Name: isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

تم دعم العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: 2016A030313028؛ مؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: B2018003؛ مؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا، منحة / رقم الجائزة: JCYJ20180306172449376، JCYJ20180306172459580, JCJY20202920484975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 و JCYJ201604288142040404045; شنتشن لونغهوا منطقة مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، منحة / جائزة رقم: 2017013؛ البرنامج الوطني لمفاتيح R&D في الصين، منحة / جائزة رقم: 2017YFC1103704؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن، منحة / جائزة رقم: SZSM201412020؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)؛ صندوق للانضباط الطبي العالي المستوى بناء شنتشن، منحة / جائزة رقم: 2016031638؛ مؤسسة شنتشن للصحة وتنظيم الأسرة لجنة، منحة / جائزة رقم: SZXJ2017021 وSZXJ2018059. نشكر هانتشنغ تشانغ وزيتشنغ زو من جامعة شنتشن على مساعدتهما فى اعداد المخطوطة .

وقد وافقت لجنة مراجعة الأخلاقيات بمستشفى شنتشن الشعبى الثانى على استخدام الحيوانات وفقا لمبادئ رعاية الحيوان .
1. إعداد الحيوانات والمتوسطة والمخازن المؤقتة
<ol><li>جهز الخنزير المصغر ملاحظة: كانت جميع الخنازير المصغرة خنازير ووزيشان الصينية أو الباما (ذكر). وكان عمر ووزن ا...

<ol>
	<li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+transplantation+in+China:+concerns+remain.">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li><li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+xenotransplantation:+the+next+medical+revolution?.">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?.</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li><li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research.">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li><li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells:+role+in+infection+and+inflammation.">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li><li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation:+prospects+for+the+future.">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li><li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators.">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li><li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells.">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li><li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized,+Blinded,+Placebo+Controlled+Trial.">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1/Cmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model.">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).</li><li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro.">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li><li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro.">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70,+heat+shock+protein+32,+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells.">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells:+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders.">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li><li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization.">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li><li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration.">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li><li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+death,+angiogenesis,+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor:+role+of+vascular+endothelial+growth+factor.">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li><li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells.">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).</li><li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung.">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li><li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol.">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow.">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li><li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li><li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic.">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li><li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips.">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).</li><li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells:+a+comparative+ultrastructural+study.">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li><li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues.">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li><li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+complementary+digestion+patterns.">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li><li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection.">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li></ol>

وتستخدم الخلايا البطانية عادة في البحوث من خلل الأوعية الدموية, مرض السكري, تجديد الأنسجة, زرع, والسرطانات14,15,16,17,18. لفهم وتوصيف البيولوجيا ووظيفة ECs في هذه الأمراض، تم الإبلاغ عن العديد من الطرق لعزل E...

نقص الأعضاء المتاحة للزرع هو مشكلة المعلقة في جميع أنحاء العالم1. ووفقا لجمعية الصليب الأحمر الصينية، لم يتلق سوى عدد قليل من المرضى الذين يعانون من فشل في الأعضاء في المرحلة النهائية جهازا مناسبا في الصين في عام 2018.
زرع Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل مشكلة نقص الأعضاء. وتعتبر أجهزة الخنزير لتكون الأجهزة الأكثر ملاءمة للبشر بسبب التشابه التشريحي والفيزيولوجي2،3. يرتبط فشل xenograft خنزير إلى حد كبير إلى رفض المناعة الرئيسيات والاستجابات التخثر. الخلايا البطانية البورسينية (ECs) حاسمة لأن هذه الخلايا هي الأولى للتفاعل مع الجهاز المناعي الرئيسي، والذي يتضمن الأجسام المضادة، تكملة، السيتوكينات، والخلايا المناعية (على سبيل المثال، الخلايا T، الخلايا B، والضامة)4،5. Porcine ECs تلعب دورا حيويا في عضو الخنزير وislet xenotransplant6,7. وهكذا، ECs هي خلايا هامة للتحقيق في ردود الرفض والتخثر لطعم الخنزير. مطلوب عزل عالية الجودة من الخنازير ECs لبحوث الزرع xenotransplant.
في محاولات لعزل ECs من أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، القلب والكلى والكبد والأبهر)، تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في إعداد xenotransplant8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الحفاظ على ثقافة فائقة النقاء للمركبات الإلكترونية المعزولة يمثل مشكلة بارزة في البروتوكولات القياسية. زيادة تركيز الحل المهضوم، ووقت الهضم غير المناسب وكثافة كشطقد تسهم في زيادة التلوث الليفي في الدراسات الحالية 8،10،13. إلى جانب ذلك، فإن طريقة pAECs معزولة من الخنازير مصغرة هو أقل دراسة. هنا، نقوم بوصف طريقة أنزيمية محسنة لعزل pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة (Wuzhishan أو Bama). وقد تم تصميم عدة خطوات في البروتوكول للحد من التلوث الليفي والحصول على ECs عالية النقاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1163px;" width="1164">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BD FACSAria II</td>
			<td style="width:424px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Boneforceps</td>
			<td style="width:424px;">Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;">HL-YGQ&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BOON Disposable Syringe (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:424px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:142px;">MCA1746F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3010#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:142px;">C5138#-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:280px;">Compound ketamine injection&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;">Ketamine Hydrochloride&#65306;0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride&#65306;1mg/2ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">D1306#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">DMEM</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">11965118#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECM</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1001#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECGS</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1052#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&#160;</td>
			<td style="width:424px;">AXYGEN</td>
			<td style="width:142px;">MCT-150-C#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Falcon 100mm Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:424px;">Corning</td>
			<td style="width:142px;">353003#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">10270-106#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Flowjo v10.0</td>
			<td style="width:424px;"></td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Iodine tincture</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Miniature Pig (Bama or Wuzhishan)</td>
			<td style="width:424px;">Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Mshot microscope&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:142px;">M152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Petri Dishes (150 x 15 mm)</td>
			<td style="width:424px;">Biologixgroup</td>
			<td style="width:142px;">66-1515#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">15070063#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap &#65288;T25&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3289#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Scissors</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Serological Transfer Pipettes (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">JET Biofil</td>
			<td style="width:142px;">GSP010010#&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:424px;">GeneBrick</td>
			<td style="width:142px;">GY0025#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Syringe Filter (0.22&#181;m)</td>
			<td style="width:424px;">Millipore</td>
			<td style="width:142px;">SLGV033RS#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;">22#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical suture</td>
			<td style="width:424px;">Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:280px;">Syringe&#65288;5mL&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">25200056#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">75% Medical alcohol</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free)</td>
			<td style="width:424px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:142px;">B540627#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Medical disinfectant 84 liquid</td>
			<td style="width:424px;">Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">450ml/bottle</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs

Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل النقص في الأعضاء البشرية للمرضى الذين يعانون من فشل الجهاز في المرحلة النهائية، ويعتبر الخنزير كمصدر مناسب للأعضاء. رفض المناعة والتخثر هما عقبتان رئيسيتان لنجاح زرع xenotransplant. إصابة الخلايا البطانية الوعائية (EC) والخلل مهم لتطوير استجابات الالتهاب والتخثر في زرع الأكسي. وهكذا، فإن عزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية (pAECs) ضروري للتحقيق في استجابات الرفض المناعي والتخثر. هنا، قمنا بتطوير نهج أنزيمي بسيط لعزل وتوصيف وتوسيع pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة. أولاً، تم التخدير عن الخنزير المصغر بالكيتامين، وتم استئصال طول الأبهر. ثانيا، تعرض السطح البطانية من الأبهر إلى 0.005٪ كولاجيناز الرابع محلول هضمي لمدة 15 دقيقة، ثالثا، تم كشط سطح بطانة الأبهر في اتجاه واحد فقط مع مكشطة الخلية (<10 مرات)، ولم يتم ضغطها خلال عملية الغاء. وأخيراً، تم تحديد pAECs معزولة من اليوم 3، وبعد مرور 1 والممر 2، عن طريق قياس التدفق مع الأجسام المضادة CD31. وكانت النسب المئوية للخلايا الإيجابية CD31 97.4٪ ± 1.2٪، 94.4٪ ± 1.1٪، و 92.4٪ ± 1.7٪ (يعني ± SD)، على التوالي. تركيز Collagenase الرابع، والوقت الهضمي، واتجاه، وتواتر وكثافة كشط حاسمة لخفض التلوث الليفي والحصول على عالية النقاء وعدد كبير من ECs. في الختام، لدينا طريقة الأنزيمية هي طريقة عالية الفعالية لعزل ECs من الأبهر الخنزير مصغرة، ويمكن توسيع الخلايا في المختبر للتحقيق في استجابات المناعة والتخثر في الزرع xenotransplant.

تهدف طريقتنا إلى توفير طريقة فعالة لعزل الـ ECs عالية النقاء عن الأبهر من الخنازير المصغرة. تظهر عملية جراحة الأبهر في الشكل 1. الخطوة الأولى هي أن يتم استئصال الأبهر كله من الخنزير. منع تلوث الخلايا أو البكتيريا الأخرى مهم جداً. وبالتالي، لا تصيب الأعضاء أو الأنسجة الأخرى في...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

يتم وصف طريقة أنزيمية فعالة لعزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية الأولية (pAECs) من الخنازير المصغرة. يمكن استخدام pAECs الأولية المعزولة للتحقيق في الاستجابة المناعية والتخثر في الزرع xenotransplant.

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

هذه الطريقة هي طريقة فعالة للغاية لعزل الخلايا البطانية من الخنزير المصغر. ويمكن توسيع الخلايا أيضا، والتحقيق في استجابة المناعة والتخثر في xenotransplantation. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه ليس من السهل فقط، فعالة للغاية لعزل خلايا بطانة endothelium تنقية للغاية من خنزير، ولكن أيضا أفضل للحفاظ على pAECs الأخرى عند مرور.بعد التأكد من عدم الاستجابة لاعكاس الألم في الخنزير المُجَنَّد، اغسل جدار البطن المساميني ثلاث مرات مع 75٪ من الكحول الطبي، وصبغة واحدة من اليود. بعد الغسيل الأخير، استخدم مشرطًا لإجراء شق في البطن لفضح الوريد الأجوف السفلي، واستخدم حقنة خمسة ملليلتر لحقن 5000 وحدة من الصوديوم الهيبارين في الوريد السفلي. بعد خمس دقائق، أدخل قسطرة في الشريان الأورطي في البطن، واستخدم مشرطًا لتجزئة الحجاب الحاجز.بمساعدة محقق ثان، قم بإزالة البطين الأيسر واستخدم ملقط العظام لإخراج الأضلاع لفضح القلب والرئتين. حدد موقع الشريان الأبهر الخلفي للقلب والرئتين، ومشبك نهايات. استخدام مقص لإخراج الشريان الأورطي، وغسلها مرة واحدة مع العازلة الغسيل قبل تبريد.إزالة أي الأنسجة الزائدة حول الشريان الأورطي مع ملقط معقمة ومقص، ووضع السفينة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر تحتوي على عازلة الغسيل قبل التبريد الطازجة لنقلها إلى المختبر. لعزل الخلايا البطانية الأبهري بورسين الأبهر، نقل الشريان الأورطي الخنزير في طبق بتري 150 ملليمتر في ظل ظروف معقمة، وإزالة بلطف طرفي السفينة. تقليم أي الأنسجة الزائدة الإضافية حيث تم تثبيت السفينة، مع ملقط معقمة ومقص، واستخدام 20 إلى 50 ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة لشطف خارج وداخل الشريان الأورطي.المقبل، تمرير خياطة الجراحية من خلال الشريان الأورطي، وربطة عنق فضفاضة واحدة من نهاية السفينة، والحفاظ على خياطة داخل تجويف. إصلاح بلطف الشريان الأورطي بالقرب من نهاية تعادل مع ملقط ثم سحب خياطة الجراحية ببطء, لعكس الشريان الأورطي, حتى يتعرض السطح endothelial من الشريان الأورطي. اغسل السطح البطانية للوعاء ثلاث مرات مع 10 ملليلترات من الغسيل العازل الطازج لكل غسل، ووضع الشريان الأورطي في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.تغطية العينة مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية الدفء 0.005٪ الكولاجينازل الرابع، واحتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. في نهاية الحضانة، نقل محتويات الأنبوب بأكملها إلى طبق ثقافة 100 ملليمتر، ووقف الهضم مع 10 إلى 15 ملليلتر من العازل وقف ما قبل التبريد. باستخدام مكشطة الخلية، قم بإزالة الخلايا البطانية الأبهرية بلطف من السطح الداخلي للسفينة، وغسل الوعاء ثلاث مرات بخمسة ملليلترات من الغسيل العازلة لكل غسل.بعد الغسيل الأخير، نقل المابير في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر، وغسل الجزء السفلي من طبق الثقافة مرتين مع خمسة ملليلتر من العازلة الغسيل الطازجة، في غسل، وسحب يغسل في أنبوب 50 ملليلتر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وتجاهل جميع ما عدا آخر 10 ملليلتر من عظمى. إضافة 20 ملليلتر من العازلة الغسيل لإعادة تعليق بيليه، مع الحرص على تجنب فقاعات، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر.resuspend بيليه في ملليلتر واحد من خلية ثقافة المتوسطة للعد، وطبق الخلايا في واحد مرات عشرة إلى الخلايا الست لكل 25 سنتيمترا مربعا تركيز قارورة. ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون، منعشة المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام. بعد العزل، يتم فحص الخلايا البطانية في اليوم صفر، واحد، واثنين، وبعد مرور واحد واثنين للتلوث وتقييمهم المورفولوجي.تدفق تحليل cytometric باستخدام المضادة لC31-FITC الأجسام المضادة يشير عادة أكبر من 97٪ علامة الخلايا endothelial السكان إيجابية في اليوم الثالث من الثقافة, التي يتم الحفاظ عليها في أكثر من 90٪ نقاء حتى بعد مرورين. تم كشط السطح البطاخلي من الشريان الأورطي في اتجاه واحد فقط ، مع مكشطة الخلية ، لأقل من 10 مرات ، ولم يتم ضغطه أثناء عملية الكشط. أفضل إجابة، طريقة محسنة لعزلة pAECs، يمكننا استخدام pAECs المنقى لإجراء تجارب فردية والتحقيق في الرفض المناعي واستجابة التخثر في xenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...