Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
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J. W. C. 건강 연구의 캐나다 학회에 의해 지원 됩니다 (CIHR). 저자는 트라이판 블루 염색을 수행하는 그녀의 도움에 대한 박사 춘샹 태양에게 감사드립니다.

모든 뮤린 연구는 관련 윤리 규정을 준수하고 토론토 동물 관리 위원회와 연구 윤리 위원회 (프로토콜 20011930)에 의해 승인되었습니다.
1. 합자 설치
참고 : 이것은 표준 수술실에서 수행 할 수있는 비 멸균 수술 절차입니다. 세균이없는 동물 (여기에 포함되지 않음)의 사용은 생체 안전 캐비닛 내에서 의 취급, 멸균 기구의 사용 및 치주 병원균과 구강의 접종...

치주염의 뮤린 합자 유발 모델의 사용과 관련된 가장 중요한 요소는 희생 또는 의도적 제거의 시간까지 합자의 보존을 중심으로한다. 설치된 생물막-리텐션 합자는 11-16일 기간39일사이에 고원, 6일 만에 폐포골 높이의 상당한 손실을 유도할 수 있다. 뼈 손실의 최대 기간 전에 동물 대상자를 희생하기로 결정, 이 합자 유발 치주염의 훨씬 짧은 모델을 렌더링, 더 조기 합자 avulsion?...

치주질환(PD)은 현저한 숙주 이환율 및 경제적 부담과 관련된 골용해 질환으로, 이는 치은 염증 및 연조직 부착 및 골변 지지체 모두의 손실로나타나며,1, 2,3,4. 이 프로세스는 경구 microbiota와 호스트의 타고난 면역 계통 사이 상호 작용에 의해 지배됩니다. 또한 당뇨병, 심혈관 질환 및 암5,6,7,8을포함하는 다른 전신 염증성 질환의 악화와 관련이 있다. 역사적으로, PD 병인은 포르피로모나스 치은염9와같은 특정 박테리아의 다량에 의존한다는 가설을 세웠다. 그러나, 최근의 증거는 PD의 미생물 성분이 치과 생물막에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 생물막은 건강한 공생 및 파괴적인 이영양제 상태10,11에존재할 수 있는 수많은 미생물의 조직적이고 복잡한 공동체이다. 경구 생물막은 일반적으로 병원성 박테리아의 초점의 확립을 방지함으로써 숙주에게 내성을 부여하고 숙주 면역 반응의 조절을 통해 이상적인 치은 조직 구조 및 기능을촉진한다(12,13). 구강 내의 공생 유기체와 숙주 면역 계통 사이의 평형 관계의 교란은 조직 항상성의 변경으로 이어질 수 있으며, PD5,10,12,13,14의특징적인 임상 및 방사선 학적 외관의 기능 장애 및 개발의 결과로 이어질 수 있습니다.
흥미롭게도, PD의 개시에 필요한 동안 경구 디스박테리아증의 확립은, 공생및 이영양상태 사이의 미생물의 전이를 전복시키기 위한 숙주 면역 반응의 능력을 배제하는 모든 개인에서 PD를 구동하기에 충분하지 않다15. 이는 PD가 선천성 면역 계통의 주요 문자 중 하나, 즉 다형성 핵 과립구(PMN) 또는 호중구에 영향을 미치는 수단에 특히 주목하는 데, 국소 및 전신적 관점에서16,17.
인간에서는, PMN은 건강한 치주 결합 조직에서 ~ 2 x 106 세포/h의 비율로 순환에서 모집됩니다, 여기서 그들은 지배적 인 백혈구 인구입니다. 여기에서, 그(것)들은 이후에 치은 crevicular 액체의 분대로 구강으로 치은 황액에서 추방됩니다. PD의 존재에서 호중구는 순환 및 구강 내에서 나타나며, 여기서 이러한 이펙터 세포는 치주17, 18,19,20,21,22의전술 한 파괴로 이어지는 과염증성 표현형을 가지고 있습니다. 따라서 PD 및 기타 전신 염증 조건에서 PMN의 역할을 이해하는 것이 가장 중요합니다.
만성 질환이 PD에 호혜적으로 연결된다는 것은 널리 인정되지만, 근본적인 메커니즘은 아직 해명되지 않았으며, 이러한 병적 이고 잠재적으로 치명적인 전신 질환의 관리에 어려움을 겪고 있습니다. 여러 실험 동물 모델, 각각 독특한 장점과 단점을 갖는, PD23,24의병리생리학을 연구하기 위해 활용되어 왔다. 특히 뮤린 모델에 초점을 맞추고, PD의 연구가 촉진되는 다양한 프로토콜이 있다; 그러나, 그들은 몇 가지 기술적, 생리적 단점을 가지고25,26,27,28,29,30,31.
첫째, 경구 형체 마우스 모델은 치은 염증과 뼈 손실을 생성하기 위해 인간의 치주 병원균의 수많은 경구 접종을 필요로한다. 부가적으로, 일반적으로 뮤린 코멘탈 경구식물군(25)을전복시키는 항생제 치료 기간에 선행된다. 이 모델은 종종 경구 관력을 안전하게 수행하기 위해 전문 교육을 필요로하며, 보다 복잡한 인간 구강 미생물군유전체에서 치주 병원균의 작은 부분만을 사용하며 폐포 뼈 손실을 확립하는 데 몇 개월이 필요합니다.
대조적으로, 화학적으로 유도된 뮤린 모델은 치주골손실을유도하기 위해 수개월에 걸쳐 대장염의 뮤린 모델을 확립하는데 일반적으로 사용되는 제제인 트리트리트로벤젠 설포닉산(TNBS) 또는 덱스트론 설페이트 나트륨(DSS)의 경구 전달을 이용한다. 구강 내 및 외 농양 기반 모델을 사용할 수 있습니다., murine 앞니와 도르섬의 조직 뿐만 아니라 calvarium, 각각 포함. 이전 농양 모델에서, 박테리아의 여러 주사를 관리, 여러 치은 농양과 폐포 뼈 손실의 땅을 만드는, PD의 연구에서 사용을 제한. 후자의 농양 모델은 구강 외부의 부위에서 세균 독성, 염증 및 뼈 흡수를 연구하는 데 훨씬 더 적법하며, 치주 및 구강 미생물군유전체27,28,29,30,31의평가를 제거합니다.
치주염의 합자 유도 모델을 사용하여, 편조 실크 봉합사는 일반적으로 두 번째 대구치 주위에 둘레에 설치되었습니다. 대안으로, 봉합사 재료의 단일 선형 세그먼트는 제 1 및 제 2 대구치(32,33)사이에 삽입 될 수있다. 합자 배치의 목표는 치은 황치 내에서 박테리아 축적을 촉진하고 이영양증을 생성하여 치주 조직을 구성하고 치주 조직을 파괴하는 것입니다. 가장 주목할 만한 것은, 이 모델은 보다 일반적으로 사용되는 구강 관위모델(34)에비해 훨씬 더 많은 폐포 뼈 손실을 생성할 수 있다. 경구 위장 모델의 사용을 더욱 복잡하게 하는 것은 폐포 골 손실을 개발하는 마우스의 여러 균주 (즉, C57BL/6)에 의한 자연적인 저항이다. 이것은 또한 문제가, 이 균주는 가장 자주 뮤린 기반 동물 연구에서 사용으로35.
마르케산 외 및 아베 와 하지셴갈리스가 기술한 기존 절차는 합자33,36을배치하는 기술적 행위를 단순화하기 위해 고안되었다. 안타깝게도, 이전 프로토콜은 전문적인 3D 프린팅 장비를 필요로 하며 조기 합자 손실 가능성을 가지고 있어 동물 사용과 수술실에서 소요되는 추가 시간과 관련된 비용을 증가시게 됩니다. 더욱이, 두 프로토콜 모두 연구에 사용할 수 있는 병에 걸린 치주소의 작은 영역만생성한다.
이 기술로 거짓말하는 이점은 치주체를 지배하는 경구 dysbiosis 및 면역학의 동시 연구, 다양한 유전 적 배경을 가진 저비용 동물의 활용, 간단한 주거 및 축산 관행에 근거를 두었습니다. 따라서, 목표는 병에 걸린 조직의 양을 최대화하고, 동물 연구에서 감소의 원리를 실천하기 위해, 가능한 한 낮은 수준으로 동물 소비를 감소시키는 것이어야한다. 이를 위해서는 모든 동물이 실험 분석37에포함될 수 있도록 보장해야 합니다. 그러나 치주 질환의 동물 모델이 활용되더라도 인간 PD 병리생리학의 모든 요소를 포괄하는 단일 모델은 없다는 점에 유의해야합니다.
이 새로운 프로토콜은 대부분의 실험실에서 발견되는 계측 및 재료를 사용하여 여러 상악 몰 치아 주위에 합자의 배치를 사용합니다. 그것은 쉽고 자신있게 조기에 avulsss 가능성이 합자를 설치하는 충분한 시간을 허용합니다. 마지막으로, PMN이 PD에서 치주체의 파괴를 조정함에 따라, 인간과 유사한 방식으로 경구 호중구를 회복하는 새로운 방법론도 제시된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

뮤린 모델을 활용한 치주 질환의 병리생리학을 연구하는 주요 장점은 동물의 비용 절감, 유전자 변형 균주의 배열, 수확 된 부드럽고 단단한 조직에서 수행 할 수있는 방대한 수의 분석입니다. 그러나 이러한 시스템 중 상당수는 절차적 비판을 받습니다. 대안으로, 치주 유발 모델인 치주 질환은 국부적으로 개발 및 보유되는 이영양성 경구 미생물군유전체의 개발 및 보존에 의해 구동되며, 이는 급속히 유도되고 비교적 신뢰할 수 있는 것으로 채택될 수 있다. 불행히도, 합자 유도 뮤린 치주염 프로토콜의 변이체는 치주암의 초점 영역으로 격리되고 설치된 합자의 조기 avulsion을 받습니다. 이것은 후속 분석에 사용할 수 있는 조직의 양을 최소화하고 연구에 필요한 동물의 수를 증가시킵니다. 이 프로토콜은 앞서 언급한 것을 완화하는 대안적인 접근을 가진 마우스에 있는 경구 호중구를 복구하기 위하여 새로운 헹구 기술의 향상한 보유 그리고 사용으로 확장한 몰 합자를 두는 것을 요구하는 정확한 조작을 기술합니다 기술적 과제에 대한

나이브(도3A)와염증(도3B)뮤린구강이 합자 유발 치주염에 이차적인 경구 헹구 샘플로부터의 대표적인 유동 세포분석 데이터가 제공된다. 설치된 합자로부터의 PMN의 회수도입증된다(도 3C). 유동 세포계 채널 전압을 수동으로 보정하고 단일 스테인드 보정 비드로 보정을 수행하였다. PMN은 Ly6G<s...

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Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

이 문서는 여러 상악 골치와 관련된 뮤린 치주염의 합자 유발 모델을 확립하기위한 프로토콜을 제시, 후속 분석뿐만 아니라 감소 동물 사용에 대한 관련 치은 조직과 뼈의 더 큰 영역의 결과. 인간 피험자와 유사한 방식으로 경구 호중구를 평가하는 기술도 설명되어 있다.

구강 호중구의 평가를 위한 뮤린 치주염의 강력한 합자 유도 모형

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

여기에 설명된 프로토콜은 인간 참가자와 유사한 방식으로 치주 질환의 합자 유도 동물 모델 내에서 경구 호중구를 연구하는 방법을 가진 조사자를 furnishes. 이 기술의 주요 장점은 동물 사용을 감소시키는 후속 분석에 사용할 수있는 염증진 기발 조직의 증가 볼륨에 의해 강조된다. 치아 주변에서 생물막 코팅 합자를 회수하는 능력은 국소화 된 치주 질환의 효과적인 치료를 시뮬레이션 할 수 있습니다.이 모형의 사용은 염증이 있는 gingival 조직의 증가한 지역 때문에 동물 모형에 있는 치주염의 체계적인 효력의 연구 결과에서 적용될 수 있었습니다. 미세 수술 기구및 해부 현미경의 사용에 익숙해지고, 살아있는 동물 과목을 취급하기 전에 외과 의사의 매듭을 묶는 것은 무겁게 조언됩니다. 이 기술의 시각적 데모는 능숙한 합자 배치를 달성하는 데 필요한 학습 곡선의 길이를 줄이는 데 중요합니다.절차를 시연하는 것은 제 실험실대학원생인 제프 채드윅이 될 것입니다. 가열 된 수술 플랫폼에 마우스를 배치하여 시작합니다. 마우스가 제대로 마취되도록 한 후 탄성 밴드를 사용하여 열린 위치에서 맥실라와 하악을 안정화시하십시오.목을 면롤로 프롭하여 맥실라를 수평 자세로 유지하고 몸과 꼬리를 덮어 열 손실을 완화합니다. 구강 위에 원하는 배율 및 조명에 수술 현미경을 배치합니다. 스플린터 집게를 사용하여 Gingival sulcus 내에 M1 및 M2 상악 골어 질 어금니 주위에 멸균 50 또는 작은 편조 실크 봉합사를 설치합니다.정전의 팔성 측에 봉합사의 탈모꼬리를 배치하고 M2와 M3의 접촉 사이에 근접 세그먼트를 삽입한다. 그런 다음 M2의 부칼 표면을 감싸M1과 M2의 접촉 사이에 삽입합니다. 봉합사의 양쪽 끝이 단단히 당겨져 깅지발 설커스로 운전하십시오. 윤곽높이 아래 M1 주위의 근위 봉합사 세그먼트를 감싸고 M1과 M2의 접촉 사이에 삽입합니다. 봉합사의 근근 꼬리를 단단히 당기면 모든 여유를 제거합니다. 봉합사의 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶고 꼬리를 가능한 한 일종의 다듬습니다.상악 상골 치열의 팔탈 측에 M1과 M2 사이의 칭기질 방출에 매듭을 놓습니다. 합자를 고정하는 데 사용되는 매듭이 안전하고 동물을 자극하거나 매스틱을 방해하지 않는 위치에 있는 것이 중요합니다. 합자 설치 후, 수술 장치에서 마우스를 제거하고 열 램프 아래 깨끗한 케이지에 배치, 완전히 복구 될 때까지 모니터링해야합니다.각 동물 피사체 사이에 뜨거운 유리 비드 멸균기에서 수술 기구를 살균. 각 마우스를 적절한 환경 농축물로 개별적으로 수용하고 7~11일 동안 온도 및 습도 제어 환경에서 여과된 물과 으깬 표준 차우에 대한 광고 리비툼 액세스를 허용합니다. 샘플을 수집할 준비가 되면 파이펫을 사용하여 칼슘과 마그네슘없이 섭씨 4도의 100 마이크로리터로 구강을 헹구는 데 사용합니다.헹구기를 두 번 더 반복하여 각 동물에 대해 동일한 15 밀리리터 원미 살균 테스트 튜브에 헹구십시오. 40 마이크로미터 나일론 메쉬 필터를 통해 각 15 밀리리터 튜브의 내용을 50 밀리리터 원내 튜브로 실행하고, 새로운 15 밀리리터 테스트 튜브로 여과물을 전송한다. 시료 고정을 용이하게 하기 위해 16%의 파라포름알데히드의 33.3 마이크로리터를 추가합니다.샘플을 즉시 소용돌이치고 15 분 동안 얼음에 배양하십시오. Paraformaldehyde는 프로토콜에 사용되는 가장 위험한 시약이며 제조업체가 권고하는 권장 개인 보호 장비로 처리해야합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 PBS로 15 밀리리터로 채운 다음 원심분리기는 1000xg, 섭씨 4도에서 5분간 채웁니다.슈퍼나탈자를 흡습하고, FACS 버퍼 1밀리리터에서 4밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 혈종계 또는 자동 세포 카운터에서 세포를 계산한다. 원심분리를 반복하고 상신을 흡인한다. 이어서, FACS 버퍼의 50마이크로리터당 500, 000~100만 개의 세포의 최종 농도에 대해 적절한 양의 FACS 버퍼로 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포를 FACS 튜브로 이송한다.쥐 혈청 1편과 항마우스 IGG 항체 2마이크로리터를 샘플의 50마이크로리터에 추가합니다. 샘플을 즉시 소용돌이치며 20분 동안 얼음위를 차단합니다. 그런 다음, 각 샘플에 적절한 항체를 추가한다.소용돌이와 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양. 인큐베이션 후, 1밀리리터의 FACS 버퍼, 소용돌이, 원심분리기 1밀리리터로 샘플을 1000xg 및 섭씨 4도에서 5분간 세척합니다. 상체를 덤프하고 FACS 튜브의 개방을 부드럽게 차단합니다.세척을 두 번 반복한 다음 보관을 위해 FACS 버퍼 250 마이크로리터에서 샘플을 다시 일시 중단합니다. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고 알루미늄 호일로 감싸고 분석 할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 유동 세포측정은 순진한 마우스로부터 경구 헹구린 에서 회수된 호중구뿐만 아니라 합자 유발 치주염을 가진 마우스로부터 경구 헹구고 회수된 합자를 분석하는 데 사용되었다.폐포 골 손실을 평가하기 위해, 폐포 골 수준은 건강하고 결찰된 마우스를 위한 cementoenamel 접합에 폐포 뼈 문장에서 측정되었습니다. 그런 다음 측정 차이를 계산했습니다. 여기서 검토되지는 않았지만, 조직병리학, 면역조직화학적, 및 치주및 폐포뼈의 형태성 평가도 연구 질문에 따라 수행될 수 있다.이 모델은 현재 내 실험실에서 전신 건강과 질병에 대한 경구 선천적 면역 체계의 효과를 연구하는 데 사용되고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

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연구

면역학 및 감염병학

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