Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Vi vil gerne takke PLATIM team for deres tekniske support, samt Arezki Boudaoud og medlemmer af biophysic team på RDP Lab for nyttige diskussioner.

1. måling af cellevæg mekaniske egenskaber
Bemærk: Eksempel på udviklingen af gynoecium Arabidopsis er præsenteret.
<ol><li>Forberedelse af de biologiske prøver
	<ol>
<li>Saml en lukket blomst knop på stadie 9 til 10 (ca. 0,5 mm lang) i henhold til offentliggjorte stadier beslutsomhed for Arabidopsis4. Under en binokulær, ved hjælp af fine pincet, skal du forsigtigt åbne opløbet for at kontrollere udviklingsstadiet...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

Fremkomsten af former i planter er primært bestemt af den koordinerede hastighed og retning af vækst i tid og rum. Planteceller er indkapslet i en stiv cellevæg lavet af en polysaccharidic matrix, som lim dem sammen. Som et resultat, celle ekspansion styres af balancen mellem turgor tryk trækker på cellens væg, og stivhed af cellens væg modstå dette pres. For at forstå de mekanismer underliggende udvikling, er det vigtigt at være i stand til at måle både cellevæg mekaniske egenskaber samt turgor tryk i forsk...

Atomkraften mikroskopi (AFM) tilhører scannings sonden mikroskopi (SPM) familie, hvor et tip med en radius af normalt et par nanometer scanner overfladen af en prøve. Påvisning af en overflade opnås ikke ved hjælp af optiske eller elektron baserede metoder, men via interaktions kræfterne mellem spidsen og prøveoverfladen. Således er denne teknik ikke begrænset til topografiske karakterisering af en prøve flade (3D-opløsning, der kan gå ned til et par nanometer), men giver også mulighed for måling af enhver form for interaktion kræfter såsom elektrostatiske, Van der Waals eller kontakt kræfter. Desuden kan spidsen bruges til at anvende kræfter på overfladen af en biologisk prøve og måle den resulterende deformation, den såkaldte "indrykning", for at bestemme dens mekaniske egenskaber (f. eks. Youngs modulus, viskoelastiske egenskaber).
Mekaniske egenskaber af plante cellevægge er afgørende for at blive taget i betragtning, når de forsøger at forstå mekanismer underliggende udviklingsmæssige processer1,2,3. Faktisk, disse egenskaber er stramt kontrolleret under udvikling, især da cellevæg blødgøring er nødvendig for at tillade celler til at vokse. AFM kan bruges til at måle disse egenskaber og studere den måde, de skifter mellem organer, væv eller udviklingsmæssige stadier.
I dette papir beskriver vi, hvordan vi bruger AFM til at måle både cellmur mekaniske egenskaber og turgor tryk. Disse to applikationer er demonstreret på to forskellige AFM mikroskoper og er detaljeret her efter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

Vi præsenterer her brugen af atomkraften mikroskopi til at indrykke plantevæv og genvinde sine mekaniske egenskaber. Ved hjælp af to forskellige mikroskoper i indrykningstilstand viser vi hvordan man måler en elastisk modulus og bruger den til at evaluere cellevæggens mekaniske egenskaber. Derudover forklarer vi også, hvordan man evaluerer turgor-trykket. De vigtigste fordele ved atomkraften mikroskopi er, at det er ikke-invasiv, relativt hurtig (5 ~ 20 min), og at stort set enhver form for levende plante væv, der er overfladisk flad kan analyseres uden behov for behandling. Opløsningen kan være meget god, afhængigt af spids størrelsen og antallet af målinger pr. arealenhed. En begrænsning af denne metode er, at det kun giver direkte adgang til det overfladiske cellelag.

Figur 1a og figur 1b viser et skærmbillede, der illustrerer resultatet af trinene 1.3.4 til 1.3.6 i protokollen, som bruges til at finde en region af interesse, hvor man erhverver Qi-kortet. Det er værd at nævne, at regionen af interesse er blevet valgt for ikke at være på en skrå overflade (dvs., så fladt som muligt). Faktisk, som bemærket af Routier et al.5, hvis indryknings aksen ikke er vinkelr...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Her præsenterer vi atomkraften mikroskopi (AFM), der drives som et nano-og mikro-indryknings værktøj på celler og væv. Instrumentet giver mulighed for samtidig erhvervelse af 3D-overfladetopografi af prøven og dens mekaniske egenskaber, herunder Cell Wall Youngs modulus samt turgor tryk.

Anvendelse af atomkraften mikroskopi til måling af mekaniske egenskaber og turgor tryk af planteceller og plantevæv

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Mekaniske egenskaber af planteceller er afgørende, der skal tages i betragtning, når de forsøger at forstå mekanismer underliggende udvikling. Atomic force mikroskopi kan bruges til at måle disse egenskaber, og følge den måde, de ændrer sig, mellem organer, væv, alle udviklingsstadier. De vigtigste fordele ved denne teknik, er, at det ikke er invasiv, det er relativt hurtigt, og det kræver ikke behandling, så det kan anvendes direkte på levende prøver.For en person, der er nyt for denne procedure, cis del af prøven er virkelig kritisk, så sørg for at du virkelig har ordentlig mekanisk fiksering af prøven. Visuel demonstration af denne procedure, er afgørende for bedre at forstå de snørklede af prøvefiksering, kvalitetskontrol af plejefamilier og måling setup. Demonstration af proceduren vil være Simone Bovio, en ingeniør og Yuchen Long, en post doc i mit laboratorium.Til at begynde, placere et stykke dobbeltsidet tape i midten af fem centimeter diameter petriskål. Tilføj en prøve af genesium, der er blevet isoleret fra en blomsterknop til båndet. Tilsæt hurtigt vand til skålen, indtil prøven er helt dækket for at undgå dehydrering.Dernæst placere prøven på en AFM fase og flytte hovedet, så det er over prøven. Efter at have kalibreret cantilever, i softwaren, sikre, at systemet er i QI-tilstand, og nærmer prøven med et sætpunkt kraft på femten nano newton. Dernæst indstille en Z længde på fire mikron og indstille scanningsområdet til firs med firs mikron kvadreret med antallet af pixels sat til fyrre af fyrre.Gå derefter til panelet med avancerede billedindstillinger, og indstil tilstanden til konstant hastighed. Derudover indstille udvide indtaste spor hastigheder til to hundrede mikron per sekund, og prøven sats til femogtyve kilo hertz. Når parametrene er angivet, skal du flytte spidsen til det område, der er af interesse på prøven.Kontroller, at det område, der skal scannes, er fri for snavs, find et område, der er så fladt som muligt, og gå i indgreb, og start derefter scanningen, og brug den hurtige scanning med lav kraft til at kontrollere, om prøven bevæger sig. Når et område af interesse som er placeret, skal du vælge en region, der er fyrre af fyrre til tres af tres Micron kvadreret, og øge pixel nummer til to pixels per micron. Dernæst øge sætpunktet til fem hundrede nano newton, for at opnå en indrykning af hundrede til to hundrede nano meter.Sæn din længde til to mikron, og udvid ind i kanalhastigheder til hundrede mikron pr. sekund, forøg derefter prøvehastigheden til halvtreds kilohertz, og begynd at scanne prøven. Når du er færdig, skal du gemme outputtet som både et billede og en datafil. Åbn databehandlingssoftwaren, og indlæs datafilen.Klik på brug dette kort for batchbehandling knappen for at bruge de samme parametre på alle kurver af kortet, derefter gå til at indlæse foruddefinerede proces og vælg hertz fit. Dernæst skal du gå til omskiftelig baselinje operation, og sæt trække til offset plus tilt, og X min mellem fyrre og tres procent. Vælg på en jævn stram position under fanen lodret spids, hvis du foretrækker at arbejde på rådata.Hvis du vil vælge den relevante tilpasningsmodel, skal du gå til fanen elasticitetspasning og vælge en af indstillingerne baseret på den forventede vedhæftningsstyrke. Hvis der ikke er nogen eller svag vedhæftning, skal du bruge indflyvningskurven og foretrækker at bruge hertz isnader-modellen. I tilfælde af stærkere vedhæftning, bruge modellen af Dergen Milia Dortoprov eller DMD og arbejde på en retard kurve.Sæt nu spidsgeomiske parametre baseret på nominel spidsform. Spidsen anvendes i dette eksperiment er en sfærisk spids, med en radius af fire hundrede nano meter. Derefter skal du indstille Poisson-forholdet til 0,5 og vælge skiftkurver.Tilføj en anden elasticitetspasningsrutine ved at klikke på ikonet ved hovedvinduet, og gentag de samme parameterindstillinger. Endelig skal du angive den ønskede indrykning i X min derefter holde og gælder for alle til at gentage de foregående trin på alle kurver af kortet. Gem resultaterne for at hente et billede i en tsv-fil.For at måle med hurtige opløsningsændringer monteres en prøve i en petriskål med et lille stykke klæbende mastiks. Hurtigt forsegle kløften mellem mastiks og prøven base med biokompiselig lim. Vent på limen til at størkne og derefter nedsænke prøven i flydende apex kultur medium, der indeholder 0,1 procent plante konservering blanding.Når du har kalibreret systemet, skal du åbne anskaffelsessoftwaren og først gå til checkparametervinduet. Der indstilles fjederkonstant til cantilevers fremstillede fjederkonstant eller den bestemte fjederkonstant. Dernæst indstille spidsen radius til fire hundrede nano meter, prøven poisson forholdet til 0,5, prøven linje til et hundrede og tyve otte for at sikre hurtig erhvervelse, scanningen sats til 0,2 hertz og scanningen størrelse til en mikron.Så gå til rampe vinduet og sæt rampe størrelse til fem mikron, trig tærskel til maksimum, og antallet af prøver til fire tusinde seks hundrede og otte. Med alle de indstillede parametre skal du forsigtigt nærme prøven manuelt. Når sonden er relativt tæt på prøveoverfladen, skal du klikke på indflyvning.Ved kontakt skal scanningsstørrelsen øges gradvist, og scanningshastigheden ændres, indtil den ønskede balance er nået uden at beskadige prøven eller spidsen. Flyt scanningen, hvis måleområdet ikke er som ønsket. Når tilfreds, skal du klikke på knappen, peg og skyd, for at starte peg og skyd vinduet.Angiv en gem mappe og et filnavn. Klik derefter rampe på næste scanning for at indlede optagelsen. Når scanningen er færdig, omdirigerer softwaregrænsefladen til rampevinduet.Klik på det scannede billede for at angive de positioner, der skal indrykkes. Vælg mindst tre indrykningssemer pr. celle i nærheden af det bærcenter, indstil den til at gentage indrykningen tre gange på hver side, og klik derefter på rampe og indfang. I analysesoftwaren skal du åbne dot MCA-filen, dette viser placeringen af hver kraftkurve på det scannede billede.Åbn derefter en kraftkurve, der skal analyseres. Klik på knappen Korrektion af basislinjer, og træk de blå streglinjer på kraftkurven, indtil du udvider kildebasislinjens start og udvider kildebaselinjestoppet eller ved henholdsvis 0 og 80 procent. Klik derefter på udfør.Klik derefter på knappen bilfilter i boksen, og klik på udfør for at udjævne kraftkurven. Klik derefter på indrykningsknappen. I inputvinduet skal du indstille den aktive kurve til at udvide, den femte metode til lineariseret model, max force fit grænsen til 99 procent, min force fit grænse til 75 procent, og fit model til stivhed.Analysér kraftkurverne i en batch. For at opnå dette skal du klikke på knappen Kør oversigt, angive rapportmappe og tilføje andre kraftkurver, der kræver den samme behandling. Klik på Kør, når du er færdig.Når værdien for K er batchmonteret, skal du klikke på oversigten og gå til fem indrykninger for at vende tilbage til indrykningsvinduet. Når der, ændre max kraft passer grænse til ti procent og min kraft passer grænse til en procent. Derefter indstille fit model til Hertzian.Åbn derefter den relevante fil for at få vist de forskellige scannede kanaler. Klik på sektionsknappen i vinduet med den høje kanal. Dette vil gøre det muligt at måle prøveoverfladekrumning, der er nødvendig for turgortrykfradrag.Tegn derefter en streg hen over en celles lange akse, flyt streglinjegrænserne til cellekanterne, og optag radiusværdien. Endelig følge med i tekstprotokollen, at beregne den gennemsnitlige unges modulus, foråret konstant, E, K, og turgor tryk for hver celle. Billedet til venstre er et kort over den unges modulus, opnået ved at analysere hele indrykning op til den brugerdefinerede kraft sætpunkt, mens billedet til højre, viser resultatet af analysen af de første hundrede nano meter for indrykning.Her ser de to kort dog meget ens ud, kan variationen af indrykningsdybden i nogle tilfælde føre til bedre at fremhæve prøve heterogeneties, hvilket kan være nyttigt til at identificere placeringen eller for at give oplysninger om adfærd interne strukturer. For hvert punkt på disse kort er der en underliggende kraftkurve. Kurven vist her, har to effekter, der er værd at nævne.Først og fremmest, hvis tilgangen del af kraftkurven ender på fem hundrede nano newton. Den nedadgående spids bevægelse fortsætter. Det betyder, at den endelige kraft, der anvendes af spidsen, er højere end forventet.Den anden ting at lægge mærke til, er den bølge i på tilbagetrækning kurven fremhævet af ellipse. En sådan vinke kan være en indikator for prøve, der bevæger sig eller vibrerer under spidsens virkning, og det kan være nødvendigt at skifte til en anden fikseringsmetode. Ved hjælp af den procedure, der er dokumenteret i denne artikel, kan alle de vigtigste parametre for et turgortrykfradrag med undtagelse af cellevægtykkelse hentes fra AFM-scanninger og fordybninger.Kraftkurven af dyb indrykning ved røde korspositionen beskriver cellevæggens unges modulus og prøvens tilsyneladende stivhed ved forskellige styre af kurven. Prøvefiksering er afgørende. Under måleprocessen skal du være opmærksom på tegn på ustabilitet i prøverne.Vælg forsigtigt et område med flad overflade for at sikre vinkelrette indrykning. Efter denne procedure kan man overvåge mekaniske egenskaber over tid og forskellige forhold. Man kan også overlejre mekaniske målinger med konfokale billeder til korrelative undersøgelser.Denne teknik baner vejen for at forbinde biomekanik med fysiologiudvikling og andre biologiske processer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetiske felt (Gmf) og Plant Evolution: undersøgelse af virkningerne af Gmf Tilbageførsel på<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Udvikling og Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En simpel afdeling til langvarig konfokal billeddannelse af rod- og hypokotyludvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Konfokal Live Imaging af skyde apikale ildens fra forskellige plantearter

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Udvikling af målretning mod inducerede lokale læsioner i genomer (TILLING) i små kornafgrøder ved Ethylmethanesulfonat-Mutagenicose

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Oversættelse ribosom affinitet Rensning (TRAP) til at undersøge Arabidopsis thaliana Root Development på en celletype-specifik skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging af Microtubule Cytoskeleton og mikromekanisk manipulation af Arabidopsis Skyd Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...