Name: isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

이 작품은 광동성 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다, 보조금 / 수상 번호: 2016A030313028; 광동성 의학 과학 연구 재단, 보조금 / 수상 번호: B2018003; 심천 과학 기술 재단, 그랜트 / 수상 번호: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY202022229204449975, GJHZ2022920449975, GJHZ20170331417135556, JCYJ20201604011 및 JCYJ2016040440404040 심천 롱화 지구 과학 기술 재단, 보조금 / 수상 번호: 2017013; 중국 의 국가 주요 R & D 프로그램, 보조금 / 수상 번호: 2017YFC1103704; 심천에서 의학의 산밍 프로젝트, 그랜트 / 수상 번호: SZSM201412020; 광동성 고등병원 건립특별기금(2019년) 심천의 높은 수준의 의료 분야 건설을위한 기금, 보조금 / 수상 번호: 2016031638; 심천 건강 및 가족 계획 위원회의 재단, 보조금 / 수상 번호 : SZXJ2017021 및 SZXJ2018059. 우리는 원고의 준비를 도와 준 심천 대학에서 한청 장과 Zhicheng Zou 감사합니다.

동물의 사용은 동물 복지의 원칙에 따라 심천 제 2 인민 병원의 윤리 검토위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 동물, 중간 및 완충제 의 준비
<ol><li>미니어처 돼지를 준비합니다. 참고 : 모든 미니어처 돼지는 중국 우지산 또는 바마 돼지 (수컷)였다. 돼지의 연령 및 체중은 각각 100일간 ±8일 및 5.7 kg±1.0 kg(평균±SD, n=3)이었다.</li>
	<li>배양 배지를 준비하십시오: 내피 세포 배지 ...

<ol>
	<li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+transplantation+in+China:+concerns+remain.">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li><li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+xenotransplantation:+the+next+medical+revolution?.">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?.</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li><li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research.">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li><li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells:+role+in+infection+and+inflammation.">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li><li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation:+prospects+for+the+future.">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li><li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators.">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li><li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells.">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li><li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized,+Blinded,+Placebo+Controlled+Trial.">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1/Cmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model.">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).</li><li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro.">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li><li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro.">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70,+heat+shock+protein+32,+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells.">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells:+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders.">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li><li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization.">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li><li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration.">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li><li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+death,+angiogenesis,+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor:+role+of+vascular+endothelial+growth+factor.">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li><li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells.">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).</li><li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung.">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li><li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol.">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow.">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li><li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li><li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic.">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li><li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips.">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).</li><li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells:+a+comparative+ultrastructural+study.">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li><li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues.">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li><li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+complementary+digestion+patterns.">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li><li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection.">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li></ol>

내피 세포는 혈관 기능 장애, 당뇨병, 조직 재생, 이식 및 암14,15,16,17,18의연구에 일반적으로 사용된다. 이러한 질병에서 EC의 생물학 및 기능을 이해하고 특성화하기 위해, 다른 병든 장기 또는 조직의 EC를 분리하는 수많은 방법이8,19,</...

이식에 사용할 수 있는 장기의 부족은 전세계적으로 눈에 띄는 문제 1. 중국 적십자사에 따르면, 2018년 중국에서 말기 장기 부전 환자 중 소수의 환자만이 적합한 장기를 받았다고 합니다.
Xenotransplantation은 장기 부족 문제를 해결할 수있는 유망한 방법입니다. 돼지 장기는 해부학및 생리적 유사성 때문에 인간에게 가장 적합한기관으로 간주되며 2,3. 돼지 이종이식의 실패는 주로 영장류 면역 거부 및 응고 반응과 관련이 있다. 돼지 내피 세포(ECs)는 이들 세포가 항체, 보체, 사이토카인 및 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 및 대식세포)를 포함하는 영장류 면역계와 상호 작용하는 첫 번째 세포이기 때문에 중요하다 4,5. 돼지 장기와 아일렛 이종이식6,7에서중요한 역할을 하는 돼지 ECs. 따라서, ECs는 돼지 이식편에 대한 거부 및 응고 반응을 조사하기 위한 중요한 세포이다. 이종이식 연구에는 고품질 돼지 EC의 분리가 필요합니다.
상이한 장기(예를 들어, 심장, 신장, 간 및 대류)로부터 EC를 분리하려는 시도에서, 여러 프로토콜은8, 9,10,11,12를 이종이식으로 보고되었다. 그러나 격리된 EC의 초순수 문화를 유지하는 것은 표준 프로토콜에서 뛰어난 문제입니다. 소화 된 용액의 농도 증가, 부적절한 소화 시간 및 긁힘 강도는 현재연구에서섬유 아세포 오염 증가8,10,13에기여할 수 있습니다. 게다가, 소형 돼지에서 분리 된 pAECs의 방법은 덜 연구된다. 여기서, 우리는 소형 돼지 (우지산 또는 바마)에서 고도로 정제 된 pAECs를 분리하는 최적화 된 효소 방법을 설명합니다. 프로토콜의 여러 단계는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 EC를 얻기 위해 고안되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1163px;" width="1164">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BD FACSAria II</td>
			<td style="width:424px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Boneforceps</td>
			<td style="width:424px;">Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;">HL-YGQ&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BOON Disposable Syringe (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:424px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:142px;">MCA1746F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3010#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:142px;">C5138#-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:280px;">Compound ketamine injection&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;">Ketamine Hydrochloride&#65306;0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride&#65306;1mg/2ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">D1306#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">DMEM</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">11965118#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECM</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1001#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECGS</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1052#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&#160;</td>
			<td style="width:424px;">AXYGEN</td>
			<td style="width:142px;">MCT-150-C#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Falcon 100mm Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:424px;">Corning</td>
			<td style="width:142px;">353003#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">10270-106#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Flowjo v10.0</td>
			<td style="width:424px;"></td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Iodine tincture</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Miniature Pig (Bama or Wuzhishan)</td>
			<td style="width:424px;">Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Mshot microscope&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:142px;">M152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Petri Dishes (150 x 15 mm)</td>
			<td style="width:424px;">Biologixgroup</td>
			<td style="width:142px;">66-1515#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">15070063#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap &#65288;T25&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3289#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Scissors</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Serological Transfer Pipettes (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">JET Biofil</td>
			<td style="width:142px;">GSP010010#&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:424px;">GeneBrick</td>
			<td style="width:142px;">GY0025#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Syringe Filter (0.22&#181;m)</td>
			<td style="width:424px;">Millipore</td>
			<td style="width:142px;">SLGV033RS#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;">22#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical suture</td>
			<td style="width:424px;">Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:280px;">Syringe&#65288;5mL&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">25200056#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">75% Medical alcohol</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free)</td>
			<td style="width:424px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:142px;">B540627#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Medical disinfectant 84 liquid</td>
			<td style="width:424px;">Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">450ml/bottle</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs

Xenotransplantation은 말기 장기 부전 환자를 위한 인간 기관의 부족을 해결하는 유망한 방법이고, 돼지는 적당한 기관 근원으로 여겨됩니다. 면역 거부 및 응고는 이종이식의 성공을 위한 2개의 중요한 장애물입니다. 혈관 내피 세포 (EC) 손상 및 기능 장애는 이종이식에서 염증 및 응고 반응의 발달에 중요하다. 따라서, 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)의 분리는 면역 거부 반응 및 응고 반응을 조사하기 위해 필요하다. 여기에서, 우리는 소형 돼지에서 고도로 정제된 pAE의 격리, 특성화 및 확장을 위한 간단한 효소 접근법을 개발했습니다. 첫째, 미니어처 돼지는 케타민으로 마취되었고, 대공의 길이를 절제시켰다. 둘째, 대치의 내피 표면은 0.005 % 콜라게나아제 IV 소화액에 15 분 동안 노출되었습니다. 셋째, 대초원의 내피 표면은 세포 스크레이퍼 (<10 회)로 한 방향으로만 긁어 내고 (<10 번), 및 의 과정에서 압축되지 않았습니다. 긁. 마지막으로, 제3일의 단리된 pAECs, 및 제1및 2항 후에, 항-CD31 항체를 가진 유세포측정에 의해 확인되었다. CD31 양성 세포의 백분율은 각각 97.4% ±1.2%, 94.4% ±1.1%, 및 92.4% ±1.7%(평균 ±SD)였다. 콜라게나아제 IV의 농도, 소화 시간, 방향, 스크레이핑의 빈도 및 강도는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 및 많은 수의 EC를 얻는 데 매우 중요합니다. 결론적으로, 우리의 효소 방법은 소형 돼지 대원으로부터 EC를 분리하는 고효율 방법이며, 세포는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하기 위해 시험관 내에서 확장 될 수 있습니다.

우리의 방법은 소형 돼지에서 대불에서 고도로 정제 된 EC를 분리하는 효과적인 방법을 제공하는 것을 목표로합니다. 대동맥 수술 의 과정은 그림1에 도시되어 있습니다. 첫 번째 단계는 전체 대류가 돼지에서 절제된다는 것입니다. 다른 세포 또는 세균 오염을 방지하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, 표적세포나 세균이 대류를 오염시킬 경우 다른 장기 나 조직을 손상시키?...

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Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

소형 돼지로부터 1차 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)를 분리하는 효과적인 효소 방법이 설명되어 있다. 단리된 1차 pAECs는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

이 방법은 소형 돼지로부터 내피 세포를 격리시키는 매우 효과적인 방법입니다. 그리고 세포도 확장될 수 있고, xeno이식에서 면역 및 응고 반응을 조사한다. 기술의 주요 장점은 돼지로부터 고도로 정제된 내피 세포를 분리하는 것이 쉽고 매우 효과적일 뿐만 아니라 다른 PC를 통과할 때 유지하는 것이 더 낫다는 것입니다.마취돼지의 통증 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 돼지 복벽을 75%의 의료 알코올로 3회 세척하고 요오드 1개를 씻어낸다. 마지막 세척 후 메스를 사용하여 복부 절개를 하여 열등한 베나 카바를 노출시키고 5밀리리터 주사기를 사용하여 5000단위의 헤파린 나트륨을 열등한 베나 카바에 주입합니다. 5분 후, 카테터를 복부 대어타에 삽입하고 메스를 사용하여 다이어프램을 절개합니다.두 번째 조사자의 도움으로 왼쪽 심실을 제거하고 뼈 집게를 사용하여 갈비뼈를 절제하여 심장과 폐를 노출시합니다. 대자 후방을 심장과 폐에 찾아 끝을 고정시다. 가위를 사용하여 대어타를 소비하고 미리 냉각된 세척 버퍼로 한 번 세척합니다.멸균 집게와 가위로 대어타 주변에 과도한 조직을 제거하고, 실험실로 이송하기 위해 신선한 미리 냉각된 세척 버퍼를 포함하는 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 용기를 놓습니다. 돼지 대동맥 내피 세포 절연의 경우 돼지 대동맥을 무균 조건하에서 150mm 페트리 접시로 옮기고 혈관의 양 끝을 부드럽게 제거하십시오. 혈관이 고정된 여분의 여분의 조직을 멸균 집게와 가위로 다듬고 20~50밀리리터의 신선한 세척 버퍼를 사용하여 대오르타 의 외부와 내부를 헹구세요.다음으로, 대자를 통해 외과 봉합사를 전달하고, 느슨하게 혈관의 한쪽 끝을 묶어 루멘 내에서 봉합사를 유지합니다. 집게로 묶인 끝 부근의 대어타를 부드럽게 고정한 다음 수술 봉합사를 천천히 당겨 대마의 내피 표면이 노출될 때까지 대마를 반전시다. 대마의 내피 표면을 세척당 신선한 세척 버퍼 10 밀리리터로 세 번 씻고 대마를 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다.샘플을 섭씨 37도의 10 밀리리터로 덮고 0.005%의 콜라게나아제 IV 소화용액을 데우고, 15분 동안 37°C에서 조직을 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 전체 튜브 내용물이 100mm 배양 접시로 옮기고, 미리 냉각된 정지 버퍼의 10~15밀리리터로 소화를 체포한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 용기의 내부 표면에서 대동맥 내피 세포를 부드럽게 제거하고 세척당 5 밀리리터의 세척 버퍼로 용기를 세 번 씻습니다.마지막 세척 후, 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 옮기고, 50 밀리리터 튜브의 세척을 당 5 밀리리터의 신선한 세척 버퍼로 문화 접시의 바닥을 두 번 씻습니다. 원심 분리에 의해 세포를 수집하고, 상류체의 마지막 10 밀리리터를 제외한 모든 폐기. 20 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하여 펠릿을 재일시 중단하고 거품을 피하고 다른 원심 분리로 세포를 수집합니다.계산을 위해 세포 배양 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 25센티미터 제곱 플라스크 농도당 6개의 세포에 11회 10시에 세포를 플레이트한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 세포를 5%의 이산화탄소에 섭씨 37도에 놓고 2~3일마다 배지를 상쾌하게 한다. 격리 후, 내피 세포는 0일, 1, 2일에 검사되고, 오염 및 형태학적 평가를 위해 1개와 2개의 구절 후에 검사됩니다.항 CD31-FITC 항체를 이용한 유동 세포 분석은 배양 3일째에 전형적으로 97%이상의 내피세포 마커 양성 집단을 나타내며, 이는 두 구절 후에도 90% 이상의 순도로 유지된다. 대자의 내피 표면은 셀 스크레이퍼로 10배 미만의 한 방향으로만 긁어내고, 스크래핑 과정에서 압축되지 않았다. 가장 좋은 대답, pAEC 격리의 최적화 된 방법, 우리는 개별 실험을 수행하고 xeno 이식에서 면역 거부 및 응고 반응을 조사하기 위해 정제 된 pAEC를 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...