様に、モルサムのマウス切開器および組織を含む利用可能である。前者の膿瘍モデルでは、細菌のいくつかの注射が投与され、複数の歯肉膿瘍および歯槽骨喪失の消滅を引き起こし、PDの研究におけるその使用を制限する。後者の膿瘍モデルは、口腔外の部位における細菌毒性、炎症、および骨吸収を研究する傾向が有意に高く、歯竜菌および口腔微生物叢の評価を排除する27、28、29、30、31である。
歯周炎の合字誘発モデルを用いて、編組シルク縫合糸は、一般的に第2の大臼歯の周りに円周に設置されている。代替として、縫合材料の単一の線形セグメントは、第1および第2の臼歯32、33の間に挿入することができる。合字配置の目的は、細菌の蓄積を促進し、歯肉スルチ内のジスバイオシスを生成し、歯周組織の炎症および歯周を構成する組織の破壊をもたらすことである。最も顕著なのは、このモデルは、より一般的に使用される経口ガバゲージモデル34と比較して有意により多くの肺胞骨損失を産生することができる。さらに口腔ガベモデルの使用を複雑にすることは、歯槽骨損失を発症するマウスのいくつかの株(すなわち、C57BL/6)による自然な耐性である。この株は、マウスベースの動物研究35で最も頻繁に使用されるので、これはまた問題です。
マルケサンら、安倍、ハジシェンガリスによって記述された既存の手順は、合字33、36を配置する技術的な行為を簡素化するために考案されました。残念ながら、前者のプロトコルは、特殊な3Dプリント機器を必要とし、それによって動物の使用と手術室で費やされた追加の時間に関連するコストを増加させる早期合字損失の可能性を有しています。さらに、両方のプロトコルは、研究のために利用可能な疾患歯当ての小さな領域のみを生成します。
この技術に伴う利点は、歯竜を支配する経口ジスビオシスと免疫学の同時研究、多様な遺伝的背景を持つ低コストの動物の利用、シンプルな住宅と畜産の実践に基づいています。そのため、疾患組織の量を最大化し、動物研究における減少の原則を実践しようとする試みにおいて、動物の消費量を可能な限り低いレベルに減らすことが目標となるべきである。これには、すべての動物が実験分析37に含まれる能力を確保する必要があります。しかしながら、歯周病のどの動物モデルが利用されても、ヒトPD病態生理学のあらゆる要素を包含する単一のモデルがないことに留意すべきである。
この新しいプロトコルは、ほとんどの実験室で見られる計装および材料を使用して、複数の上顎臼歯の周りの合字の配置を採用しています。これは、早期に発芽する可能性が低い合字を簡単かつ自信を持ってインストールするのに十分な時間を可能にします。最後に、PMNがPDにおける歯素の破壊を調整するにつれて、ヒトに類似した方法で経口好中球を回収する新しい方法論も提示される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

マウスモデルを利用して歯周病の病態生理学を研究する主な利点は、動物のコストの削減、遺伝子組み換え株の配列、収穫された柔らかい組織および硬質組織に対して行うことができる膨大な数の分析である。しかし、これらのシステムの多くは手続き上の批判の対象となります。代替として、生理周期疾患の合字誘発モデルは、生体生物的経口微生物叢の局所的な発達および保持によって駆動され、急速に誘導され、比較的信頼性が高い、採用することができる。残念ながら、合字誘発性マウス歯炎プロトコルの変異体は、歯素の焦点領域に単離され、インストールされた合字の早期発従の対象となる。これにより、後続の分析に使用できる組織の量が最小限に抑え、研究に必要な動物の数が増加します。このプロトコルは、前述を緩和する代替アプローチを用いてマウスの口腔好中球を回収する新しいリンス技術の保持と使用を改善した拡張モル合字を配置するために必要な正確な操作を記述します。技術的な課題。

ナイーブ(図3A)および炎症を起こした(図3B)マウス口腔から合字誘発歯炎に続く経口リンス試料からの代表的なフローサイトメトリーデータが提供される。インストール済み合字からの PMN の回復も示されています (図 3C)。フローサイトメータチャネル電圧を手動で校正し、単一染色補償ビ...

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Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

この記事では、複数の上顎大臼歯を含む糸字誘発モデルを確立するためのプロトコルを提示し、その後の分析と動物の使用量の減少のために関与する歯肉組織および骨のより大きな領域をもたらす。ヒト被験者に類似した方法で経口好中球を評価する技術も記載されている。

口腔好中球評価のためのマウス歯肉炎の堅牢な合字誘発モデル

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

ここで説明するプロトコルは、ヒト参加者と同様の方法で歯周病の合字誘発動物モデル内の経口好中球を研究する方法を研究者に提供する。この技術の主な利点は、動物の使用を減らす後続の分析のために利用可能な炎症ギンジバル組織の量の増加によって強調されています。歯の周りからバイオフィルムコーティングされた合字を取り出す私達の能力は局在した歯周病の有効な処置のシミュレーションを可能にする。このモデルの使用は、炎症を起こした歯肉組織の領域が増加したため、動物モデルにおける歯肉炎の全身効果の研究に適用することができる。微小手術用器具や解剖顕微鏡の使用に精通し、生きた動物の被験者を扱う前に外科医の結び目を結ぶことは、大いに助言されています。この手法の視覚的なデモンストレーションは、熟練した合字配置を達成するために必要な学習曲線の長さを短くする上で重要です。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるジェフ・チャドウィグです。まず、加熱された外科プラットフォームにマウスを配置します。マウスが適切に麻酔されていることを確認した後、弾性バンドを使用して開いた位置で上顎と下顎を安定させます。水平位置に上顎を維持するために綿ロールで首を支え、熱損失を軽減するためにボディとテールを覆います。手術用顕微鏡を所望の倍率に置き、口腔の上に照明を置きます。スプリンター鉗子を使用して、歯肉スルカス内のM1およびM2上顎臼歯の周りに無菌50または小さな編組シルク縫合糸を取り付ける。歯列の口蓋側に縫合の遠位尾を配置し、M2とM3の接触の間に近位セグメントを挿入します。そして、M2の頬面を包み込み、M1とM2の接触の間に挿入します。縫合糸の両端をしっかりと引っ張って歯肉スルカスに入れるようにします。近位縫合線セグメントを輪郭の高さより下の M1 の周りにラップし、M1 と M2 の接触の間に挿入します。縫合糸の近位尾をしっかりと引っ張って、すべてのたるみを取り除きます。縫合糸の端を外科医の結び目で結び、尾をできるだけ並べ替えます。上顎歯列の口蓋側のM1とM2の間の歯肉のエンブラシュアに結び目を置きます。合字を固定するために使用される結び目は、動物を刺激したり、咀嚼を妨げない位置に安全である必要があります。合字を取り付けた後、手術装置からマウスを取り出し、ヒートランプの下できれいなケージに入れ、完全に回復するまで監視してください。各動物の対象者間のホットガラスビーズ滅菌器の手術器具を殺菌する。適切な環境濃縮を施した各マウスを個別に収容し、7~11日間、温度と湿度制御環境で、フィルター水とマッシュ標準チャウへのアドリビタムアクセスを可能にします。サンプルを収集する準備ができたら、ピペットを使用して、カルシウムとマグネシウムなしで100マイクロリットルの殺菌された摂氏PBSで口腔を10秒間すすぐ。リンスをさらに2回繰り返し、各リンスを動物ごとに同じ15ミリリットルの円錐形滅菌試験管に入れる。40マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターを通して50ミリリットルの円錐チューブに各15ミリリットルチューブの内容物を実行し、濾過物を新しい15ミリリットル試験管に移します。33.3マイクロリットルの16%パラホルムアルデヒドを加え、サンプル固定を容易にします。すぐにサンプルを渦し、15分間氷の上でそれらをインキュベートします。パラホルムアルデヒドは、プロトコルで採用されている最も危険な試薬であり、製造業者が助言する推奨の個人用保護具で取り扱う必要があります。インキュベーションの後、チューブをPBSで15ミリリットルに充填し、1000xgで遠心分離し、摂氏4度で5分間充填します。上清を吸引し、4°CでFACSバッファーの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、ヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンター上の細胞をカウントする。遠心分離を繰り返し、上清を吸引する。次に、FACSバッファーの500、000〜100万の最終濃度のFACSバッファーの適切な体積で細胞ペレットを再中断し、FACSチューブに細胞を移します。サンプルの50マイクロリットルにラット血清1マイクロリットルと抗マウスIGG抗体の2マイクロリットルを追加します。すぐにサンプルを渦し、20分間氷の上でそれをブロックします。次に、各サンプルに適切な抗体を加えます。渦と暗闇の中で30分間氷の上でインキュベート。インキュベーション後、サンプルをFACSバッファー1ミリリットル、渦液、遠心分離機を1000xgと摂氏4度で5分間洗浄します。上清をダンプし、FACSチューブの開口部を静かにブロックします。洗浄を2回繰り返し、保存のために250マイクロリットルのFACSバッファでサンプルを再中断します。パラフィンフィルムでチューブを覆い、アルミホイルで包み、分析する準備ができるまで摂氏4度で保管します。フローサイトメトリーは、ナイーブマウスから経口リンスから回収された好中球、ならびに口腔すすいで、合字誘発性歯肉炎を有するマウスから合字を回収した分析に使用した。歯槽骨の損失を評価するために、歯槽骨の骨レベルを、肺胞骨の堤から健康で連結したマウスのセメントエナメル接合部まで測定した。次に、測定差を算出した。ここでは検討はしないが、歯角および歯槽骨の組織病理学的、免疫組織化学的、形態評価も研究課題に応じて行うことができる。このモデルは現在、私の研究室で、経口の自然免疫系が全身の健康と病気に及ぼす影響を研究するために使用されています。

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