Name: isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

Çalışma Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibe, Hibe / Ödül Numarası: 2016A030313028 tarafından desteklenmiştir; Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: B2018003; Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ2016042511ve JCYJ201604281420444444444444444444444444444444444444444444444444444444444442; Shenzhen Longhua Bölge Bilim ve Teknoloji Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: 2017013; Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı, Hibe/Ödül Numarası: 2017YFC103704; Shenzhen Tıp Sanming Projesi, Hibe / Ödül Numarası: SZSM201412020; Guangdong Eyaleti Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar (2019); Shenzhen Yüksek Düzeyde Tıbbi Disiplin İnşaatı Fonu, Hibe/Ödül Numarası: 2016031638; Shenzhen Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: SZXJ2017021 ve SZXJ2018059. Biz Hancheng Zhang ve Zhicheng Zou Shenzhen Üniversitesi'nden el yazması hazırlanmasında yardımcı olmak için teşekkür ederiz.

Hayvanların kullanımı Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi tarafından, hayvan refahı ilkelerine uygun olarak onaylandı.
1. Hayvanların, orta ve tamponların hazırlanması
<ol><li>Minyatür domuzu hazırlayın. NOT: Tüm minyatür domuzlar Çin Wuzhishan veya Bama domuz (erkek) idi. Domuzların yaşı ve ağırlığı sırasıyla 100 gün ± 8 gün ve 5.7 kg ± 1.0 kg (ortalama ± SD, n = 3) idi.</li>
	<li>Kültür ortamını hazırlayın: endotel hücreli orta (...

<ol>
	<li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+transplantation+in+China:+concerns+remain.">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li><li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+xenotransplantation:+the+next+medical+revolution?.">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?.</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li><li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research.">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li><li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells:+role+in+infection+and+inflammation.">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li><li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation:+prospects+for+the+future.">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li><li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators.">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li><li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells.">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li><li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized,+Blinded,+Placebo+Controlled+Trial.">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1/Cmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model.">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).</li><li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro.">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li><li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro.">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+70,+heat+shock+protein+32,+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells.">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells:+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders.">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li><li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization.">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li><li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration.">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li><li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+death,+angiogenesis,+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor:+role+of+vascular+endothelial+growth+factor.">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li><li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells.">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).</li><li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung.">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li><li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol.">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow.">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li><li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li><li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic.">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li><li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips.">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).</li><li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells:+a+comparative+ultrastructural+study.">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li><li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues.">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li><li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+complementary+digestion+patterns.">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li><li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection.">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li><li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+fibroblast+cultures.">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li></ol>

Endotel hücreleri yaygın vasküler disfonksiyon araştırmalarında kullanılır, diyabet, doku rejenerasyonu, transplantasyon, ve kanserler14,15,16,17,18. Anlamak ve bu hastalıklarda ECs işlevini anlamak ve karakterize etmek için, farklı hastalıklı organ veya dokuların ECs izole etmek için çok sayıda yöntem bildirilmiştir8</sup...

Transplantasyon için mevcut organ sıkıntısı dünya çapındaolağanüstü bir sorundur 1. Çin Kızıl Haç Derneği'ne göre, 2018 yılında Çin'de son dönem organ yetmezliği olan hastaların sadece az sayıda uygun bir organ aldı.
Xenotransplantasyon organ yetersizliği sorununu çözmek için umut verici bir yoldur. Domuz organları anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle insanlar için en uygun organ olarak kabul edilir2,3. Bir domuz ksenograft yetmezliği büyük ölçüde primat bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtları ile ilgilidir. Bu hücreler antikor, kompleman, sitokinler ve bağışıklık hücreleri (örneğin, T hücreleri, B hücreleri ve makrofajlar)4,5içeren primat bağışıklık sistemi ile etkileşime ilk beri domuz eti endotel hücreleri (ECs) kritiktir . Domuz eti ecs domuz organ ve adacık xenotransplantasyon hayati bir rol oynamaktadır6,7. Bu nedenle, ECs bir domuz grefti reddi ve pıhtılaşma yanıtları araştırmak için önemli hücrelerdir. Knenotransplantasyon araştırmaları için yüksek kaliteli domuz eti izolasyonu gereklidir.
Farklı organlardan (örneğin, kalp, böbrek, karaciğer ve aort) EC'leri izole etme girişimlerinde, xenotransplant ayarında8,9,10,11,12gibi çeşitli protokoller bildirilmiştir. Ancak, yalıtılmış EC'lerin ultra saf kültürünü korumak standart protokollerde olağanüstü bir sorundur. Sindirilmiş çözeltinin artan konsantrasyonu, uygun olmayan sindirim süresi ve sıyrık yoğunluğu mevcut çalışmalarda artmış fibroblast kontaminasyonuna katkıda bulunabilir8,10,13. Ayrıca, minyatür domuzizole pAECs yöntemi daha az çalışılmıştır. Burada, minyatür domuzlardan (Wuzhishan veya Bama) yüksek oranda saflaştırılmış pAEC'leri izole etmek için optimize edilmiş bir enzimatik yöntemi tanımlıyoruz. Protokoldeki birkaç adım fibroblast kontaminasyonunu azaltmak ve yüksek saflıkta EC'ler elde etmek için tasarlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1163px;" width="1164">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BD FACSAria II</td>
			<td style="width:424px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Boneforceps</td>
			<td style="width:424px;">Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;">HL-YGQ&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">BOON Disposable Syringe (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:424px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:142px;">MCA1746F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3010#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:142px;">C5138#-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:280px;">Compound ketamine injection&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;">Ketamine Hydrochloride&#65306;0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride&#65306;1mg/2ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">D1306#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">DMEM</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">11965118#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECM</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1001#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">ECGS</td>
			<td style="width:424px;">Sciencell</td>
			<td style="width:142px;">1052#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&#160;</td>
			<td style="width:424px;">AXYGEN</td>
			<td style="width:142px;">MCT-150-C#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Falcon 100mm Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:424px;">Corning</td>
			<td style="width:142px;">353003#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">10270-106#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Flowjo v10.0</td>
			<td style="width:424px;"></td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:424px;">Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Iodine tincture</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Miniature Pig (Bama or Wuzhishan)</td>
			<td style="width:424px;">Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td style="width:318px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Mshot microscope&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:142px;">M152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Petri Dishes (150 x 15 mm)</td>
			<td style="width:424px;">Biologixgroup</td>
			<td style="width:142px;">66-1515#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:424px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:142px;">15070063#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap &#65288;T25&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:142px;">3289#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Scissors</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Serological Transfer Pipettes (10ml)</td>
			<td style="width:424px;">JET Biofil</td>
			<td style="width:142px;">GSP010010#&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:424px;">GeneBrick</td>
			<td style="width:142px;">GY0025#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Syringe Filter (0.22&#181;m)</td>
			<td style="width:424px;">Millipore</td>
			<td style="width:142px;">SLGV033RS#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:424px;">ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;">22#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Surgical suture</td>
			<td style="width:424px;">Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:280px;">Syringe&#65288;5mL&#65289;</td>
			<td style="width:424px;">Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:424px;">GIBCO</td>
			<td style="width:142px;">25200056#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">75% Medical alcohol</td>
			<td style="width:424px;">Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td>
			<td style="width:142px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free)</td>
			<td style="width:424px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:142px;">B540627#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Medical disinfectant 84 liquid</td>
			<td style="width:424px;">Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td style="width:142px;">450ml/bottle</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs

Xenotransplantasyon son dönem organ yetmezliği olan hastalar için insan organı sıkıntısı gidermek için umut verici bir yoldur, ve domuz uygun bir organ kaynağı olarak kabul edilir. Bağışıklık reddi ve pıhtılaşma ksenotransplantasyonun başarısı için iki önemli engeldir. Vasküler endotel hücresi (EC) yaralanması ve disfonksiyonu ksenotransplantasyonda inflamasyon ve koagülasyon yanıtlarının gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, domuz etitik endotel hücrelerinin izolasyon (pAECs) bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtları araştırmak için gereklidir. Burada, minyatür domuzlardan son derece saflaştırılmış pAEC'lerin izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi için basit bir enzimatik yaklaşım geliştirdik. İlk olarak, minyatür domuz ketamin ile anestezi ve aort uzunluğu çıkarıldı. İkinci olarak, aort endotel yüzeyi 15 dk. Üçüncü, aort endotel yüzeyi bir hücre kazıyıcı ile sadece bir yönde kazınmış oldu (<10 kez) için% 0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi maruz kaldı ve süreci sırasında sıkıştırılmış değildi Kazıma. Son olarak, 3. CD31-pozitif hücrelerin yüzdeleri sırasıyla %97.4 ± %1.2, %94.4 ± %1.1 ve %92.4 ± %1.7 (ortalama ± SD) idi. Kollajenaz IV konsantrasyonu, sindirim süresi, yönü ve sıklığı ve kazıma sıklığı ve yoğunluğu fibroblast kontaminasyonu azaltmak ve yüksek saflıkta ve ECs çok sayıda elde etmek için önemlidir. Sonuç olarak enzimatik yöntemimiz, minyatür domuz aortundaki EC'leri izole etmek için son derece etkili bir yöntemdir ve ksenotransplantasyonda immün ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için hücreler in vitro olarak genişletilebilir.

Yöntemimiz, yüksek oranda arıtılmış EC'leri aortlardan minyatür domuzlardan ayırmak için etkili bir yol sağlamayı amaçlamaktadır. Aort cerrahisi süreci Şekil1'de gösterilmiştir. İlk adım, tüm aort domuz dan excised olmasıdır. Diğer hücre veya bakteriyel kontaminasyonu önlemek çok önemlidir. Bu nedenle, hedeflenmemiş hücre veya bakteri aort kontamine durumda diğer organ veya dokuları zarar vermez ve önceden soğutulmuş yıkama tampon 3x ile aort yıkayın (Şe...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Primer domuz aort endotel hücrelerinin (pAECs) minyatür domuzlardan izolasyonu için etkili bir enzimatik yöntem tanımlanmıştır. İzole primer pAEC'ler ksenotransplantasyonda immün ve koagülasyon yanıtını araştırmak için kullanılabilir.

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Yöntem minyatür domuz endotel hücrelerini izole etmek için son derece etkili bir yöntemdir. Ve hücreler de genişletilebilir, knenotransplantasyonda immün ve pıhtılaşma yanıtını araştırın. Tekniğin ana avantajı domuz son derece saflaştırılmış endotel hücrelerini izole etmek için sadece kolay, son derece etkili değil, aynı zamanda diğer PAECs ne zaman geçerken tutmak için daha iyi olmasıdır.Anestezi domuz ağrı refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, domuz karın duvarı üç kez yıkamak 75% tıbbi alkol, ve iyot bir tentür. Son yıkamadan sonra, inferior vena kava ortaya çıkarmak için bir karın kesi yapmak için bir neşter kullanın, ve inferior vena kava içine heparin sodyum 5000 birim enjekte etmek için beş mililitreşli şırınga kullanın. Beş dakika sonra, abdominal aort içine bir kateter takın ve diyafram incise için bir neşter kullanın.İkinci bir araştırmacı yardımıyla, sol ventrikül kaldırmak ve kalp ve akciğerlerortaya çıkarmak için kaburga çıkarmak için kemik forseps kullanın. Kalp ve akciğerler için aort posterior bulun ve uçları kelepçe. Aort çıkarmak için makas kullanın ve önceden soğutulmuş yıkama tampon ile bir kez yıkayın.Steril forseps ve makas ile aort çevresindeki herhangi bir fazla doku çıkarın ve laboratuvara transferi için taze önceden soğutulmuş yıkama tampon içeren 50 mililitrelik santrifüj tüp içine gemi yerleştirin. Domuz etit liyal hücre izolasyonu için domuz aortunu aseptik koşullarda 150 milimetrelik petri kabına aktarın ve geminin her iki ucunu nazikçe çıkarın. Damarın kenetlendiği ek fazla dokuyu steril çalgılar ve makaslarla kırpın ve aortun dışını ve içini durulamak için 20 ila 50 mililitre taze yıkama tamponu kullanın.Sonra, aort yoluyla cerrahi bir dikiş geçmek ve gevşek lumen içinde dikiş tutarak, geminin bir ucunu kravat. Aortun endotel yüzeyine maruz kalana kadar aortu ters çevirmek için aortu yavaşça bağlı ucuna yakın aortun ucunu ponplarla sabitle ve sonra cerrahi sütürü yavaşça çekin. Aort endotel yüzeyini yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve aortu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.37 santigrat derece 10 mililitre ile kapak% 0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi ısıtılır ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derece doku kuluçka. Kuluçka sonunda, 100 milimetrelik bir kültür çanağı içine tüm tüp içeriğini aktarmak ve önceden soğutulmuş durdurma tampon 10 ila 15 mililitre ile sindirim tutuklama. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, yavaşça kabın iç yüzeyinden aort endotel hücreleri kaldırmak ve yıkama başına yıkama tampon beş mililitre ile üç kez kabı yıkayın.Son yıkamadan sonra, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içine supernatant aktarın ve yıkama başına, 50 mililitrelik tüp yıkama çekerek, taze yıkama tampon beş mililitre ile kültür çanak iki kez alt yıkayın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant son 10 mililitre hariç tüm atın. Pelet resuspend için yıkama tampon 20 mililitre ekleyin, kabarcıklar önlemek için özen, ve başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak.Toplama için hücre kültürü orta bir mililitre pelet resuspend ve 25 santimetre kare şişe konsantrasyonu altı hücre ye bir kez on hücreleri plaka. Daha sonra hücre kültürü kuluçka makinesindeki hücreleri %5 karbondioksitte 37 derecede yerleştirin ve her 2-3 günde bir ortamı yeniler. İzolasyondan sonra endotel hücreleri sıfır, birinci ve ikinci gün ve birinci ve ikinci geçitlerden sonra kontaminasyon ve morfolojik değerlendirmeleri için denetlenir.Bir anti-CD31-FITC antikor kullanarak akış sitometrik analizi kültürün üçüncü gününde tipik olarak %97'den daha büyük bir endotel hücre belirteci pozitif popülasyongösterir ve bu iki pasajdan sonra bile %90'ın üzerinde saflıkta korunur. Aort endotel yüzeyi sadece bir yönde kazınmış, bir hücre kazıyıcı ile, az 10 kez, ve kazıma işlemi sırasında sıkıştırılmış değildi. En iyi cevap, pAECs izolasyon optimize yöntemi, biz bireysel deneyler gerçekleştirmek ve ksenotransplantasyon bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtı araştırmak için saflaştırılmış pAECs kullanabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...