Name: isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

Arbetet stöddes av bidrag från Natural Science Foundation i Guangdongprovinsen, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medicinsk vetenskaplig forskning stiftelse i Guangdongprovinsen, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Stiftelsen för vetenskap och teknik, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 och JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Stiftelsen för vetenskap och teknik, Grant/Award nummer: 2017013; Nationella nyckel R & D program i Kina, Grant/Award nummer: 2017YFC1103704; Sanming projekt av medicin i Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Särskilda fonder för byggande av sjukhus på hög nivå i Guangdongprovinsen (2019); Fond för hög nivå medicinsk disciplin konstruktion av Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health och familjeplanering provision, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 och SZXJ2018059. Vi tackar Hancheng Zhang och Zhicheng ZOU från Shenzhen University för att bistå vid utarbetandet av manuskriptet.

Användningen av djur godkändes av etik prövnings kommittén i Shenzhen Second People ' s Hospital, i enlighet med principerna för djurens välbefinnande.
1. beredning av djur, medium och buffertar
<ol><li>Förbered miniatyr gris. Obs: alla miniatyr grisar var kinesiska Wuzhishan eller Bama svin (hane). Svinens ålder och vikt var 100 dagar ± 8 dagar och 5,7 kg ± 1,0 kg (medelvärde ± SD, n = 3).</li>
	<li>Förbered odlingsmediet: endotelcellmedium (ECM) kompletterat med 10% (v/v) v...

<ol>
	<li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+transplantation+in+China:+concerns+remain.">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li><li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+xenotransplantation:+the+next+medical+revolution?.">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?.</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li><li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research.">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li><li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells:+role+in+infection+and+inflammation.">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li><li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation:+prospects+for+the+future.">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li><li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators.">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li><li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells.">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li><li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized,+Blinded,+Placebo+Controlled+Trial.">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1/Cmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model.">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).</li><li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro.">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li><li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro.">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70,+heat+shock+protein+32,+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells.">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells:+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders.">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li><li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization.">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li><li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration.">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li><li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+death,+angiogenesis,+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor:+role+of+vascular+endothelial+growth+factor.">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li><li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells.">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).</li><li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung.">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li><li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol.">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow.">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li><li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li><li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic.">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li><li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips.">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).</li><li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells:+a+comparative+ultrastructural+study.">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li><li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues.">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li><li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+complementary+digestion+patterns.">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li><li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection.">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li></ol>

Endotelceller används ofta i forskning av vaskulär dysfunktion, diabetes, vävnadsregenerering, transplantation, och cancer14,15,16,17,18. För att förstå och karakterisera ECS biologi och funktion i dessa sjukdomar har många metoder för att isolera ECS av olika sjuka organ eller vävnader rapporterats8,<sup class="xref...

Bristen av tillgängliga organ för transplantation är ett utstående problem World-Wide1. Enligt röda korset i Kina, fick endast ett litet antal patienter med slutstadiet organsvikt ett lämpligt organ i Kina 2018.
Xenotransplantation är ett lovande sätt att lösa problemet med organbrist. Gris organ anses vara de lämpligaste organen för människor på grund av anatomiska och fysiologisk likheter2,3. Misslyckandet med en gris xenograft är till stor del relaterad till primater immun avvisande och koagulation svar. Porcin endotelceller (ECs) är kritiska eftersom dessa celler är de första att interagera med primat immunsystemet, som inkluderar antikropp, komplement, cytokiner, och immunceller (t. ex., t-celler, B-celler, och makrofager)4,5. Svin ECs spelar en viktig roll i gris-orgel och Holmen xenotransplantation6,7. Därför är ECs viktiga celler för att undersöka avstötning och koagulering svar på en gris transplantat. För xenotransplantations forskning krävs isolering av högkvalitativa svin.
I försök att isolera ECs från olika organ (t. ex. hjärta, njure, lever och aorta) har flera protokoll rapporterats i en xenotransplantationinställning8,9,10,11,12. Men att hålla en ultrarent kultur av isolerade ECs är ett enastående problem i standardprotokoll. Den ökade koncentrationen av den smälta lösningen, olämplig digestionstid och skrapintensitet kan bidra till ökad fibroblastkontamination i aktuella studier8,10,13. Dessutom undersöks metoden med isolerade pAECs från minigrisar. Här beskriver vi en optimerad enzymatisk metod för att isolera högrenade pAECs från miniatyr grisar (Wuzhishan eller Bama). Flera steg i protokollet har utformats för att minska fibroblastkontaminering och få hög renhet ECs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1163px;" width="1164">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BD FACSAria II</td>
			<td style="width:424px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Boneforceps</td>
			<td style="width:424px;">Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;">HL-YGQ&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BOON Disposable Syringe (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:424px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:142px;">MCA1746F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3010#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:142px;">C5138#-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:280px;">Compound ketamine injection&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;">Ketamine Hydrochloride&#65306;0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride&#65306;1mg/2ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">D1306#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">DMEM</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">11965118#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECM</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1001#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECGS</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1052#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&#160;</td>
			<td style="width:424px;">AXYGEN</td>
			<td style="width:142px;">MCT-150-C#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Falcon 100mm Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:424px;">Corning</td>
			<td style="width:142px;">353003#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">10270-106#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Flowjo v10.0</td>
			<td style="width:424px;"></td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Iodine tincture</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Miniature Pig (Bama or Wuzhishan)</td>
			<td style="width:424px;">Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Mshot microscope&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:142px;">M152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Petri Dishes (150 x 15 mm)</td>
			<td style="width:424px;">Biologixgroup</td>
			<td style="width:142px;">66-1515#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">15070063#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap &#65288;T25&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3289#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Scissors</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Serological Transfer Pipettes (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">JET Biofil</td>
			<td style="width:142px;">GSP010010#&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:424px;">GeneBrick</td>
			<td style="width:142px;">GY0025#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Syringe Filter (0.22&#181;m)</td>
			<td style="width:424px;">Millipore</td>
			<td style="width:142px;">SLGV033RS#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;">22#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical suture</td>
			<td style="width:424px;">Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:280px;">Syringe&#65288;5mL&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">25200056#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">75% Medical alcohol</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free)</td>
			<td style="width:424px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:142px;">B540627#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Medical disinfectant 84 liquid</td>
			<td style="width:424px;">Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">450ml/bottle</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs

Xenotransplantation är ett lovande sätt att lösa bristen på mänskliga organ för patienter med slutstadiet organsvikt, och grisen betraktas som en lämplig organ källa. Immun avvisande och koagulering är två stora hinder för en lyckad xenotransplantation. Vaskulär endotelcell (EG) skada och dysfunktion är viktiga för utvecklingen av inflammation och koagulation svar i xenotransplantation. Sålunda, isolering av svin aorta endotelceller (paecs) är nödvändig för att undersöka immun avvisande och koagulation svar. Här har vi utvecklat en enkel enzymatisk metod för isolering, karakterisering och utbyggnad av höggradigt renade pAECs från minigrisar. Först var miniatyr gris bedövas med ketamin, och en längd av aorta var excised. För det andra, den endoteliala ytan av aorta utsattes för 0,005% kollagenase IV matsmältnings lösning för 15 min. för det tredje, den endoteliala ytan av aorta skrapades i endast en riktning med en cell skrapa (< 10 gånger), och var inte komprimeras under processen för Skrapa. Slutligen identifierades de isolerade pAECs av dag 3, och efter passage 1 och passage 2, av flödescytometri med en anti-CD31 antikropp. Andelen CD31-positiva celler var 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1%, och 92,4% ± 1,7% (medelvärde ± SD), respektive. Koncentrationen av kollagenas IV, matsmältnings tiden, riktningen, och frekvens och intensitet av skrapning är avgörande för att minska fibroblast förorening och få hög renhet och ett stort antal ECs. Sammanfattningsvis är vår enzymatiska metod en mycket effktiv metod för att isolera ECs från miniatyr svinaorta, och cellerna kan utökas in vitro för att undersöka immun-och koagulations svaren i xenotransplantation.

Vår metod syftar till att ge ett effektivt sätt att isolera högrenade ECs från artärer från miniatyr grisar. Processen för aorta kirurgi visas i figur 1. Det första steget är att hela aorta är censurerade från grisen. Att förhindra annan cell-eller bakterieförorening är mycket viktigt. Således, inte skadar andra organ eller vävnader i fall oriktade celler eller bakterier förorenat aorta, och tvätta aorta med förkyld tvätt buffert 3x (figur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

En effektiv enzymatisk metod för isolering av primära svin aorta endotelceller (pAECs) från miniatyr grisar beskrivs. De isolerade primära pAECs kan användas för att undersöka immun-och koagulations reaktionen vid xenotransplantation.

Isolering och kultur av primära aortic endotelceller från miniatyr svin

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Metoden är en mycket effektiv metod för att isolera endotelceller från miniatyrgris. Och cellerna kan utökas också, undersöka immun- och koagulationssvaret i xenotransplantation. Den största fördelen med teknik är att det inte bara är lätt, mycket effektivt att isolera mycket renad endotelceller från gris, men också bättre för att hålla andra pAECs när passage.Efter att ha bekräftat en brist på svar på smärtreflex i den sövda grisen, tvätta porcin bukväggen tre gånger med 75%medicinsk alkohol, och en tinktur av jod. Efter den sista tvätten, använd en skalpell för att göra ett bukans snitt för att exponera den sämre vena cava, och använd en fem milliliter spruta för att injicera 5000 enheter heparin natrium i sämre vena cava. Efter fem minuter, sätt in en kateter i buken aorta, och använda en skalpell för att incise membranet.Med hjälp av en andra utredare, ta bort den vänstra ventrikeln och använda bentröjningar för att punktskatt revbenen för att exponera hjärta och lungor. Lokalisera aorta posterior till hjärtat och lungorna, och klämma ändarna. Använd sax för att punktskatt aorta, och tvätta den en gång med färdigkyld tvätt buffert.Avlägsna eventuellt överflödig vävnad runt aorta med sterila tlysen och saxar, och placera kärlet i ett centrifugeringsrör på 50 milliliter som innehåller färsk förkyld tvättbuffert för överföring till laboratoriet. För svin aorta endotel cell isolering, överföra grisaortan till en 150 millimeter petriskål under aseptiska förhållanden, och försiktigt bort båda ändarna av kärlet. Trimma ytterligare överflödig vävnad där kärlet hade klämts fast, med sterila tlyktor och saxar, och använd 20 till 50 milliliter färsk tvättbuffert för att skölja ut- och insidan av aorta.Därefter passerar en kirurgisk sutur genom aorta, och löst knyta ena änden av kärlet, hålla suturen inom lumen. Försiktigt fixera stora stora delar nära den bundna änden med tärna och dra sedan den kirurgiska suturen långsamt, för att vända aorta, tills aortans endotelyta är utsatt. Tvätta aortans endotelyta tre gånger med 10 milliliter färsk tvättbuffert per tvätt, och placera aortan i ett 15 millilitercentrifugrör.Täck provet med 10 milliliter av 37 grader Celsius värms 0,005%kollagenas IV matsmältningslösning, och inkubera vävnaden vid 37 grader Celsius i 15 minuter. I slutet av inkubationen överför du hela rörinnehållet till en 100 millimeters odlingsfat och arresterar matsmältningen med 10 till 15 milliliter färdigkyld stoppbuffert. Med hjälp av en cellskrapa, ta försiktigt bort aorta endotelceller från insidan av kärlet, och tvätta kärlet tre gånger med fem milliliter tvättbuffert per tvätt.Efter den sista tvätten, överför supernatanten till ett 50 milliliter centrifugrör och tvätta botten av odlingsfatet två gånger med fem milliliter färsk tvättbuffert, per tvätt, dra tvättarna i 50 milliliterröret. Samla cellerna genom centrifugeringen, och kassera alla utom de sista 10 milliliter av supernatant. Tillsätt 20 milliliter tvättbuffert för att resuspend pelleten, var noga med att undvika bubblor, och samla in cellerna med en annan centrifugation.Resuspend pelleten i en milliliter cellodling medium för räkning, och platta cellerna på en gånger tio till de sex cellerna per 25 centimeter kvadratkollar koncentration. Placera sedan cellerna i cellodlingsinkubatorn på 37 grader Celsius i 5%koldioxid, uppfriskande mediet varannan till var tredje dag. Efter isolering inspekteras endoteliala cellerna på dag noll, ett och två, och efter passager ett och två för kontaminering och deras morfologiska utvärdering.Flöde cytometrisk analys med hjälp av en anti-CD31-FITC antikropp indikerar en typiskt större än 97%endotel cell markör positiv befolkning dag tre av kultur, som upprätthålls på en över 90%renhet även efter två passager. Aortans endotelyta skrapades i endast en riktning, med en cellskrapa, i mindre än 10 gånger, och den komprimerades inte under processen för skrapning. Bästa svaret, optimerad metod för pAECs isolering, vi kan använda renade pAECs att utföra enskilda experiment och undersöka immun avstötning och koagulation svar i xenotransplantation.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolering av valvulär endotelceller

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolering och odling av pulmonell endotelceller från neonatala möss

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Generation och kultur of Blood utväxt endotelceller från humant perifert blod

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering och kultur av primära muskeratinocyter från neonatal och vuxen mushud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...