Name: isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הטבעי של מחוז גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: 2016A030313028; הקרן המדעית למחקר רפואי של פרובינציית גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: B2018003; קרן שנזן למדע וטכנולוגיה, מספר גרנט/פרס: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 וJCYJ20160428142040945; הקרן למדע וטכנולוגיה של שנג לונחואה, הענקת מספר פרס: 2017013; מפתח לאומי R & D תוכנית של סין, גרנט/מספר הפרס: 2017YFC1103704; פרויקט sanming של הרפואה שנזן, גרנט/מספר הפרס: SZSM201412020; קרנות מיוחדות להקמת בתי חולים ברמה גבוהה בפרובינצית גואנג-דונג (2019); קרן ברמה גבוהה משמעת רפואית בנייה של שנג, גרנט/מספר הפרס: 2016031638; קרן שנזן בריאות ותכנון משפחה הנציבות, גרנט/מספר הפרס: SZXJ2017021 ו SZXJ2018059. אנו מודים לחננג ג'אנג ולדז'נג זיאו מאוניברסיטת שנזן לסיוע בהכנת כתב היד.

השימוש בבעלי חיים אושר על ידי ועדת ביקורת האתיקה של בית החולים השני של שנזן, בהתאם לעקרונות של רווחה בעלי חיים.
1. הכנת בעלי חיים, בינוניים ומאגרים
<ol><li>. הכן את החזיר הזעיר הערה: כל החזירים הזעירים היו הסינים וודז'שאן או חזיר-במה (זכר). הגיל והמשקל של חזירים היו 100 ימים ± 8 ימים...

<ol>
	<li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+transplantation+in+China:+concerns+remain.">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li><li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+xenotransplantation:+the+next+medical+revolution?.">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?.</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li><li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research.">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li><li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells:+role+in+infection+and+inflammation.">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li><li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation:+prospects+for+the+future.">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li><li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators.">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li><li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells.">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li><li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized,+Blinded,+Placebo+Controlled+Trial.">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1/Cmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model.">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).</li><li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro.">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li><li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro.">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70,+heat+shock+protein+32,+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells.">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells:+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders.">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li><li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization.">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li><li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration.">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li><li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+death,+angiogenesis,+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor:+role+of+vascular+endothelial+growth+factor.">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li><li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells.">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).</li><li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung.">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li><li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol.">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow.">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li><li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li><li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic.">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li><li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips.">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).</li><li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells:+a+comparative+ultrastructural+study.">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li><li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues.">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li><li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+complementary+digestion+patterns.">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li><li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection.">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li></ol>

תאי האנדותל משמשים בדרך כלל במחקר של תפקוד כלי דם, סוכרת, התחדשות רקמות, השתלת, סרטן14,15,16,17,18. כדי להבין ולאפיין את הביולוגיה ואת התפקוד של ecs במחלות אלה, שיטות רבות כדי לבודד ecs של איברים חולים שונים או ר...

המחסור של איברים זמינים עבור השתלת הוא בעיה מצטיינים ברחבי העולם1. על פי החברה הצולבת האדומה של סין, רק מספר קטן של חולים עם כשל איברים בשלב הסיום קיבל איבר מתאים בסין בשנת 2018.
Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את הבעיה של מחסור באיברים. איברי חזיר נחשבים לאיברים המתאימים ביותר עבור בני אדם בגלל דמיון אנטומי ופיזיולוגי2,3. הכישלון של שהשתיל חזיר מבע ברובו לדחיית החיסון הקופים התגובות קרישת דם. תאים של porcine אנדותל (ecs) הם קריטיים מאז תאים אלה הם הראשונים אינטראקציה עם המערכת החיסונית של הפרימטים, הכוללת נוגדן, משלים, ציטוקינים, ותאים חיסוניים (למשל, T תאים, B תאים, מקרופאגים)4,5. המשחק ecs לשחק תפקיד חיוני באורגן חזיר ו השתלת איון xenotransplantation,7. כך, ECs הם תאים חשובים לחקירת דחייה והתגובות קרישת הדם שתל חזיר. בידוד של ECs באיכות גבוהה נדרש עבור מחקר xenotransplantation שתלת.
בניסיונות לבודד ecs מאיברים שונים (למשל, לב, כליות, כבד, העורקים), כמה פרוטוקולים דווחו בהגדרה xenotransplant שתלה8,9,10,11,12. עם זאת, שמירה על תרבות אולטרה-סאונד של ECs מבודדת היא בעיה יוצאת דופן בפרוטוקולים הסטנדרטיים. הריכוז המוגבר של הפתרון המתעכל, זמן העיכול הבלתי מתאים ועוצמת הגרד עשויה לתרום לזיהום פיברובסט מוגבר במחקרים הנוכחיים8,10,13. חוץ מזה, השיטה של pAECs מבודדים מחזירים זעירים הוא פחות לומד. כאן, אנו מתארים שיטה אנזימטית אופטימיזציה כדי לבודד pAECs מטוהרים מאוד מפני חזירים זעירים (וודז'שאן או במה). כמה צעדים בפרוטוקול נועדו להפחית את זיהום הפיברובלסט ולהשיג ECs טוהר גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1163px;" width="1164">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BD FACSAria II</td>
			<td style="width:424px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Boneforceps</td>
			<td style="width:424px;">Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;">HL-YGQ&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BOON Disposable Syringe (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:424px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:142px;">MCA1746F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3010#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:142px;">C5138#-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:280px;">Compound ketamine injection&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;">Ketamine Hydrochloride&#65306;0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride&#65306;1mg/2ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">D1306#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">DMEM</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">11965118#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECM</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1001#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECGS</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1052#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&#160;</td>
			<td style="width:424px;">AXYGEN</td>
			<td style="width:142px;">MCT-150-C#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Falcon 100mm Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:424px;">Corning</td>
			<td style="width:142px;">353003#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">10270-106#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Flowjo v10.0</td>
			<td style="width:424px;"></td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Iodine tincture</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Miniature Pig (Bama or Wuzhishan)</td>
			<td style="width:424px;">Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Mshot microscope&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:142px;">M152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Petri Dishes (150 x 15 mm)</td>
			<td style="width:424px;">Biologixgroup</td>
			<td style="width:142px;">66-1515#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">15070063#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap &#65288;T25&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3289#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Scissors</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Serological Transfer Pipettes (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">JET Biofil</td>
			<td style="width:142px;">GSP010010#&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:424px;">GeneBrick</td>
			<td style="width:142px;">GY0025#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Syringe Filter (0.22&#181;m)</td>
			<td style="width:424px;">Millipore</td>
			<td style="width:142px;">SLGV033RS#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;">22#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical suture</td>
			<td style="width:424px;">Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:280px;">Syringe&#65288;5mL&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">25200056#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">75% Medical alcohol</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free)</td>
			<td style="width:424px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:142px;">B540627#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Medical disinfectant 84 liquid</td>
			<td style="width:424px;">Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">450ml/bottle</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs

Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את המחסור של איברי האדם עבור חולים עם כשל איבר בשלב הסופי, והחזיר נחשב מקור איבר מתאים. דחייה וקרישה החיסונית הם שני מכשולים עיקריים להצלחת השתלת xenotransplantation הפציעה והתפקוד הגופני של כלי הדם (EC) הם חשובים לפיתוח התגובה לדלקות וקרישת דם ב-xenotransplantation שתלת. כך, בידוד של התאים החיוניים של האבי העורקים (pAECs) יש צורך לחקור את הדחייה החיסונית ואת התגובות קרישת דם. כאן פיתחנו גישה אנזימטית פשוטה לבידוד, אפיון והתרחבות של pAECs מטוהרים מאוד מחזירים זעירים. , החזיר הזעיר הרדימים עם קטמין. ואורך של העורקים היה מגורש שנית, משטח האנדותל של העורקים נחשף 0.005% הפתרון העיכול IV הרביעי עבור 15 דקות. השלישי, משטח האנדותל של העורקים היה מגורד בכיוון אחד בלבד עם מגרד תא (< 10 פעמים), ולא נדחס במהלך התהליך של גירוד. בסופו של דבר, pAECs מבודדים של היום 3, ואחרי מעבר 1 ומעבר 2, זוהו על ידי cy, הזרמת לנסות עם נוגדן anti-CD31. האחוזים של תאים CD31-חיוביים היו 97.4% ± 1.2%, 94.4% ± 1.1%, ו 92.4% ± 1.7% (ממוצע ± SD), בהתאמה. הריכוז של קולגן הרביעי, זמן העיכול, את הכיוון, ואת התדר ואת העוצמה של גירוד הם קריטיים להפחתת זיהום בפיברובלסט וקבלת טוהר גבוהה ומספר רב של ECs. לסיכום, השיטה האנזימטית שלנו היא שיטה מeffctive ביותר לבידוד ECs מן העורקים חזיר מיניאטורי, ואת התאים ניתן להרחיב בתוך מבחנה כדי לחקור את התגובות החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.

השיטה שלנו שואפת לספק דרך יעילה לבידוד ECs מטוהרים מאוד מaortas של חזירים זעירים. תהליך ניתוח העורקים מוצג באיור 1. הצעד הראשון הוא שכל. כללי העורקים מרוטרים מהחזיר מניעת מזהמים אחרים של תאים או בקטריאליים מאוד חשובים. כך, לא לפגוע באיברים אחרים או רקמות במקרה תאים לא ממוקדים או ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

שיטת אנזימטית אפקטיבית לבידוד של תאי האבי-העורקים הראשוניים של החזיר (pAECs) מחזירים זעירים מתוארים. PAECs העיקרי מבודד ניתן להשתמש כדי לחקור את התגובה החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

השיטה היא שיטה יעילה מאוד לבודד תאי אנדותל מחזיר מיניאטורי. ואת התאים ניתן להרחיב מדי, לחקור את התגובה החיסונית ואת קרישה ב xenotransplantation. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שזה לא רק קל, יעיל מאוד לבודד תאי אנדותל מטוהרים מאוד מחזיר, אלא גם טוב יותר לשמירה על pAECs אחרים כאשר מעבר.לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס כאב חזיר הרדמה, לשטוף את דופן הבטן חזיר שלוש פעמים עם 75% אלכוהול רפואי, ותמיסת אחת של יוד. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש באזמל כדי לבצע חתך בבטן כדי לחשוף את הנבוב הנבוב הנחות, ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר להזריק 5000 יחידות של נתרן הפרין לתוך וריד ורידים נחותים. לאחר חמש דקות, להכניס קטטר לתוך ביתן הבטן, ולהשתמש אזמל כדי להסית את הסרעפת.בעזרת חוקר שני, להסיר את החדר השמאלי ולהשתמש מלקחים עצם כדי לסלק את הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות. אתר את העורקים האחוריים ללב ולריאות, ומהדק את הקצוות. השתמש במספריים כדי למלמל את בית ההנשמה, ולשטוף אותו פעם אחת עם חיץ כביסה מקורר מראש.הסר כל רקמה עודפת סביב העורקים עם ממטרים סטריליים ומספריים, והצב את הכלי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל מאגר כביסה מקורר מראש טרי להעברה למעבדה. לבידוד תאי אנדותל בחזירים, מעבירים את בית הישבן של החזיר לצלחת פטרי של 150 מילימטר בתנאים אספטיים, ומסירים בעדינות את שני קצות הכלי. לקצץ כל רקמה עודפת נוספת שבו הכלי היה מהודק, עם מלקחיים סטריליים ומספריים, ולהשתמש 20 עד 50 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לשטוף את החלק החיצוני והתוך של בית הישוריים.לאחר מכן, להעביר תפר כירורגי דרך בית הדם, ולקשור באופן רופף קצה אחד של הכלי, שמירה על התפר בתוך לומן. בעדינות לתקן את העורקים ליד הקצה קשור עם מדפים ולאחר מכן למשוך את התפר הכירורגי לאט, כדי להפוך את העורקים, עד פני השטח אנדותל של העורקים נחשפים. לשטוף את פני השטח אנדותל של aorta שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לכל לשטוף, ולמקום את העורקים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.מכסים את המדגם עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מחומם 0.005% קולגן IV פתרון העיכול, ודגירה את הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בסוף הדגירה, להעביר את כל תכולת הצינור לתוך צלחת תרבות 100 מילימטר, ולעצור את העיכול עם 10 עד 15 מיליליטר של חיץ עצירה מקורר מראש. באמצעות מגרד תאים, להסיר בעדינות את תאי אנדותל האאורטיק מפני השטח הפנימיים של הכלי, ולשטוף את הכלי שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של חיץ כביסה לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, ולשטוף את החלק התחתון של צלחת התרבות פעמיים עם חמישה מיליליטר של חיץ כביסה טרי, לכל לשטוף, מושך את הכביסה בצינור 50 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ולהשליך את כל אבל האחרון 10 מיליליטר של על טבעי. הוסף 20 מיליליטר של חיץ כביסה כדי resuspend את גלולה, דואג להימנע בועות, ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת.תן את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות התא לספירה, צלחת התאים ב 1-10 לשישה תאים לכל 25 ס"מ בריבוע ריכוז הבקבוק. לאחר מכן מניחים את התאים באינקובטור תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני, ומרעננים את המדיום כל יומיים-שלושה. לאחר הבידוד, תאי ה אנדותל נבדקים ביום אפס, אחד ושניים, ולאחר מעברים אחד ושתיים לזיהום והערכה מורפולוגית שלהם.ניתוח ציטומטרי זרימה באמצעות נוגדן נגד CD31-FITC מציין בדרך כלל יותר מ 97% סמן תא אנדותל אוכלוסייה חיובית ביום השלישי של התרבות, זה נשמר על מעל 90% טוהר גם לאחר שני קטעים. המשטח ה אנדותל של aorta היה גירד רק בכיוון אחד, עם מגרד תא, במשך פחות מ 10 פעמים, וזה לא נדחס במהלך תהליך של גירוד. התשובה הטובה ביותר, שיטה ממוטבת של בידוד pAECs, אנו יכולים להשתמש pAECs מטוהרים לבצע ניסויים בודדים ולחקור את הדחייה החיסונית ואת תגובת קרישה ב xenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...