Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils at JoVE.com

JW C. поддерживается Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR). Авторы хотели бы поблагодарить доктора Chunxiang Sun за ее помощь в выполнении трипан синий окрашивания.

Все исследования по изучению морина соответствовали соответствующим этическим нормам и были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Торонто и Советом по этике исследований (Protocol 20011930).
1. Установка лигатуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нестерильная хирур...

Наиболее важный элемент, связанный с использованием мурин лигатуры индуцированной модели пародонтита сосредоточена вокруг удержания лигатуры до времени жертвоприношения или преднамеренного удаления. Установленная биопленка-ретентивная лигатура способна вывешить значительную пот...

Пародонта (PD) является остеолитикическое состояние, связанное со значительной заболеваемости хозяина и экономической нагрузки, которая проявляется воспаление десивов и потеря как мягких тканей и косой поддержки для пострадавших зубной протез1,2,4. Этот процесс регулируется взаимодействиями между оральной микробиотой и врожденной иммунной системой хозяина. Это также связано с обострением других системных воспалительных заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания, и рак5,6,7,8. Исторически сложилось так, было гипотеза, что PD патогенеза зависит от большого количества конкретных бактерий, таких как Porphyromonas gingivalis9. Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что микробный компонент PD опосредовано стоматологической биопленки. Биопленка представляет собой организованное, сложное сообщество многочисленных микроорганизмов, которые могут существовать в здоровых симбиотических и разрушительных дисбиотических состояниях10,11. Устные биопленки обычно обеспечивает устойчивость к хозяину, предотвращая создание очагов патогенных бактерий и способствует идеальной структуре и функции тканей десивной ткани путем регулирования иммунного ответа хозяина12,13. Возмущения равновесных отношений между commensal организмов в полости рта и принимающей иммунной системы может привести к изменениям в ткани гомеостаза, в результате дисбактериоза и развития отличительной клинической и радиографической видимости PD5,10,12,13,14.
Интересно, что создание устной дисбактериоз, хотя и требуется для начала PD, не является достаточным для привода PD во всех людей, ускользая от способности хозяина иммунный ответ, чтобы подорвать переход микробиоты между симбиотических и дисбиотических состояний15. Это ставит особое внимание на средства, с помощью которых PD влияет на одного из ведущих персонажей врожденной иммунной системы, а именно полиморфонуклеарные гранулоциты (PMN), или нейтрофилов, с местной и системной точки зрения16,17.
У людей, PMNs набираются из циркуляции в размере 2 х 106 клеток / ч в здоровых соединительных тканей пародонта, где они являются преобладающей популяции лейкоцитов. Здесь они впоследствии вытесняются из слизи gingival в полость рта в качестве компонента кревикулярной жидкости. При наличии PD, нейтрофилии проявляется в циркуляции и полости рта, где эти клетки-эффекторы обладают гипервоспалительным фенотипом, что приводит к вышеупомянутому разрушению пародонта17,18,19,20,21,22. Поэтому понимание роли ПМН в ПД и других системных воспалительных заболеваниях имеет первостепенное значение.
Хотя широко признается, что хронические заболевания взаимно связаны с PD, основные механизмы еще предстоит выяснить, что усугубляет трудности в управлении этими болезненными и потенциально смертельными системными условиями. Несколько экспериментальных моделей животных, каждый с уникальными преимуществами и недостатками, были использованы для изучения патофизиологии PD23,24. Сосредоточение особого внимания на моделях мурин, существуют различные протоколы, с помощью которых облегчается изучение PD; однако, они обладают несколькими техническими и физиологичными недостатками25,26,27,28,29,30,31.
Во-первых, устные gavage мыши модель требует многочисленных устных прививок человеческих пародонтальных патогенов для создания воспаления десяна и потери костной массы. Кроме того, как правило, предшествует период лечения антибиотиками, чтобы подорвать минрин комменсальной оральной флоры25. Эта модель часто требует специализированной подготовки, чтобы безопасно выполнять устные gavage, использует лишь небольшую часть пародонтальных патогенов из более сложных человеческих устных микробиома, и требует нескольких месяцев, чтобы установить альвеолярной потери костной массы.
В отличие от этого, химически индуцированных морин модели использовать устные доставки тринитробензена сульфоновой кислоты (TNBS) или декрен сульфат натрия (DSS), агенты обычно используются в создании мочеиспускательных моделей колита в течение нескольких месяцев, чтобы вызвать пародонтальной потери костной массы26. Доступны внутриоральные и экстраоральные модели на основе абсцесса, которые включают в себя резцы и ткани мины на сум, а также кальварий, соответственно. В бывшей модели абсцесса, несколько инъекций бактерий вводят, создавая несколько деснных абсцессов и недостаток альвеолярной потери костной массы, ограничивая их использование в изучении PD. Последние абсцесс модели значительно более склонны к изучению бактериальной вирулентности, воспаления и резорбции костей на участках за пределами полости рта, что исключает оценку пародонта и орального микробиома27,28,29,30,31.
Используя модель пародонтита, индуцированная лигатурой, плетеный шелковый шов обычно устанавливался по окружности вокруг второго моляра. В качестве альтернативы можно вставить один линейный сегмент шовного материала между первым и вторым молярами32,33. Цель размещения лигатуры заключается в облегчении бактериального накопления и генерации дисбактериоза в сульчи десен, что приводит к воспалению пародонтальной ткани и разрушению тканей, составляющих пародонт. Наиболее примечательно, что эта модель способна производить значительно больше альвеолярной потери костной массы по сравнению с более часто используемым устным gavage модель34. Еще более осложняет использование пероральной модели gavage является естественное сопротивление нескольких штаммов мышей (т.е., C57BL/6) к развитию альвеолярной потери костной массы. Это также проблематично, так как этот штамм является наиболее часто используемым в мурин основе исследований животных35.
Существующие процедуры, описанные Marchesan et al. и Абэ и Гаджишенгаллис были разработаны для упрощения технического акта размещения лигатуры33,36. К сожалению, прежний протокол требует специализированного 3D-печатного оборудования и обладает потенциалом для преждевременной потери лигатуры, тем самым увеличивая использование животных и затраты, связанные с дополнительным временем, затрачиваемым в операционной. Кроме того, оба протокола генерируют лишь небольшие области больного пародонтия, доступные для исследования.
Преимущества, которые лежат с этой техникой основываются в одновременном изучении перорального дисбактериоза и иммунологии, которые регулируют пародонтум, использование недорогих животных с разнообразным генетическим образованием, а также простое жилье и методы ведения земледелия. Таким образом, цели должны заключаться в максимизации объемов заболеваний тканей и, в попытках практиковать принципы сокращения исследований на животных, снизить потребление животных до максимально низкого уровня. Это требует обеспечения того, чтобы все животные могут быть включены в экспериментальные анализы37. Однако следует отметить, что независимо от того, какая животное модель пародонта используется, нет единой модели, которая охватывает каждый элемент патологиологии PD человека.
Этот новый протокол использует размещение лигатуры вокруг нескольких челюстно-лицевых молочных зубов с использованием приборов и материалов, которые находятся в большинстве лабораторий. Это позволяет достаточное количество времени, чтобы легко и уверенно установить лигатуру, которая вряд ли avulse преждевременно. Наконец, по мере того, как ПМН координируют разрушение пародонта в PD, также представлена новая методология восстановления пероральных нейтрофилов, аналогичная людям.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

Основными преимуществами изучения патофизиологии пародонтального заболевания с использованием мочек морин являются снижение стоимости животных, массив генетически модифицированных штаммов, огромное количество анализов, которые можно проводить на собранных мягких и твердых тканях. Однако многие из этих систем подвергаются процедурной критике. В качестве альтернативы может быть использована модель пародонта, вызванная локализованным развитием и сохранением дисбиотического микробиома полости рта, которая быстро индуцирована и относительно надежна. К сожалению, варианты протокола пародонта, индуцированного лигатурой, изолированы в координационных регионах пародонта и подвержены преждевременному авруции установленной лигатуры. Это сводит к минимуму количество тканей, доступных для последующего анализа и увеличивает количество животных, необходимых для изучения. Этот протокол описывает точные манипуляции, необходимые для размещения расширенных моляровских лигатур с улучшенным удержанием и использованием новой техники смыва для восстановления пероральных нейтрофилов у мышей с альтернативным подходом, который смягчает вышеупомянутые технических проблем.

Представитель потока цитометрии данные из устных промыть образцы наивной(Рисунок 3А) и воспаленной(Рисунок 3B) мурин полости рта вторичной лигатуры индуцированного пародонтита предоставляются. Также демонстрируется восстановление ПМ...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils at JoVE.com

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

В этой статье представлен протокол для создания лигатуры индуцированной модели мурин пародонтита с участием нескольких челюстно-лицевой моляров, в результате чего большие области участвующих десен ткани и кости для последующего анализа, а также сокращение использования животных. Также описан метод оценки пероральных нейтрофилов по аналогии с человеческими субъектами.

Надежная Лигатура индуцированной модели Мурин пародонтит для оценки устных нейтрофилов

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Протокол, описанный здесь предоставляет следователям метод для изучения устных нейтрофилов в лигатуре индуцированной животной модели пародонта в аналогичной манере для человеческих участников. Основное преимущество этого метода подчеркивается увеличением объема воспаленных тканей десен, доступных для последующего анализа, что снижает использование животных. Наша способность извлекать лиготуры с покрытием биопленки со всего зуба позволяет смеять эффективное лечение локализованной пародонтальной болезни.Использование этой модели может быть применено в изучении системного воздействия пародонтита в животной модели, в связи с увеличением областей воспаленных тканей десен. Знакомство с использованием микрохирургических инструментов и рассечения микроскопов, а также связывание узлов хирурга до обработки живых животных субъектов, в значительной степени рекомендуется. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение в сокращении длины кривой обучения, необходимой для достижения профессионального размещения лигатуры.Демонстрацией процедуры будет Джефф Чадвиг, аспирант из моей лаборатории. Начните с позиционирования мыши на нагретой хирургической платформе. После обеспечения правильной анестезии мыши стабилизуйте челюсти и челюсти в открытом положении с помощью резинки.Поддерживайте шею ватным тампоном для поддержания челюсти в горизонтальном положении и покройте тело и хвост, чтобы уменьшить потерю тепла. Распоитите хирургический микроскоп при желаемом увеличении и освещении полости рта. Используйте осколок типсов для установки стерильных 50 или меньше плетеные шелковые швы вокруг M1 и M2 челюсти моляров в gingival sulcus.Распоистите дистальный хвост шва на небальную сторону зубного протеза и вставьте проксимальный сегмент между контактом M2 и M3. Затем оберните его вокруг буккала поверхности M2 и вставьте его между контактом M1 и M2. Убедитесь, что оба конца шва вытащил плотно, чтобы загнать его в gingival sulcus. Оберните проксимальный сегмент шва вокруг M1 ниже его высоты контура и вставьте его между контактом M1 и M2. Потяните проксимальный хвост шва плотно, чтобы удалить все слабину. Свяжите концы шва с узлом хирурга и обрезать хвосты как можно более сортируются.Поместите узел в gingival embrasure между M1 и M2 на дворцовой стороне челюстно-челюстного протеза. Очень важно, чтобы узел, используемый для обеспечения лигатуры является безопасным и в положении, когда он не будет раздражать животное или вмешиваться в mastication. После установки лигатуры снимите мышь с хирургического аппарата и поместите ее в чистую клетку под тепловой лампой, убедившись, что следить за ней до полного выздоровления.Стерилизовать хирургические инструменты в горячем стеклянном стерилизаторе шарика между каждым животным субъектом. Индивидуально дом каждой мыши с соответствующим экологическим обогащением и позволяют ad libitum доступ к фильтрованной воде и пюре стандартных чау в температуре и влажности контролируемой окружающей среды в течение семи до 11 дней. Когда готовы собрать образцы, используйте пипетку для полоскания полости рта с 100 микролитров стерилизованных четырех градусов по Цельсию PBS без кальция и магния в течение 10 секунд.Повторите полоскание еще два раза, поместив каждый полоскания в тот же 15 миллилитр конической стерильной пробирки для каждого животного. Запустите содержимое каждой 15-миллилитровой трубки через 40-метровый нейлоновый фильтр сетки в 50 миллилитровую коническую трубку и перенесите фильтрат в новую 15-миллилитровую пробирку. Добавьте 33,3 микролитера 16%paraformaldehyde для облегчения фиксации выборки.Vortex образцы немедленно и инкубировать их на льду в течение 15 минут. Параформальдегид является наиболее опасным реагентом, используемым в протоколе, и должен обрабатываться с помощью рекомендуемого средства индивидуальной защиты, рекомендованного производителем. После инкубации, заполнить трубку до 15 миллилитров с PBS затем центрифугировать его на 1000xg и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.Аспирировать супернатант, повторно приостановить гранулы в один миллилитр буфера FACS при четырех градусах по Цельсию и подсчитать клетки на гемоцитометре или автоматизированной счетчике клеток. Повторите центрифугирование и аспирировать супернатанта. Затем повторно приостанавливайте ячейку гранул в соответствующем объеме буфера FACS для окончательной концентрации от 500 000 до 1 миллиона ячеек на 50 микролитров буфера FACS и перенесите клетки в трубку FACS.Добавьте один микролитер крысиной сыворотки и два микролитера антител против мыши IGG к 50 микролитров образца. Вихрь образца немедленно и блокировать его на льду в течение 20 минут. Затем добавьте соответствующие антитела к каждому образцу.Вихрь и инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте. После инкубации промойте образцы одним миллилитром буфера FACS, вихрем и центрифугой в течение пяти минут при 1000хг и четырех градусах Цельсия. Свалить супернатант и аккуратно заблокировать открытие трубки FACS.Повторите стирку дважды, а затем повторно приостановить образцы в 250 микролитров буфера FACS для хранения. Обложка трубки с парафиновой пленкой, оберните их в алюминиевую фольгу, и хранить их при четырех градусах по Цельсию до готовности к анализу. Цитометрия потока была использована для анализа нейтрофилов, восстановленных в результате перорального полоскания от наивной мыши, а также перорального полоскания и восстановленной лигатуры у мыши с лиготическим пародонтитом.Для оценки альвеолярной потери костной массы, альвеолярные уровни костей были измерены от альвеолярного костного гребня до цементоанамельского соединения для здоровых и лигатированных мышей. Затем были рассчитаны различия в измерении. Хотя не рассмотрены здесь, гистопатологические, иммуногистохимические, и морфометрическая оценка пародонтия и альвеолярной кости также может быть проведена в зависимости от исследовательского вопроса.Эта модель в настоящее время используется в моей лаборатории для изучения влияния устной врожденной иммунной системы на системное здоровье и болезни.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Аналитический инструмент коробки комплексных биохимические, структурные и транскриптома Оценка устного Биопленки посредничестве Mutans стрептококков

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis в качестве модельного организма для оценки интерактивности анаэробных бактерий с клеток-хозяев

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Устные интубации взрослых рыбок данио: модель для оценки кишечного поглощения биоактивных соединений

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Количественные полимеразной цепной реакции на основе анализ мышиных кишечной микробиоты после устные лечения антибиотиками

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Модель администрирования Galleria mellonella устные Innate иммунных реакций Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

Современное согревающее/удерживающее устройство для эффективных инъекций хвостовых вен в модели грибкового сепсиса мышей

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Индукция пародонтита с помощью комбинации лигатуры и инъекции липополисахарида на крысиной модели

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

A Mouse Ear Model for Allergic Contact Dermatitis Evaluation

Модель уха мыши для оценки аллергического контактного дерматита

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a ...