Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils at JoVE.com

JW C. stöds av den kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR). Författarna skulle vilja tacka Dr Chunxiang Sun för hennes hjälp med att utföra trypan Blåfärgning.

Alla murina studier uppfyllde de relevanta etiska föreskrifterna och godkändes av University of Toronto djur vårds nämnd och forskningsetik nämnden (protokoll 20011930).
1. ligatur installation
Anmärkning: Detta är en icke-sterila kirurgiska ingrepp som kan utföras i en Standard Operating Theater. Användningen av bakteriefria djur (som inte omfattas här) mandat hantering inom ett biosäkerhetsskåp, användning av sterila instrument, och inympning av munhål...

Den mest kritiska elementet i samband med användning av murina ligatur-inducerad modell av parodontit är centrerad kring retention av ligatur fram till tidpunkten för uppoffring eller avsiktlig avlägsnande. Den installerade biofilm-glans ligatur kan inducera en betydande förlust av alveolära benhöjd på så få som 6 dagar, plateauing mellan 11 – 16 dagars period39. Beslutet att offra djur försökspersoner innan den maximala perioden av benförlust, vilket gör detta till en mycket korta...

Parodontit (PD) är ett osteolytiskt tillstånd i samband med betydande värd morbiditet och ekonomisk börda, vilket manifesteras av gingival inflammation och förlust av både mjuk vävnad kvarstad och bendefekter stöd för den drabbade tandbildning1,2,3,4. Denna process styrs av interaktioner mellan den orala bakterieflora och medfödda immunförsvaret hos värden. Det är också förknippat med exacerbation av andra systemiska inflammatoriska sjukdomar inklusive diabetes, hjärt-kärlsjukdom, och cancer5,6,7,8. Historiskt, det var en hypotes om att PD patogenes är beroende av stora mängder av specifika bakterier såsom Porphyromonas gingivalis9. De senaste bevisen tyder dock på att den mikrobiella komponenten i PD förmedlas av den odontologiska biofilmen. Den biofilm är en organiserad, komplex gemenskap av många mikroorganismer som kan existera i friska symbiotiska och destruktiva dysbiotiska stater10,11. Den muntliga biofilm ger normalt motstånd mot värden genom att förhindra inrättandet av Foci av patogena bakterier och främjar ideal gingival vävnad struktur och funktion genom reglering av värden immunsvar12,13. Perturbations av det equilibrious förhållandet mellan kommensaler organismer inom munhålan och värd immunsystemet kan leda till förändringar i vävnad homeostas, vilket resulterar i dysbacteriosis och utveckling av Hallmark kliniska och radiografiska framträdanden av PD5,10,12,13,14.
Intressant, inrättandet av en muntlig dysbacteriosis, samtidigt som krävs för initiering av PD, är inte tillräckligt för att köra PD i alla individer, undkommer mot förmågan hos värden immunsvar att undergräva övergången av bakterieflora mellan symbiotiska och dysbiotiska stater15. Detta sätter en särskild strålkastarljuset på de medel genom vilka PD påverkar en av de ledande tecknen i det medfödda immunförsvaret, nämligen polymorfonukleära granulocyt (PMN), eller neutrofila, från lokala och systemiska perspektiv16,17.
Hos människa rekryteras PMNs från cirkulationen med en hastighet av ~ 2 x 106 celler/h i friska parodontala bindväv, där de är den dominerande leukocytpopulationen. Här, de är sedan utvisas från gingival sulcus i munhålan som en del av gingival crevicular vätska. I närvaro av PD, neutrofili manifesterar i cirkulationen och munhålan, där dessa effektorceller har en hyperinflammatorisk fenotyp som leder till den ovan nämnda förstörelsen av den17,18,19,20,21,22. Därför är det ytterst viktigt att förstå PMNs roll i PD och andra systemiska inflammatoriska tillstånd.
Även om det är allmänt accepterat att kroniska sjukdomar är ömsesidigt knutna till PD, har de bakomliggande mekanismerna ännu inte klarlagts, vilket bidrar till svårigheterna i hanteringen av dessa sjukliga och potentiellt dödliga systemiska tillstånd. Flera experimentella djurmodeller, var och en med unika fördelar och nackdelar, har utnyttjats för att studera patofysiologin hos PD23,24. Med särskilt fokus på murina modeller, det finns en mängd olika protokoll genom vilka studien av PD underlättas; de har dock flera tekniska och fysiologiska brister25,26,27,28,29,30,31.
Först, den muntliga sonden musmodellen kräver många muntliga vaccinationer av mänskliga parodontala patogener att generera gingival inflammation och benförlust. Dessutom är det i allmänhet föregås av en period av antibiotikabehandling för att undergräva murina kommensaler oral Flora25. Denna modell kräver ofta specialiserad utbildning för att säkert utföra den muntliga sonden, använder endast en liten del av parodontala patogener från mer komplexa mänskliga oral microbiome, och kräver flera månader för att etablera alveolära benförlust.
I motsats, kemiskt inducerade murin modeller utnyttja den muntliga leveransen av Trinitrobensen sulfonsyra (TNBS) eller dextran sulfate natrium (DSS), agenter som vanligen används för att fastställa murina modeller av kolit under en period av flera månader för att inducera parodontala benförlust26. Intraorala och extraorala abscess-baserade modeller finns tillgängliga, som involverar murina incisorer och vävnader av dorsum samt calvarium, respektive. I fd abscess modell, flera injektioner av bakterier administreras, skapa flera gingival bölder och en brist på alveolära benförlust, begränsa deras användning i studien av PD. De senare abscess modellerna är betydligt mer benägna att studera bakteriell virulens, inflammation, och benresorption på platser utanför munhålan, vilket eliminerar utvärderingen av den och oral mikrobiomet27,28,29,30,31.
Med hjälp av Ligature-inducerad modell av parodontit, en flätad sidensutur har vanligen installerats runt om den andra molar. Som ett alternativ kan ett enda linjärt segment av suturmaterial sättas in mellan den första och andra molarer32,33. Målet med ligatur placeringen är att underlätta bakteriell ackumulering och generera dysbios inom gingival sulci, vilket resulterar i parodontala vävnad inflammation och förstörelse av vävnaderna komponera periodontium. Framför allt, denna modell är kapabel att producera betydligt mer alveolär benförlust jämfört med de vanligare orala sontmjöl modell34. Ytterligare komplierar användningen av den muntliga sondmatning modellen är det naturliga motståndet av flera stammar av möss (dvs, C57BL/6) att utveckla alveolära benförlust. Detta är också problematiskt, eftersom denna stam är den mest använda i Murine-baserade djur forskning35.
Befintliga förfaranden som beskrivs av marchesan et al. och Abe och hajishengallis utformades för att förenkla den tekniska handlingen att placera ligatur33,36. Tyvärr kräver det tidigare protokollet specialiserad 3D-tryckt utrustning och besitter potentialen för för tidig ligatur förlust, vilket ökar djurens användning och kostnaderna i samband med ytterligare tid i operationssalen. Dessutom genererar båda protokollen endast små regioner av det sjuka den som finns för en studie.
De fördelar som ligger i denna teknik är förankrade i den samtidiga studien av oral dysbios och immunologi som styr periodontium, utnyttjande av låg kostnad djur med olika genetiska bakgrunder, och enkla bostäder och djurhållning praxis. Som sådana bör mål vara att maximera volymerna av sjuk vävnad och, i försök att öva principerna för minskning av djurförsök, minska djur konsumtionen till en så låg nivå som möjligt. Detta förutsätter att alla djur kan inkluderas i experimentella analyser37. Det bör dock noteras att oavsett vilken djurmodell av parodontit utnyttjas, det finns ingen enda modell som omfattar varje del av mänskliga PD patofysiologi.
Detta nya protokoll sysselsätter placeringen av en ligatur runt flera maxillary molar tänder med hjälp av instrumentering och material som finns inom de flesta laboratorier. Det tillåter en tillräcklig mängd tid för att enkelt och tryggt installera en ligatur som sannolikt inte kommer att avulse för tidigt. Slutligen, eftersom PMNs samordnar förstörelsen av den i PD, en ny metod för att återvinna orala neutrofiler på ett sätt som liknar människor presenteras också.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

De främsta fördelarna med att studera patofysiologin för parodontit använda murina modeller är den minskade kostnaden för djur, en rad genetiskt modifierade stammar, det stora antalet analyser som kan utföras på skördade mjuk och hård vävnad. Många av dessa system är dock föremål för procedurmässig kritik. Som ett alternativ, den ligatur-inducerad modell av parodontit, driven av lokaliserad utveckling och retention av en dysbiotic oral microbiome, kan användas, som snabbt induceras och relativt tillförlitlig. Tyvärr, de varianter av ligatur-inducerad murin parodontit protokollet är isolerade till fokala regioner i den och föremål för förtida avulsion av den installerade ligatur. Detta minimerar mängden vävnad som finns tillgänglig för efterföljande analyser och ökar antalet djur som krävs för studier. Detta protokoll beskriver de exakta manipulationer som krävs för att placera förlängda molar-ligaturer med förbättrad retention och användning av en ny sköljteknik för att återvinna orala neutrofiler hos möss med ett alternativt tillvägagångssätt som lindrar de tidigare nämnda tekniska utmaningar.

Representativa flödescytometri data från orala sköljprover av en naiv (figur 3a) och inflammerad (figur 3B) murina munhålan sekundärt till ligatur-inducerad parodontit tillhandahålls. Indrivningen av PMNs från en installerad ligatur påvisas också (figur 3C). Flow flödescytometerns kanal spänningar kalibrerades manuellt, och kompensation utfördes med enfärgade ersättnin...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils at JoVE.com

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Denna artikel presenterar ett protokoll för upprättande av en Ligature-inducerad modell av murina parodontit med flera maxillary molarer, vilket resulterar i större områden av de inblandade gingival vävnad och ben för efterföljande analys samt minskad användning av djur. En teknik för att bedöma orala neutrofiler på ett sätt som motsvarar de mänskliga försökspersonerna beskrivs också.

Robust Ligature-inducerad modell av murina parodontit för utvärdering av orala neutrofiler

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Det protokoll som beskrivs här förser utredare med en metod för att studera orala neutrofiler inom en ligatur-inducerad djurmodell av tandlossning på ett analogt sätt till mänskliga deltagare. Den största fördelen med denna teknik framhävs av den ökade volymen inflammerade gingival vävnader tillgängliga för efterföljande analys, vilket minskar användningen av djur. Vår förmåga att hämta de biofilm-belagda ligaturer från runt tänderna möjliggör simulering av effektiv behandling av en lokaliserad parodontala sjukdom.Användningen av denna modell skulle kunna tillämpas i studien av de systemiska effekterna av parodontit i en djurmodell, på grund av de ökade områdena inflammerade gingival vävnader. Förtrogenhet med användningen av mikrokirurgiska instrument och dissekering mikroskop, samt knyta kirurgens knutar före hantering av levande djur ämnen, är starkt rekommenderas. Visuell demonstration av denna teknik är avgörande för att minska längden på inlärningskurvan som krävs för att uppnå skickliga ligatur placering.Demonstrera förfarandet kommer att Jeff Chadwig, en doktorand från mitt laboratorium. Börja med att placera musen på en uppvärmd kirurgisk plattform. Efter att ha säkerställt att musen är ordentligt sövd, stabilisera överkäken och underkäken i öppet läge med hjälp av elastiska band.Prop halsen med en bomull rulle för att upprätthålla överkäken i ett horisontellt läge och täcka kroppen och svansen för att mildra värmeförlust. Placera operationsmikroskopet vid önskad förstoring och belysning över munhålan. Använd splinter-forceper för att installera en steril 50 eller mindre flätad sidensutur runt M1- och M2-maxillary-kindtänderna inom gingivalsulcus.Placera suturens distala svans på dentitionens palatala sida och för in det proximala segmentet mellan kontakten med M2 och M3. Linda den sedan runt den buckala ytan av M2 och sätt in den mellan kontakten med M1 och M2. Se till att båda ändarna av suturen dras tätt för att driva in den i gingival sulcus. Linda det proximala sutursegmentet runt M1 under dess konturhöjd och för in det mellan kontakten med M1 och M2. Dra suturens proximala svans tätt för att ta bort allt slack. Bind ändarna av suturen med en kirurgsknop och trimma svansarna så sortera som möjligt.Placera knuten i gingival embrasure mellan M1 och M2 på den palatala sidan av den maxillary tandbildning. Det är kritiskt att den knut som används för att säkra ligaturen är säker och i läge där det inte kommer att irritera djuret eller störa mastication. Efter ligaturinstallationen, ta bort musen från operationsapparaten och placera den i en ren bur under en värmelampa, se till att övervaka den tills den är helt återställd.Sterilisera de kirurgiska instrumenten i den varma glaspärla sterilisator mellan varje djurämne. Individuellt hus varje mus med lämplig miljöberikning och tillåta ad libitum tillgång till filtrerat vatten och mosade standard chow i en temperatur och luftfuktighet kontrollerad miljö i sju till 11 dagar. När du är redo att samla prover, använd en pipett för att skölja munhålan med 100 mikroliter av steriliserade fyra grader Celsius PBS utan kalcium och magnesium i 10 sekunder.Upprepa sköljningen ytterligare två gånger, placera varje skölj i samma 15 milliliter koniska sterila provrör för varje djur. Kör innehållet i varje 15 milliliter rör genom en 40 mikrometer nylon mesh filter i en 50 milliliter koniska rör, och överföra filtratet till en ny 15 milliliter provrör. Tillsätt 33,3 mikroliter av 16%paraformaldehyd för att underlätta provfixering.Vortexa proverna omedelbart och ruva dem på is i 15 minuter. Paraformaldehyd är det mest farliga reagens som används i protokollet och bör hanteras med den rekommenderade personliga skyddsutrustning som rekommenderas av tillverkaren. Efter inkubationen fyller du röret till 15 milliliter med PBS sedan centrifug den på 1000xg och fyra grader Celsius i fem minuter.Aspirera supernatanten, åter upphäva pelleten i en milliliter FACS buffert vid fyra grader Celsius och räkna cellerna på en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Upprepa centrifugeringen och aspirera supernatanten. Sedan, åter avbryta cell pelleten i en lämplig volym AVS-buffert för en slutlig koncentration av 500, 000 till 1 miljon celler per 50 mikroliter av FACS buffert och överföra cellerna till FACS rör.Lägg till en mikroliter av råttserum och två mikroliter av anti-mus IGG-antikropp till 50 mikroliter av provet. Vortex provet omedelbart och blockera den på is i 20 minuter. Lägg sedan till lämpliga antikroppar till varje prov.Vortexa och inkubera på is i 30 minuter i mörker. Efter inkubationen, tvätta proverna med en milliliter FACS buffert, virvel kort, och centrifug i fem minuter vid 1000xg och fyra grader Celsius. Dumpa supernatanten och blockera försiktigt facs-rörets öppning.Upprepa tvätten två gånger, sedan åter upphäva proverna i 250 mikroliter av FACS buffert för lagring. Täck rören med paraffin film, linda dem i aluminiumfolie, och lagra dem i fyra grader Celsius tills redo att analysera. Flow cytometry användes för att analysera neutrophils återhämtat sig från en muntlig sköljning från en naiv mus, samt en muntlig skölj och återvinnas ligatur från en mus med ligatur-inducerad parodonit.För att bedöma alveolar benförlust, alveolar bennivåer mättes från alveolar ben krönet till cementoenamel korsningen för friska och ligated möss. Sedan beräknades mätdifferenserna. Även om inte ses över här, histopatologic, immunohistochemical och morphometric utvärdering av periodontium och alveolar ben kan också genomföras beroende på forskning fråga.Denna modell används för närvarande i mitt laboratorium för att studera effekterna av det orala medfödda immunsystemet på systemisk hälsa och sjukdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

En analytisk verktygslåda för omfattande biokemiska, struktur-och transkriptom Utvärdering av Oral Biofilmer medieras av mutans streptokocker

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som modellorganism för att bedöma Interaktion av anaeroba bakterier med värdceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Muntliga Intubation av vuxen zebrafiskar: en modell för utvärdering av tarmens upptag av bioaktiva föreningar

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitativa Polymerase Chain Reaction-baserade analyser av murina tarmens bakterieflora efter Oral antibiotikabehandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En Galleria mellonella Oral Administration modell till Study Commensal-Induced medfödda immunsvar

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

En modern uppvärmnings- / fasthållningsanordning för effektiva svansvetinjektioner i en murin svamp sepsis modell

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Induktion av parodontit via en kombination av ligatur och lipopolysackarid injektion i en råttmodell

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

A Mouse Ear Model for Allergic Contact Dermatitis Evaluation

En musöra modell för allergisk kontaktdermatit utvärdering

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a ...