Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

ونود أن نشكر فريق بلاتيم على دعمه التقني، وكذلك أريزكي بودووأعضاء فريق الفيزياء الحيوية في مختبر RDP لإجراء مناقشات مفيدة.

1. قياس الخصائص الميكانيكية جدار الخلية
ملاحظة: يتم تقديم مثال على تطور gynoecium من أرابيدوبسي.
<ol><li>إعداد العينات البيولوجية
	<ol>
<li>جمع برعم زهرة مغلقة في المرحلة 9 إلى 10 (حوالي 0.5 ملم طويلة) وفقا للمراحل المنشورة تحديد لArabidopsis4. تحت منظار، وذل?...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

يتم تحديد ظهور الأشكال في النباتات بشكل رئيسي من خلال معدل منسق واتجاه النمو خلال الزمان والمكان. يتم تغليف الخلايا النباتية في جدار خلية جامدة مصنوعة من مصفوفة polysaccharidic، الذي يلصق لهم معا. ونتيجة لذلك، يتم التحكم في توسيع الخلية من خلال التوازن بين ضغط التورغور سحب على جدار الخلية، وصلاب?...

ينتمي الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) إلى عائلة الفحص المجهري للمسبار المسحي (SPM)، حيث يقوم طرف بنصف قطر يبلغ عادة بضعة نانومترات بمسح سطح العينة. لا يتم الكشف عن سطح عن طريق الأساليب البصرية أو المستندة إلى الإلكترون، ولكن عن طريق قوى التفاعل بين الطرف وسطح العينة. وبالتالي، فإن هذه التقنية لا تقتصر على التوصيف الطبوغرافي لسطح العينة (دقة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تنخفض إلى بضعة نانومترات)، بل تسمح أيضا بقياس أي نوع من قوى التفاعل مثل الكهروستاتيكي، فان دير والز أو قوى الاتصال. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطرف لتطبيق القوى على سطح عينة بيولوجية وقياس التشوه الناتج، ما يسمى "المسافة البادئة"، من أجل تحديد خصائصه الميكانيكية (على سبيل المثال، معامل يونغ، خصائص لزجة).
الخصائص الميكانيكية لجدران الخلايا النباتية ضرورية يجب أخذها فيالاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة وراء العمليات التنموية 1،2،3. في الواقع، يتم التحكم في هذه الخصائص بإحكام أثناء التنمية، لا سيما منذ تليين جدار الخلية مطلوب للسماح للخلايا بالنمو. يمكن استخدام AFM لقياس هذه الخصائص ودراسة الطريقة التي تتغير بين الأعضاء والأنسجة أو مراحل النمو.
في هذه الورقة، ونحن نصف كيف نستخدم AFM لقياس كل من خصائص جدار الخلية الميكانيكية والضغط turgor. يتم عرض هذين الطلبين على اثنين من المجاهر AFM مختلفة ومفصلة هنا بعد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

نقدم هنا استخدام مجهرية القوة الذرية لأنسجة النبات المسافة البادئة واستعادة خصائصه الميكانيكية. باستخدام اثنين من المجاهر المختلفة في وضع المسافة البادئة، ونحن نعرض كيفية قياس معامل مرنة واستخدامها لتقييم خصائص جدار الخلية الميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا شرح كيفية تقييم ضغط التورغور. المزايا الرئيسية للميكروسكوب القوة الذرية هي أنه غير الغازية، سريع نسبيا (5 ~ 20 دقيقة)، وأنه يمكن تحليل أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية الحية التي هي مسطحة سطحيا دون الحاجة إلى العلاج. القرار يمكن أن تكون جيدة جدا، اعتمادا على حجم طرف وعلى عدد القياسات لكل منطقة وحدة. أحد قيود هذا الأسلوب هو أنه يعطي فقط الوصول المباشر إلى طبقة الخلية السطحية.

ويبين الشكل 1ألف والشكل 1باء لقطة شاشة توضح نتيجة الخطوات 1-3-4 إلى 1-3-6 من البروتوكول، المستخدمة لتحديد موقع منطقة ذات أهمية يمكن فيها الحصول على خريطة QI. ومن الجدير بالذكر أنه قد تم اختيار المنطقة ذات الأهمية لكي لا تكون على سطح مائل (أي مسطح?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

هنا، نقدم مجهرية القوة الذرية (AFM)، تعمل كأداة المسافات البادئة نانو والدقيقة على الخلايا والأنسجة. تسمح الأداة بالحصول في وقت واحد على طوبوغرافيا سطح 3D للعينة وخصائصها الميكانيكية، بما في ذلك معامل جدار الخلية يونغ، فضلا عن ضغط التورغور.

استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

الخصائص الميكانيكية للخلايا النباتية ضرورية يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة في التنمية. يمكن استخدام المجهر القوة الذرية لقياس هذه الخصائص، واتباع الطريقة التي تتغير، بين الأجهزة والأنسجة، وجميع مراحل النمو. المزايا الرئيسية لهذه التقنية، هو أنه لا شيء الغازية، وأنها سريعة نسبيا وأنها لا تتطلب العلاج بحيث يمكن تطبيقها مباشرة على عينات المعيشة.بالنسبة لشخص جديد على هذا الإجراء، قسم رابطة الدول المستقلة من العينة أمر بالغ الأهمية حقا، لذلك تأكد من أن لديك حقا تثبيت الميكانيكية المناسبة للعينة. المرئية مظاهرة من هذا الإجراء، أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل تعقيدات تثبيت العينة، ومراقبة الجودة من يعزز والإعداد القياس. إثبات الإجراء سيكون سيمون بوفيو، مهندس ويوخين لونغ، طبيب آخر في مختبري.للبدء، ضع قطعة من الشريط من جانبين في وسط من خمسة سنتيمترات قطرها بتري طبق. إضافة عينة من genesium التي تم عزلها من برعم زهرة إلى الشريط. أضيفي الماء بسرعة إلى الطبق حتى يتم تغطية العينة بالكامل لتجنب الجفاف.بعد ذلك، ضع العينة على مرحلة AFM وتحريك الرأس بحيث يكون فوق العينة. بعد معايرة cantilever ، في البرنامج ، تأكد من أن النظام في وضع QI ، والاقتراب من العينة مع قوة نقطة محددة من خمسة عشر نانو نيوتن. بعد ذلك ، قم بتعيين طول Z من أربعة ميكرون وتعيين منطقة المسح الضوئي إلى ثمانين ميكرون من قبل مربع مع عدد من بكسل تعيين إلى أربعين من قبل أربعين.ثم انتقل إلى لوحة إعدادات التصوير المتقدمة وقم بتعيين الوضع إلى سرعة ثابتة. بالإضافة إلى ذلك، تعيين تمديد دخول سرعة المسار إلى مائتي ميكرون في الثانية الواحدة، ومعدل العينة إلى 25 كيلو هيرتز. بمجرد تعيين المعلمات، قم بنقل الطرف إلى المنطقة التي تهمك في العينة.تحقق من أن المنطقة المراد مسحها خالية من الحطام، وحدد موقع منطقة مسطحة قدر الإمكان، واشتبك، ثم ابدأ المسح الضوئي واستخدم المسح السريع للقوة المنخفضة للتحقق مما إذا كانت العينة تتحرك. مرة واحدة في منطقة الاهتمام كما تم تحديدها، حدد المنطقة التي هي أربعين من قبل أربعين إلى ستين من قبل 60 ميكرون مربعة، وزيادة عدد بكسل إلى اثنين بكسل لكل ميكرون. المقبل ، وزيادة نقطة مجموعة إلى خمسمائة نانو نيوتن ، للحصول على المسافة البادئة من مائة إلى 200 متر نانو.إنقاص طول Z إلى اثنين من ميكرون، وتمتد دخول سرعة المسالك إلى مائة ميكرون في الثانية الواحدة، ثم زيادة معدل العينة إلى 50 كيلوهيرتز، والبدء في مسح العينة. عند الانتهاء، احفظ الإخراج كصورة وملف بيانات. افتح برنامج معالجة البيانات وحمّل ملف البيانات.انقر على استخدام هذه الخريطة لدفعة معالجة زر من أجل استخدام نفس المعلمات على جميع منحنيات من الخريطة، ثم انتقل إلى تحميل عملية محددة مسبقا وحدد هرتز تناسب. بعد ذلك، انتقل إلى عملية خط أساسي قابل للتبديل، وتعيين طرح لإزاحة زائد إمالة، وX دقيقة بين الأربعين وستين بالمائة. في علامة التبويب موضع التلميح العمودي، حدد على وضع ضيق، إذا كنت تفضل العمل على البيانات الأولية.لتحديد طراز الملائمة المناسبة، انتقل إلى علامة التبويب ملائمة المرونة، وحدد أحد الخيارات استنادًا إلى قوة التصاق المتوقعة. إذا كان هناك أي التصاق ضعيف أو موجودة، ثم استخدام منحنى النهج ويفضل استخدام نموذج isnader هرتز. في حالة التصاق أقوى، استخدم نموذج ديرغن ميليا دورتوبروف أو DMD والعمل على منحنى متخلف.الآن تعيين المعلمات الطرف هندسية على أساس شكل تلميح الاسمية. الطرف المستخدم في هذه التجربة هو طرف كروي، مع نصف قطره 400 متر نانو. بعد ذلك، قم بتعيين نسبة Poisson إلى 0.5، وحدد منحنيات النوبات.إضافة روتين تناسب مرونة ثانية، من خلال النقر على أيقونة من النافذة الرئيسية، وتكرار إعدادات المعلمة نفسها. وأخيراً، حدد المسافة البادئة المطلوبة في x دقيقة ثم الاحتفاظ بها وتطبيقها على الجميع تكرار الخطوات السابقة على جميع منحنيات الخريطة. حفظ النتائج للحصول على صورة في ملف tsv نقطة.لقياس مع التغيرات حل سريع، جبل عينة في طبق بتري، عقد قطعة صغيرة من المصطك اللاصق. بسرعة سد الفجوة بين قاعدة العينة والمصطكي مع الغراء compatible. انتظر الغراء لترسيخ ثم غمر العينة في سائل قمة ثقافة المتوسطة، التي تحتوي على 0.1 في المئة مزيج الحفاظ على النبات.بعد معايرة النظام، افتح برنامج الاستحواذ واذهب أولاً إلى نافذة معلمة الاختيار. هناك تعيين ثابت الربيع إلى ثابت الربيع المصنعة كانتيليفر أو ثابت الربيع المحدد. بعد ذلك ، تعيين نصف قطرها تلميح إلى أربعمائة متر نانو ، ونسبة poisson عينة إلى 0.5 ، وخط العينة إلى مائة وثمانية وعشرين لضمان الحصول السريع ، ومعدل المسح الضوئي إلى 0.2 هيرتز وحجم المسح الضوئي إلى ميكرون واحد.ثم انتقل إلى نافذة المنحدر وتعيين حجم المنحدر إلى خمسة ميكرون، عتبة المثلثات إلى الحد الأقصى، وعدد العينات إلى أربعة آلاف ستمائة وثمانية. مع كل من مجموعة المعلمات ، بعناية نهج العينة يدويا. عندما يكون المسبار قريبًا نسبيًا من سطح العينة ، انقر على النهج.عند الاتصال، قم بزيادة حجم المسح الضوئي تدريجياً وتعديل معدل المسح الضوئي، حتى يتم الوصول إلى التوازن المطلوب دون الإضرار بالعينة أو الطرف. نقل المسح إذا منطقة القياس غير مرغوب فيه. عندما راض، انقر فوق الزر، نقطة واطلاق النار، لبدء نقطة ونافذة تبادل لاطلاق النار.تحديد دليل حفظ واسم ملف. ثم انقر على منحدر على الفحص التالي لبدء التسجيل. عند اكتمال الفحص، سيتم إعادة توجيه واجهة البرنامج إلى نافذة المنحدر.انقر على الصورة الممسوحة ضوئيًا لتحديد المواضع المراد وضعها. اختيار ما لا يقل عن ثلاثة مشاهد المسافة البادئة لكل خلية بالقرب من مركز التوت انها، تعيينها لتكرار المسافة البادئة ثلاث مرات لكل جانب، ثم انقر فوق منحدر والتقاط. في برنامج التحليل، افتح ملف DOT MCA، وهذا يظهر موضع كل منحنى قوة على الصورة الممسوحة ضوئيًا.ثم فتح منحنى قوة واحدة لتحليلها. انقر فوق زر تصحيح الخط الأساسي واسحب خطوط الشرطة الزرقاء على منحنى القوة، حتى يتم تمديد خط الأساس المصدر بدءًا وتمديد خط الأساس المصدر، أو عند 0 بالمائة و80 بالمائة على التوالي. ثم انقر على تنفيذ.بعد ذلك انقر فوق زر تصفية السيارة مربع، وانقر فوق تنفيذ لتنعيم منحنى القوة. ثم انقر فوق زر المسافة البادئة. في إطار الإدخال، قم بتعيين المنحنى النشط إلى توسيع، والأسلوب الخامس إلى النموذج الخطي، والحد الأقصى لاحتواء الحد إلى 99 بالمائة، وقوة الحد الأدنى لـ 75 بالمائة، ونموذج الملاءمة لصلابة.تحليل منحنيات القوة في دفعة. لتنفيذ ذلك، انقر فوق زر محفوظات التشغيل، وحدد دليل التقرير، ثم أضف منحنيات القوة الأخرى التي تتطلب نفس المعاملة. عند الانتهاء، انقر فوق تشغيل.عندما تكون القيمة K هي مجموعة تركيبها، انقر فوق المحفوظات ثم انتقل إلى مسافة بادئة خمسة للعودة إلى إطار المسافة البادئة. مرة واحدة هناك، تغيير الحد الأقصى للقوة تناسب عشرة في المئة و min قوة تناسب الحدود إلى واحد في المئة. ثم تعيين نموذج تناسب إلى Hertzian.بعد ذلك، افتح الملف المناسب لعرض القنوات الممسوحة ضوئيًا المختلفة. في نافذة القناة العالية، انقر على زر القسم. وهذا سيسمح بقياس انحناء سطح العينة المطلوب لخصم ضغط التورغور.ثم ارسم خطاً عبر المحور الطويل لخلية واحدة، حرك حدود خط الشرطة إلى حواف الخلية وسجل قيمة نصف القطر. أخيرا اتبع على طول في بروتوكول النص، لحساب معامل الشباب المتوسط، ثابت الربيع، E، K، وضغط تورغور لكل خلية. الصورة على اليسار هي خريطة معامل الشباب، التي تم الحصول عليها من خلال تحليل المسافة البادئة كله يصل إلى نقطة مجموعة قوة محددة من المستخدم في حين أن الصورة على اليمين، ويبين نتيجة تحليل أول مائة متر نانو المسافة البادئة.هنا، تبدو الخريطتان متشابهتين للغاية، ولكن الاختلاف في عمق المسافة البادئة يمكن أن يؤدي في بعض الحالات إلى تمييز أفضل لـ "التغايرات العينة"، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد الموقع أو لتوفير معلومات حول سلوك الهياكل الداخلية. لكل نقطة على هذه الخرائط، هناك منحنى القوة الكامنة. المنحنى هو مبين هنا، وقد اثنين من الآثار التي تستحق الذكر.أولاً، إذا كان جزء النهج من منحنى القوة ينتهي عند خمسمائة نانو نيوتن. حركة البقشيش الهبوطي تستمر. يعني القوة النهائية المطبقة من قبل طرف أعلى من المتوقع.الشيء الثاني أن يلاحظ، هو موجة في على منحنى تراجع سلط الضوء عليها القطع الناقص. قد يكون هذا التلويح مؤشرا على عينة تتحرك أو تهتز تحت عمل تلميح والتحول إلى طريقة تثبيت مختلفة قد تكون مطلوبة. باستخدام الإجراء الموثق في هذه المقالة، يمكن استرجاع كافة المعلمات الرئيسية لخصم ضغط تورغور باستثناء سماكة جدار الخلية من مسح AFM والمسافات البادئة.يصف منحنى القوة من المسافة البادئة العميقة في موقف الصليب الأحمر معامل جدار الخلية الشابة وصلابة العينة الظاهرة في أنظمة مختلفة من المنحنى. تثبيت العينة أمر بالغ الأهمية. خلال عملية القياس، إيلاء الاهتمام لعلامات عدم الاستقرار العينة.اختر بعناية منطقة ذات سطح مستوٍ لضمان المسافة البادئة العمودية. بعد هذا الإجراء، يمكن للمرء أن يراقب الخواص الميكانيكية مع مرور الوقت وظروف مختلفة. يمكن للمرء أيضا تراكب القياسات الميكانيكية مع الصور confocal لدراسات مترابطة.وتمهد هذه التقنية الطريق لربط الميكانيكا الحيوية مع تطوير علم وظائف الأعضاء والعمليات البيولوجية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

المغناطيسية الأرضية الميدانية (GMF) وتطور النبات: التحقيق في آثار عكسية على GMF<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; التنمية والتعبير الجيني

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

تطوير استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة من قبل الطفرات ميثانسولفونات إيثيل

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...