Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
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J. W. C. é apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Chunxiang Sun por sua ajuda na realização da coloração azul trypan.

Todos os estudos de urina cumpriram os regulamentos éticos relevantes e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de Toronto e pelo Research Ethics Board (Protocol 20011930).
1. Instalação da ligadura
NOTA: Este é um procedimento cirúrgico não-estéril que pode ser realizado em uma sala de cirurgia padrão. O uso de animais livres de germes (não cobertos aqui) exige o manuseio dentro de um armário de biossegurança, o uso de instrume...

O elemento mais crítico associado ao uso do modelo de periodontite induzido pela ligadura murine é centrado em torno da retenção da ligadura até o momento do sacrifício ou remoção intencional. A ligadura biofilme-retentive instalada é capaz de induzir uma perda significativa de altura alveolar do osso em tão poucos quanto 6 dias, platô entre o período de 11-16 dias39. A decisão de sacrificar indivíduos animais antes do período máximo de perda óssea, tornando este um modelo muito m...

A doença periodontal (DP) é uma condição osteolítica associada à morbidade hospedeira significativa e carga econômica, que se manifesta pela inflamação gingival e perda de apego de tecidos moles e suporte osseoso para a dentição afetada1,2,3,4. Este processo é regido por interações entre a microbiota oral e o sistema imunológico inato do hospedeiro. Também está associada à exacerbação de outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer5,6,7,8. Historicamente, foi a hipótese de que a patogênese pd é dependente de grandes quantidades de bactérias específicas, como Porphyromonas gingivalis9. No entanto, evidências recentes sugerem que o componente microbiano da DP é mediado pelo biofilme odontológico. O biofilme é uma comunidade organizada e complexa de inúmeros microrganismos que podem existir em estados disbióticos e disbióticos saudáveis10,11. O biofilme oral normalmente oferece resistência ao hospedeiro, impedindo o estabelecimento de focos de bactérias patogênicas e promove a estrutura e função ideal do tecido gingival através da regulação da resposta imune do hospedeiro12,13. Perturbações da relação equilibrious entre organismos comensal dentro da cavidade oral e do sistema imunológico hospedeiro podem levar a alterações na homeostase tecidual, resultando em disbacteriose e desenvolvimento das aparências clínicas e radiográficas de marca registrada de PD5,10,12,13,14.
Curiosamente, o estabelecimento de uma disbacteriose oral, embora necessária para o início da DP, não é suficiente para conduzir a DP em todos os indivíduos, iludindo-se para a capacidade da resposta imune do hospedeiro para subverter a transição da microbiota entre os estados simbióticos e disbióticos15. Isso coloca um foco particular sobre os meios através dos quais a DP influencia um dos personagens principais do sistema imunológico inato, ou seja, o granulocito polimorfóide (PMN), ou neutrófilo, a partir de perspectivas locais e sistêmicas16,17.
Em seres humanos, PMNs são recrutados a partir da circulação a uma taxa de ~ 2 x 106 células / h em tecidos conectivos periodontais saudáveis, onde são a população de leukócitos predomáveis. Aqui, eles são posteriormente expulsos do sulco gingival na cavidade oral como um componente do líquido crevicular gingival. Na presença de DP, a neufilia se manifesta dentro da circulação e da cavidade oral, onde essas células efetoras possuem um fenótipo hiperinflamatório que leva à destruição acima mencionada do periodontium17,18,19,20,21,22. Portanto, entender o papel das PMNs na DP e em outras condições inflamatórias sistêmicas é de extrema importância.
Embora seja amplamente aceito que as doenças crônicas estejam reciprocamente ligadas à DP, os mecanismos subjacentes ainda não foram elucidados, contribuindo para dificuldades na gestão dessas condições sistêmicas mórbidas e potencialmente fatais. Vários modelos animais experimentais, cada um com vantagens e desvantagens únicas, têm sido utilizados para estudar a fisiopatologia da DP23,24. Concentrando-se especificamente em modelos de urina, há uma variedade de protocolos através dos quais o estudo da DP é facilitado; no entanto, possuem várias deficiências técnicas e fisiométricas25,26,27,28,29,30,31.
Primeiro, o modelo oral do rato do gavage exige inoculations orais numerosos de micróbios patogénicos periodontais humanos para gerar a inflamação do gingival e a perda do osso. Além disso, é geralmente precedido por um período de tratamento antibiótico para subverter a flora oral murine commensal25. Este modelo muitas vezes requer treinamento especializado para realizar com segurança o gavage oral, usa apenas uma pequena fração de patógenos periodontais do microbioma oral humano mais complexo e requer vários meses para estabelecer a perda de ossos alveolares.
Em contraste, modelos de urina quimicamente induzida utilizam a entrega oral de ácido sulfonic trinitrobenzene (TNBS) ou sódio de sulfato dextran (DSS), agentes comumente usados no estabelecimento de modelos de colite murina durante um período de vários meses para induzir a perda de ossos periodontais26. Modelos à base de abscesso intraoral e extraoral estão disponíveis, que envolvem os incisivos e tecidos de urina do dorsum, bem como calvarium, respectivamente. No antigo modelo abscesso, várias injeções de bactérias são administradas, criando múltiplos abcessos gingival e uma escassez de perda óssea alveolar, limitando seu uso no estudo da DP. Os últimos modelos de abscesso são significativamente mais aptos a estudar a virulência bacteriana, inflamação e resorção óssea em locais fora da cavidade oral, o que elimina a avaliação do periodontium e microbioma oral27,28,29,30,31.
Usando o modelo de periodontite induzido por ligadura, uma sutura de seda trançada tem sido comumente instalada circunferentemente em torno do segundo molar. Como alternativa, um único segmento linear de material de sutura pode ser inserido entre o primeiro e o segundo molares32,33. O objetivo da colocação da ligadura é facilitar o acúmulo bacteriano e gerar disbiose dentro dos sulci de gingival, resultando na inflamação do tecido periodontal e na destruição dos tecidos que compõem o periodontium. Mais notavelmente, este modelo é capaz de produzir significativamente mais perda óssea alveolar em comparação com o modelo de gavage oral34mais comumente usado. Complicando ainda mais o uso do modelo de gavage oral é a resistência natural por várias cepas de camundongos (ou seja, C57BL/6) ao desenvolvimento de perda óssea alveolar. Isso também é problemático, pois esta cepa é a mais utilizada na pesquisa animal baseada em urina35.
Os procedimentos existentes descritos por Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis foram concebidos para simplificar o ato técnico de colocar a ligadura33,36. Infelizmente, o protocolo anterior requer equipamentos especializados impressos em 3D e possuem o potencial de perda de ligadura prematura, aumentando assim o uso de animais e os custos associados ao tempo adicional gasto na sala de cirurgia. Além disso, ambos os protocolos geram apenas pequenas regiões do periodontium doente disponíveis para um estudo.
As vantagens que se encontram com esta técnica baseiam-se no estudo simultâneo da disbiose oral e imunologia que regem o periodontium, utilização de animais de baixo custo com diversas origens genéticas e práticas simples de habitação e pecuária. Como tal, os objetivos devem ser maximizar os volumes de tecidos doentes e, na tentativa de praticar os princípios de redução da pesquisa animal, reduzir o consumo animal a um nível tão baixo quanto possível. Isso requer garantir que todos os animais sejam capazes de serem incluídos nas análises experimentais37. No entanto, deve-se notar que não importa qual modelo animal de doença periodontal é utilizado, não há um único modelo que abrange todos os elementos da fisiopatologia da DP humana.
Este novo protocolo emprega a colocação de uma ligadura em torno de vários dentes molar maxiares usando instrumentação e materiais que são encontrados na maioria dos laboratórios. Permite uma quantidade de tempo suficiente instalar facilmente e confiàvelmente uma ligadura que seja pouco susceptível de avulse prematuramente. Finalmente, à medida que as PMNs coordenam a destruição do periodontium em PD, também é apresentada uma nova metodologia para recuperar neutrófilos orais de forma análoga aos seres humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

As principais vantagens do estudo da fisiopatologia da doença periodontal utilizando modelos de urina são o custo reduzido dos animais, a variedade de cepas geneticamente modificadas, o grande número de análises que podem ser realizadas em tecidos macios e duros colhidos. No entanto, muitos destes sistemas estão sujeitos a críticas processuais. Como alternativa, o modelo induzido pela ligadura da doença periodontal, impulsionado pelo desenvolvimento localizado e retenção de um microbioma oral disbiótico, pode ser empregado, o que é rapidamente induzido e relativamente confiável. Infelizmente, as variantes do protocolo de periodontite murine induzida por ligadura são isoladas para regiões focais do periodontium e sujeitas à avulsão prematura da ligadura instalada. Isso minimiza a quantidade de tecido disponível para análises subsequentes e aumenta o número de animais necessários para estudo. Este protocolo descreve as manipulações precisas necessárias para colocar ligaduras molar estendidas com melhor retenção e uso de uma nova técnica de lavagem para recuperar neutrófilos orais em camundongos com uma abordagem alternativa que atenua o referido desafios técnicos.

Dados representativos de citometria de fluxo de amostras de lavagem oral de uma ingênua(Figura 3A)e inflamado(Figura 3B) murine cavidade oral secundária à periodontite induzida pela ligadura são fornecidos. A recuperação de PMNs de uma ligadura instalada também é demonstrada(Figura 3C). As tensões do canal do cytometer do fluxo foram calibradas manualmente, e a compensaçã...

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Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Este artigo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo induzido por ligadura de periodontite murine envolvendo múltiplos molares maxilars, resultando em áreas maiores do tecido gingival envolvido e osso para análise posterior, bem como redução do uso animal. Uma técnica para avaliar neutrófilos orais de uma forma análoga aos seres humanos também é descrita.

Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

O protocolo descrito aqui fornece aos pesquisadores um método para estudar neutrófilos orais dentro de um modelo animal induzido por ligadura de doença periodontal de forma análoga aos participantes humanos. A principal vantagem dessa técnica é destacada pelo aumento do volume de tecidos gengival inflamados disponíveis para análise posterior, o que reduz o uso de animais. Nossa capacidade de recuperar as ligaduras revestidas de biofilme ao redor dos dentes permite a simulação de um tratamento eficaz de uma doença periodontal localizada.O uso desse modelo poderia ser aplicado no estudo dos efeitos sistêmicos da periodontite em um modelo animal, devido ao aumento das áreas de tecidos gengival inflamados. A familiarização com o uso de instrumentos microcirúrgicos e microscópios de dissecção, bem como amarrar nós do cirurgião antes de manusear os animais vivos, é altamente aconselhável. A demonstração visual desta técnica é fundamental para reduzir o comprimento da curva de aprendizagem necessária para alcançar a colocação de ligaduras proficientes.Demonstrando o procedimento será Jeff Chadwig, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece posicionando o mouse em uma plataforma cirúrgica aquecida. Depois de garantir que o mouse esteja devidamente anestesiado, estabilize a maxila e a mandíbula na posição aberta usando bandas elásticas.Apoie o pescoço com um rolo de algodão para manter a maxila em uma posição horizontal e cubra o corpo e a cauda para mitigar a perda de calor. Posicione o microscópio cirúrgico na ampliação desejada e iluminação sobre a cavidade oral. Use fórceps de lasca para instalar uma sutura de seda trançada estéril ou menor ao redor dos molares maxilares M1 e M2 dentro do sulco gengival.Posicione a cauda distal da sutura no lado palatal da dentição e insira o segmento proximal entre o contato de M2 e M3. Em seguida, enrole-o em torno da superfície bucal de M2 e insira-o entre o contato de M1 e M2. Certifique-se de que ambas as extremidades da sutura são puxadas firmemente para conduzi-la para o sulco gengival. Enrole o segmento de sutura proximal em torno de M1 abaixo de sua altura de contorno e insira-o entre o contato de M1 e M2. Puxe a cauda proximal da sutura firmemente para remover toda a folga. Amarre as extremidades da sutura com o nó de um cirurgião e corte as caudas o mais patria possível.Coloque o nó na embrasure gengival entre M1 e M2 no lado palatal da dentição maxilar. É fundamental que o nó usado para fixar a ligadura seja seguro e em posição onde não irrite o animal ou interfira na mastigação. Após a instalação da ligadura, remova o mouse do aparelho cirúrgico e coloque-o em uma gaiola limpa sob uma lâmpada de calor, certificando-se de monitorá-lo até que esteja totalmente recuperado.Esterilize os instrumentos cirúrgicos no esterilizador de contas de vidro quente entre cada sujeito animal. Abriga individualmente cada rato com o enriquecimento ambiental adequado e permite o acesso ad libitum à água filtrada e purê de comida padrão em um ambiente controlado por temperatura e umidade por sete a 11 dias. Quando estiver pronto para coletar amostras, use uma pipeta para enxaguar a cavidade oral com 100 microliters de PBS de quatro graus Celsius esterilizados sem cálcio e magnésio por 10 segundos.Repita a lavagem mais duas vezes, colocando cada enxágue no mesmo tubo de ensaio estéril cônico de 15 mililitros para cada animal. Execute o conteúdo de cada tubo de 15 mililitros através de um filtro de malha de nylon de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, e transfira o filtrado para um novo tubo de ensaio de 15 milímetros. Adicione 33,3 microliters de 16% de paraformaldeído para facilitar a fixação da amostra.Vórtice as amostras imediatamente e incuba-as no gelo por 15 minutos. O paraformaldeído é o reagente mais perigoso empregado no protocolo e deve ser manuseado com os equipamentos de proteção individual recomendados pelo fabricante. Após a incubação, encha o tubo a 15 mililitros com PBS e depois centrifuá-lo a 1000xg e quatro graus Celsius por cinco minutos.Aspire o supernatante, suspenda a pelota em um mililitro de tampão FACS a quatro graus Celsius e conte as células em um hemocitómetro ou contador celular automatizado. Repita a centrifugação e aspire o supernatante. Em seguida, suspenda novamente a pelota celular em um volume apropriado de tampão FACS para uma concentração final de 500.000 a 1 milhão de células por 50 microliters de tampão FACS e transfira as células para o tubo FACS.Adicione um microliter de soro de rato e dois microliters de anticorpo iGG anti-rato a 50 microliters da amostra. Vórtice a amostra imediatamente e bloqueá-la no gelo por 20 minutos. Em seguida, adicione os anticorpos apropriados a cada amostra.Vórtice e incubar no gelo por 30 minutos no escuro. Após a incubação, lave as amostras com um mililitro de tampão FACS, vórtice brevemente e centrífuga por cinco minutos a 1000xg e quatro graus Celsius. Despeje o supernatante e bloqueie suavemente a abertura do tubo FACS.Repita a lavagem duas vezes e suspenda novamente as amostras em 250 microliters de tampão FACS para armazenamento. Cubra os tubos com filme de parafina, enrole-os em papel alumínio e armazene-os a quatro graus Celsius até que estejam prontos para analisar. A citometria de fluxo foi usada para analisar neutrófilos recuperados de uma lavagem oral de um rato ingênuo, bem como uma lavagem oral e ligadura recuperada de um camundongo com periodontite induzida por ligadura.Para avaliar a perda óssea alveolar, os níveis ósseos alveolares foram medidos desde a crista óssea alveolar até a junção de cimentoenamel para camundongos saudáveis e ligados. Em seguida, foram calculadas as diferenças de medição. Embora não seja revisada aqui, a avaliação histopatológica, imunohistoquímica e morfométrica do osso periodontium e alveolar também pode ser realizada dependendo da questão da pesquisa.Este modelo está sendo usado em meu laboratório para estudar os efeitos do sistema imunológico inato oral na saúde sistêmica e na doença.

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