Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

We willen het PLATIM team bedanken voor hun technische ondersteuning, evenals Arezki Boudaoud en leden van het Biophysic team in het RDP Lab voor nuttige discussies.

1. meting van de mechanische eigenschappen van de celwand
Opmerking: Voorbeeld van de ontwikkeling van het tweezijdig van Arabidopsis wordt gepresenteerd.
<ol><li>Bereiding van de biologische monsters
	<ol>
<li>Verzamel een gesloten bloem knop in fase 9 tot 10 (ongeveer 0,5 mm lang) volgens gepubliceerde stadia bepaling voor Arabidopsis4. Onder een verrekijker, met behulp van fijne pincet, open voorzichtig de knop om het stad...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

De opkomst van vormen in planten wordt voornamelijk bepaald door de gecoördineerde snelheid en richting van de groei tijdens tijd en ruimte. Plantencellen zijn omhuld in een rigide celwand gemaakt van een polysaccharidische matrix, die ze samen lijmen. Als gevolg hiervan wordt de celexpansie bestuurd door het evenwicht tussen turgor-druk trekken op de celwand en de stijfheid van de celwand die weerstand bieden aan deze druk. Om de mechanismen van de onderliggende ontwikkeling te begrijpen, is het belangrijk om zowel de ...

Atomaire kracht microscopie (AFM) behoort tot de Scanning probe microscopie (SPM) familie, waarbij een tip met een straal van meestal een paar nanometers het oppervlak van een monster scant. De detectie van een oppervlak wordt niet bereikt via optische of elektron-gebaseerde methoden, maar via de interactie krachten tussen de punt en het monster oppervlak. Deze techniek is dus niet beperkt tot topografische karakterisering van een monster oppervlak (3D-resolutie die naar een paar nanometers kan gaan), maar maakt het ook mogelijk om elk type interactie krachten zoals elektrostatische, van der Waals of contactkrachten te meten. Bovendien kan de tip worden gebruikt om krachten aan het oppervlak van een biologisch monster toe te passen en de resulterende vervorming, de zogenaamde "Inkeping", te meten om de mechanische eigenschappen ervan te bepalen (bv., jonge modulus, visco-elastische eigenschappen).
Mechanische eigenschappen van planten celwanden zijn essentieel om in aanmerking te worden genomen bij het proberen te begrijpen van mechanismen die onderliggende ontwikkelingsprocessen1,2,3. Inderdaad, deze eigenschappen worden strak gecontroleerd tijdens de ontwikkeling, in het bijzonder omdat de celwand verzachting nodig is om cellen te laten groeien. De AFM kan worden gebruikt om deze eigenschappen te meten en de manier te bestuderen waarop ze veranderen tussen organen, weefsels of ontwikkelingsstadia.
In dit artikel beschrijven we hoe we de AFM gebruiken om zowel de mechanische eigenschappen van de celwand als de turgor-druk te meten. Deze twee toepassingen worden gedemonstreerd op twee verschillende AFM microscopen en zijn hier gedetailleerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

We presenteren hier het gebruik van atoom kracht microscopie om plantenweefsels te laten inspringen en de mechanische eigenschappen ervan te herstellen. Met behulp van twee verschillende microscopen in de indentatie modus laten we zien hoe u een elastische modulus meet en gebruikt om de mechanische eigenschappen van de celwand te evalueren. Daarnaast leggen we ook uit hoe turgor druk moet worden geëvalueerd. De belangrijkste voordelen van atoom kracht microscopie zijn dat het niet-invasieve, relatief snelle (5 ~ 20 min), en dat vrijwel elk type levend plantenweefsel dat oppervlakkig plat is kan worden geanalyseerd zonder de noodzaak voor behandeling. De resolutie kan zeer goed zijn, afhankelijk van de tip grootte en het aantal metingen per eenheid gebied. Een beperking van deze methode is dat het alleen directe toegang tot de oppervlakkige cellaag geeft.

Figuur 1a en Figuur 1b tonen een screenshot ter illustratie van het resultaat van de stappen 1.3.4 tot 1.3.6 van het Protocol, gebruikt om een regio van belang te lokaliseren waar de Qi-kaart moet worden verworven. Het is vermeldenswaard dat de regio van belang is gekozen om niet te worden op een gekanteld oppervlak (dat wil zeggen, zo plat mogelijk). In feite kan, zoals opgemerkt door Routier et al.5, als...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Hier presenteren we atomaire kracht microscopie (AFM), die wordt gebruikt als een nano-en micro-indentatie tool op cellen en weefsels. Het instrument maakt gelijktijdige verwerving van 3D-oppervlaktetopografie van het monster en de mechanische eigenschappen mogelijk, met inbegrip van de modulus van de celwand Young en de turgor-druk.

Gebruik van atoom kracht microscopie om mechanische eigenschappen en turgor druk van plantencellen en Plantenweefsels te meten

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Mechanische eigenschappen van plantencellen zijn essentieel om rekening mee te houden bij het begrijpen van mechanismen die aan de ontwikkeling ten grondslag liggen. Atoomkracht microscopie kan worden gebruikt om deze eigenschappen te meten, en volg de manier waarop ze veranderen, tussen organen, weefsels, alle ontwikkelingsstadia. De belangrijkste voordelen van deze techniek, is dat het geen invasieve, het is relatief snel en het vereist geen behandeling, zodat het direct kan worden toegepast op levende monsters.Voor iemand die nieuw is voor deze procedure, cis sectie van het monster is echt kritisch, dus zorg ervoor dat je echt de juiste mechanische fixatie van het monster. Visuele demonstratie van deze procedure, is van cruciaal belang om beter te begrijpen van de fijne kneepjes van monster fixatie, kwaliteitscontrole van de bevordert en meting setup. Het aantonen van de procedure zal Simone Bovio, een ingenieur en Yuchen Long, een post doc in mijn laboratorium.Om te beginnen, plaats een stuk van dubbelzijdige tape in het midden van vijf centimeter diameter petrischaal. Voeg een monster van genesium dat is geïsoleerd van een bloemknop aan de tape. Voeg snel water toe aan de schotel totdat het monster volledig bedekt is om uitdroging te voorkomen.Plaats het monster vervolgens op een AFM-fase en beweeg het hoofd zodat het over het monster gaat. Na het kalibreren van de cantilever, in de software, ervoor te zorgen dat het systeem in QI-modus, en de aanpak van het monster met een set point force van vijftien nano newtons. Stel vervolgens een Z-lengte van vier micron in en stel het scangebied in op tachtig bij tachtig micron in het kwadraat met het aantal pixels ingesteld op veertig bij veertig.Ga vervolgens naar het paneel geavanceerde beeldvormingsinstellingen en stel de modus in op constante snelheid. Bovendien, stel uit te breiden enter track snelheden tot tweehonderd micron per seconde, en de steekproefsnelheid tot vijfentwintig kilo hertz. Zodra de parameters zijn ingesteld, verplaatst u de tip naar het gebied van belang op het voorbeeld.Controleer of het te scannen gebied vrij is van vuil, zoek een zo vlak mogelijk gebied en schakel in, begin vervolgens met de scan en gebruik de snelle scan met lage kracht om te controleren of het monster zich verplaatst. Zodra een gebied van belang als gelegen, selecteert u een regio die veertig bij veertig tot zestig door zestig Micron kwadraat, en verhoging van het pixelnummer tot twee pixels per micron. Verhoog vervolgens het ingestelde punt tot vijfhonderd nano newton, om een inkeping van honderd tot tweehonderd nanometer te verkrijgen.Verlaag de Z-lengte tot twee micron en de voerkanaalsnelheden tot honderd micron per seconde, verhoog vervolgens de monstersnelheid tot vijftig kilohertz en begin met het scannen van het monster. Sla de uitvoer op als een afbeelding en een gegevensbestand als u klaar bent. Open de software voor gegevensverwerking en laad het gegevensbestand.Klik op de knop Deze kaart gebruiken voor batchverwerking om dezelfde parameters op alle curven van de kaart te gebruiken, ga vervolgens naar vooraf gedefinieerd proces laden en selecteer hertz-pasvorm. Ga vervolgens naar schakelbare basislijnbewerking en stel aftrekken op offset plus tilt en X min tussen de veertig en zestig procent. Selecteer op het tabblad verticale tippositie op gladde strak, als u liever aan ruwe gegevens werkt.Als u het juiste pasvormmodel wilt selecteren, gaat u naar het tabblad elasticiteitspasta en selecteert u een van de opties op basis van de verwachte hechtingssterkte. Als er geen of zwakke hechting aanwezig is, gebruikt u de benaderingscurve en gebruikt u liever het hertz-isnadermodel. In geval van sterkere hechting, gebruik maken van het model van Dergen Milia Dortoprov of DMD en werken op een retard curve.Stel nu de tip geometrische parameters op basis van nominale tip vorm. De tip die in dit experiment wordt gebruikt is een bolvormige punt, met een straal van vierhonderd nanometer. Stel vervolgens de Poisson-verhouding in op 0,5 en selecteer shiftcurven.Voeg een tweede elasticiteitspasroutine toe door op het pictogram bij het hoofdvenster te klikken en herhaal dezelfde parameterinstellingen. Geef ten slotte de gewenste inkeping in X min op en houd deze op alle opties op alle curven van de kaart. Sla de resultaten op om een afbeelding in een dot tsv-bestand te verkrijgen.Om te meten met snelle oplossingsveranderingen, monteer een monster in een petrischaaltje, met een klein stukje lijm mastiek. Verzegel snel de kloof tussen de mastiek en de monsterbasis met biocompatibele lijm. Wacht tot de lijm te stollen en vervolgens onderdompelen het monster in vloeibare apex cultuur medium, met 0,1 procent plantenconservering mengsel.Nadat u het systeem hebt gekalibreerd, opent u de acquisitiesoftware en gaat u eerst naar het venster controleparameter. Daar zet de veerconstante aan de vervaardigde veerconstante van cantilever of de bepaalde de lenteconstante. Stel vervolgens de tipradius in op vierhonderd nanometer, de verhouding monsterpoisson op 0,5, de monsterlijn op honderdentwintig om een snelle aanschaf te garanderen, de scansnelheid op 0,2 hertz en de scangrootte op één micron.Ga dan naar het opritvenster en stel de hellingsgrootte in op vijf micron, de trigdrempel tot maximaal, en het aantal monsters op vierduizend zeshonderd acht. Met alle parameters ingesteld, zorgvuldig aanpak van het monster handmatig. Wanneer de sonde relatief dicht bij het monsteroppervlak ligt, klikt u op nadering.Verhoog bij contact geleidelijk de scangrootte en wijzig de scansnelheid, totdat een gewenst saldo is bereikt zonder het monster of de tip te beschadigen. Verplaats de scan als het meetgebied niet naar wens is. Wanneer u tevreden bent, klikt u op de knop, wijs en schiet, om het punt te starten en venster te schieten.Geef een opslagmap en een bestandsnaam op. Klik vervolgens op de helling op de volgende scan om de opname te starten. Wanneer de scan is voltooid, wordt de software-interface omgeleid naar het opritvenster.Klik op de gescande afbeelding om de posities op te geven die u moet inspringen. Kies ten minste drie inkepings bezienswaardigheden per cel in de buurt van het bessencentrum, stel deze in om de inkeping drie keer per kant te herhalen en klik vervolgens op helling en opname. In de analysesoftware opent u het dot MCA-bestand, dit toont de positie van elke krachtcurve op de gescande afbeelding.Open vervolgens een krachtcurve om te analyseren. Klik op de knop basislijncorrectie en sleep de blauwe streepjeslijnen op de krachtcurve, totdat de bronbasislijn begint en de bronbasislijnstop wordt verlengd, of op respectievelijk 0 procent en 80 procent. Klik dan op uitvoeren.Klik vervolgens op de knop autofilter en klik op uitvoeren om de krachtcurve glad te strijken. Klik vervolgens op de inspringingsknop. Stel in het invoervenster de actieve curve in om uit te breiden, de vijfde methode naar het lineaire model, de maximale krachtpastlaag op 99 procent, de minkrachtpastgrens op 75 procent en het pasvormmodel op stijfheid.Analyseer de krachtcurven in een batch. Klik hiervoor op de knop Run History, geef de rapportmap op en voeg andere krachtcurven toe waarvoor dezelfde behandeling vereist is. Klik als u klaar bent met uitvoeren.Wanneer de waarde voor K is gemonteerd op de batch, klikt u op de geschiedenis en gaat u naar vijf inspringing om terug te keren naar het inspringingsvenster. Eenmaal daar, verander max force fit grens tot tien procent en min kracht fit grens tot een procent. Stel vervolgens het geschikte model in op Hertzian.Open vervolgens het juiste bestand om de verschillende gescande kanalen weer te geven. Klik in het venster met hoog kanalen op de sectieknop. Dit zal het mogelijk maken de meting van monster oppervlak kromming die nodig is voor turgor drukaftrek.Teken vervolgens een lijn over de lange as van één cel, verplaats de streepjeslijngrenzen naar de celranden en noteert de straalwaarde. Ten slotte volgen in het tekstprotocol, om de gemiddelde jonge modulus, lenteconstante, E, K, en de turgor druk voor elke cel te berekenen. De afbeelding aan de linkerkant is een kaart van de jonge modulus, verkregen door het analyseren van de hele inkeping tot aan de gebruiker gedefinieerde kracht set point, terwijl de afbeelding aan de rechterkant, toont het resultaat van de analyse van de eerste honderd nano meter van de inkeping.Hier, de twee kaarten zien er zeer vergelijkbaar echter, de variatie van de inkeping diepte kan leiden in sommige gevallen beter markeren monster heterogeneties, die nuttig kunnen zijn voor het identificeren van de locatie of voor het verstrekken van informatie over het gedrag van interne structuren. Voor elk punt op deze kaarten is er een onderliggende krachtcurve. De curve hier weergegeven, heeft twee effecten die het vermelden waard zijn.Ten eerste, als het naderingsgedeelte van de krachtcurve eindigt op vijfhonderd nano newton. De neerwaartse tipbeweging blijft doorgaan. Dit betekent dat de uiteindelijke kracht die door de tip wordt uitgeoefend hoger is dan verwacht.Het tweede ding om op te merken, is de golf in op de intrekcurve gemarkeerd door de ellips. Een dergelijk zwaaien kan een indicator zijn van het bewegen of trillen van monsters onder de werking van de tip en overschakelen naar een andere fixatiemethode kan nodig zijn. Met behulp van de procedure gedocumenteerd in dit artikel, alle van de belangrijkste parameters voor een turgor drukaftrek, behalve voor de dikte van de celwand kan worden opgehaald van AFM scans en inkepingen.De krachtcurve van diepe inkeping op de rode kruispositie beschrijft de modulus van de celwand en de schijnbare stijfheid van het monster bij verschillende regimes van de curve. Monsterfixatie is cruciaal. Let tijdens het meetproces op tekenen van instabiliteit van monsters.Kies zorgvuldig een gebied met vlak oppervlak om loodrechte inkeping te garanderen. Na deze procedure kan men mechanische eigenschappen in de loop van de tijd en verschillende omstandigheden controleren. Men kan ook mechanische metingen met confocale beelden voor correlative studies bedekken.Deze techniek maakt de weg vrij voor het koppelen van biomechanica aan fysiologieontwikkeling en andere biologische processen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Aardmagneetveld (Gmf) en Plant Evolutie: Onderzoek naar de effecten van Gmf Reversal op<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ontwikkeling en Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Ontwikkeling van gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populaties in kleine graangewassen door mutageen

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...