Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
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Wir danken dem PLATIM-Team für die technische Unterstützung sowie Arezki Boudaoud und Mitgliedern des Biophysic-Teams im RDP-Labor für hilfreiche Diskussionen.

1.Messung der mechanischen Eigenschaften der Zellenwand
HINWEIS: Beispiel für das sich entwickelnde Gynoezium von Arabidopsis wird vorgestellt.
<ol><li>Vorbereitung der biologischen Proben
	<ol>
<li>Sammeln Sie eine geschlossene Blütenknospe in Stufe 9 bis 10 (ca. 0,5 mm lang) nach veröffentlichten Stufen Bestimmung für Arabidopsis4. Unter einem Fernglas, mit feiner Pinzette, vorsichtig öffnen Sie die Knospe, um den Entw...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

Die Entstehung von Formen in Pflanzen wird hauptsächlich durch die koordinierte Geschwindigkeit und Wachstumsrichtung in Zeit und Raum bestimmt. Pflanzenzellen sind in einer starren Zellwand aus einer polysaccharidischen Matrix eingeschlossen, die sie zusammenklebt. Dadurch wird die Zellausdehnung durch das Gleichgewicht zwischen dem Turgordruck, der an der Zellwand zieht, und der Steifigkeit der Zellwand gesteuert, die diesem Druck standhält. Um die Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, ist es...

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) gehört zur Scan-Sondenmikroskopie-Familie (SPM), bei der eine Spitze mit einem Radius von in der Regel wenigen Nanometern die Oberfläche einer Probe scannt. Die Detektion einer Oberfläche erfolgt nicht über optische oder elektronenbasierte Methoden, sondern über die Wechselwirkungskräfte zwischen der Spitze und der Probenoberfläche. Somit beschränkt sich diese Technik nicht auf die topographische Charakterisierung einer Probenoberfläche (3D-Auflösung, die auf wenige Nanometer sinken kann), sondern ermöglicht auch die Messung jeder Art von Wechselwirkungskräften wie Elektrostatik, Van der Waals oder Kontaktkräften. Darüber hinaus kann die Spitze verwendet werden, um Kräfte an der Oberfläche einer biologischen Probe anzuwenden und die resultierende Verformung, die sogenannte "Einrückung", zu messen, um ihre mechanischen Eigenschaften (z.B. Young-Modul, viskoelastische Eigenschaften) zu bestimmen.
Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellwänden sind wichtig, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die Entwicklungsprozessen zugrunde liegen,1,2,3zu berücksichtigen. Tatsächlich werden diese Eigenschaften während der Entwicklung streng kontrolliert, insbesondere da eine Zellwandenthärtung erforderlich ist, damit Zellen wachsen können. AFM kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und zu untersuchen, wie sie zwischen Organen, Geweben oder Entwicklungsstadien wechseln.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir AFM verwenden, um sowohl die mechanischen Eigenschaften der Zellwand als auch den Turgordruck zu messen. Diese beiden Anwendungen werden auf zwei verschiedenen AFM-Mikroskopen demonstriert und werden hier danach detailliert beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

Wir stellen hier den Einsatz der Atomkraftmikroskopie vor, um Pflanzengewebe einzurücken und seine mechanischen Eigenschaften wiederzuerlangen. Anhand von zwei verschiedenen Mikroskopen im Einzugsmodus zeigen wir, wie man einen elastischen Modul misst und damit mechanische Eigenschaften der Zellwand bewertet. Darüber hinaus erklären wir auch, wie der Turgordruck bewertet wird. Die Hauptvorteile der Atomkraftmikroskopie sind, dass sie nicht-invasiv, relativ schnell (5 bis 20 min) ist und dass praktisch jede Art von lebendem Pflanzengewebe, das oberflächlich flach ist, ohne Behandlungsbedarf analysiert werden kann. Die Auflösung kann sehr gut sein, abhängig von der Spitzengröße und der Anzahl der Messungen pro Flächeneinheit. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nur direkten Zugriff auf die oberflächliche Zellschicht gewährt.

Abbildung 1A und Abbildung 1B zeigen einen Screenshot, der das Ergebnis der Schritte 1.3.4 bis 1.3.6 des Protokolls veranschaulicht, der verwendet wird, um eine Interessenregion zu finden, in der die QI-Karte erworben werden soll. Es ist erwähnenswert, dass die Region von Interesse gewählt wurde, um nicht auf einer geneigten Oberfläche (d.h. so flach wie möglich) zu sein. Tatsächlich, wie routier et al.5</s...

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Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.

Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellen sind unerlässlich, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, berücksichtigt zu werden. Die Atomkraftmikroskopie kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und der Art und Weise zu folgen, wie sie sich zwischen Organen, Geweben, allen Entwicklungsstadien verändern. Die Hauptvorteile dieser Technik, ist, dass es keine invasive, ist es relativ schnell und es erfordert keine Behandlung, so dass es direkt auf lebende Proben angewendet werden kann.Für jemanden, der neu in diesem Verfahren ist, ist cis Abschnitt der Probe wirklich kritisch, so stellen Sie sicher, dass Sie wirklich die richtige mechanische Fixierung der Probe haben. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, um die Feinheiten der Probenfixierung, Qualitätskontrolle der Pflegeeinrichtungen und der Messung besser zu verstehen. Demonstriert wird das Verfahren von Simone Bovio, einer Ingenieurin, und Yuchen Long, einem Postdoc in meinem Labor.Um zu beginnen, legen Sie ein Stück doppelseitiges Band in die Mitte von fünf Zentimeter Durchmesser Petrischale. Fügen Sie dem Band eine Probe von Genesium hinzu, die von einer Blütenknospe isoliert wurde. Fügen Sie der Schale schnell Wasser hinzu, bis die Probe vollständig abgedeckt ist, um Eine Austrocknung zu vermeiden.Legen Sie das Sample anschließend auf eine AFM-Stufe und bewegen Sie den Kopf so, dass er sich über der Probe befindet. Nachdem Sie den Ausleger in der Software kalibriert haben, stellen Sie sicher, dass sich das System im QI-Modus befindet, und nähern Sie sich der Probe mit einer Sollwertkraft von fünfzehn Nanonewtons. Als nächstes legen Sie eine Z-Länge von vier Mikrometern fest und legen Sie den Scanbereich auf achtzig mal achtzig Quadrate fest, wobei die Anzahl der Pixel auf vierzig bis vierzig festgelegt ist.Gehen Sie dann zum erweiterten Imaging-Einstellungsfenster und stellen Sie den Modus auf konstante Geschwindigkeit ein. Darüber hinaus können Sie die Geschwindigkeiten der Spur auf zweihundert Mikrometer pro Sekunde und die Abtastrate auf 25 Kilo Hertz erweitern. Nachdem die Parameter festgelegt wurden, verschieben Sie die Spitze in den Bereich, der für die Stichprobe von Interesse ist.Stellen Sie sicher, dass der zu scannende Bereich frei von Schmutz ist, suchen Sie einen bereich, der so flach wie möglich ist, und greifen Sie ein, beginnen Sie dann den Scan, und verwenden Sie den schnellen Scan mit niedriger Kraft, um zu überprüfen, ob sich die Probe bewegt. Sobald ein Bereich von Interesse gefunden wurde, wählen Sie eine Region, die vierzig von vierzig bis sechzig von sechzig Micron quadratisch ist, und erhöhen Sie die Pixelzahl auf zwei Pixel pro Mikron. Als nächstes erhöhen Sie den Sollwert auf fünfhundert Nano-Newton, um eine Einbuchtung von hundert bis zweihundert Nanometern zu erhalten.Verringern Sie die Z-Länge auf zwei Mikrometer, und die Geschwindigkeiten des Ausdehnungstraktes werden auf hundert Mikrometer pro Sekunde erhöht, dann die Abtastrate auf fünfzig Kilohertz erhöht und mit dem Scannen der Probe begonnen. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Ausgabe sowohl als Bild als auch als Datendatei. Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware, und laden Sie die Datendatei.Klicken Sie auf die Schaltfläche "Diese Karte verwenden für die Stapelverarbeitung", um die gleichen Parameter für alle Kurven der Karte zu verwenden, und fahren Sie dann zum Laden eines vordefinierten Prozesses und wählen Sie Hertz fit aus. Gehen Sie als Nächstes zum schaltbaren Basislinienbetrieb, und legen Sie Subtrahieren auf Offset plus Neigung und X min zwischen vierzig und sechzig Prozent fest. Wählen Sie auf der Registerkarte vertikale Spitzenposition auf glatt eng aus, wenn Sie lieber an Rohdaten arbeiten möchten.Um das geeignete Anpassungsmodell auszuwählen, wechseln Sie zur Registerkarte Elastizitätsanpassung, und wählen Sie je nach erwarteter Haftfestigkeit eine der Optionen aus. Wenn keine oder schwache Haftung vorhanden ist, verwenden Sie die Annäherungskurve und ziehen Sie es vor, das Hertz-Isnader-Modell zu verwenden. Im Falle einer stärkeren Haftung, verwenden Sie das Modell von Dergen Milia Dortoprov oder DMD und arbeiten Sie an einer Verzögerungskurve.Legen Sie nun die geometrischen Spitzenparameter basierend auf der nominalen Spitzenform fest. Die Spitze, die in diesem Experiment verwendet wird, ist eine kugelförmige Spitze mit einem Radius von vierhundert Nanometern. Legen Sie als Nächstes das Poisson-Verhältnis auf 0,5 fest, und wählen Sie Verschiebungskurven aus.Fügen Sie eine zweite Elastizitätsanpassungsroutine hinzu, indem Sie auf das Symbol im Hauptfenster klicken, und wiederholen Sie die gleichen Parametereinstellungen. Geben Sie schließlich den gewünschten Einzug in X min an und gelten Sie auf alle, um die vorherigen Schritte auf allen Kurven der Karte zu durchlaufen. Speichern Sie die Ergebnisse, um ein Bild in einer Punkt-TSV-Datei zu erhalten.Um mit schnellen Lösungsänderungen zu messen, montieren Sie eine Probe in eine Petrischale, halten Sie ein kleines Stück Klebemastix. Verschließen Sie den Spalt zwischen Mastix und Probenbasis schnell mit biokompatiblem Kleber. Warten Sie, bis der Kleber erstarrt ist, und tauchen Sie die Probe dann in ein flüssiges Spitzenkulturmedium, das 0,1 Prozent Pflanzenschutzgemisch enthält.Öffnen Sie nach der Kalibrierung des Systems die Erfassungssoftware und gehen Sie zunächst zum Prüfparameterfenster. Dort wird die Federkonstante auf die gefertigte Federkonstante oder die ermittelte Federkonstante des Auslegers eingestellt. Als nächstes stellen Sie den Spitzenradius auf vierhundert Nanometer, das Proben-Poisson-Verhältnis auf 0,5, die Probenlinie auf einhundertachtundzwanzig, um eine schnelle Erfassung zu gewährleisten, die Scanrate auf 0,2 Hertz und die Scangröße auf ein Mikron.Gehen Sie dann zum Rampenfenster und setzen Sie die Rampengröße auf fünf Mikrometer, die Trig-Schwelle auf maximal und die Anzahl der Proben auf viertausend sechshundertacht. Wenn alle Parameter festgelegt sind, nähern Sie sich der Probe sorgfältig manuell. Wenn sich die Sonde relativ nahe an der Probenoberfläche befindet, klicken Sie auf Denerk.Nach Kontakt die Scangröße schrittweise erhöhen und die Scanrate ändern, bis ein gewünschtes Gleichgewicht erreicht ist, ohne die Probe oder die Spitze zu beschädigen. Verschieben Sie den Scan, wenn der Messbereich nicht wie gewünscht ist. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche, zeigen und schießen, um den Punkt zu initiieren und das Fenster zu schießen.Geben Sie ein Speicherverzeichnis und einen Dateinamen an. Klicken Sie dann auf ramp auf nächsten Scan, um die Aufnahme zu initiieren. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wird die Softwareschnittstelle zum Rampenfenster umgeleitet.Klicken Sie auf das gescannte Bild, um die zu einrückenden Positionen anzugeben. Wählen Sie mindestens drei Einzugsanzeigen pro Zelle in der Nähe des Beerenzentrums aus, legen Sie fest, dass der Einzug dreimal pro Seite wiederholt wird, und klicken Sie dann auf Rampe und Erfassung. Öffnen Sie in der Analysesoftware die Dot-MCA-Datei, die die Position jeder Kraftkurve auf dem gescannten Bild anzeigt.Öffnen Sie dann eine zu analysierende Kraftkurve. Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Basislinienkorrektur, und ziehen Sie die blauen Strichlinien auf der Kraftkurve, bis Sie den Quellbasislinienstart verlängern und den Quellbasislinienstopp verlängern bzw. 0 Prozent bzw. 80 Prozent betragen. Klicken Sie dann auf ausführen.Klicken Sie als nächstes auf die Schaltfläche Box Car Filter, und klicken Sie auf Ausführen, um die Kraftkurve zu glätten. Klicken Sie dann auf die Einzugsschaltfläche. Legen Sie im Eingabefenster die zu erweiternde aktive Kurve, die fünfte Methode auf linearisiertes Modell, die maximale Kraftanpassungsgrenze auf 99 Prozent, die Min-Kraft-Anpassungsgrenze auf 75 Prozent und das Anpassungsmodell auf Steifigkeit fest.Analysieren Sie die Kraftkurven in einem Batch. Um dies zu erreichen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführungsverlauf", geben Sie das Berichtsverzeichnis an, und fügen Sie weitere Kraftkurven hinzu, die die gleiche Behandlung erfordern. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Ausführen.Wenn der Wert für K batch angepasst ist, klicken Sie auf Verlauf, und wechseln Sie zu fünf Einzüge, um zum Einzugsfenster zurückzukehren. Wenn Sie dort sind, ändern Sie die maximale Kraftanpassungsgrenze auf zehn Prozent und die min-Kraft anpassungsgrenze auf ein Prozent. Stellen Sie dann das Anpassungsmodell auf Hertzian ein.Öffnen Sie als Nächstes die entsprechende Datei, um die verschiedenen gescannten Kanäle anzuzeigen. Klicken Sie im Fenster mit dem hohen Kanal auf die Schaltfläche "Abschnitt". Dies ermöglicht die Messung der Probenoberflächenkrümmung, die für den Turgordruckabzug erforderlich ist.Zeichnen Sie dann eine Linie über die lange Achse einer Zelle, verschieben Sie die Strichliniengrenzen an die Zellenkanten, und zeichnen Sie den Radiuswert auf. Folgen Sie schließlich im Textprotokoll, um den mittleren Jungmodul, die Federkonstante, E, K und den Turgordruck für jede Zelle zu berechnen. Das Bild auf der linken Seite ist eine Karte des Jungmoduls, die durch die Analyse des gesamten Einzugs bis zum benutzerdefinierten Kraftsollwert erhalten wird, während das Bild auf der rechten Seite das Ergebnis der Analyse der ersten hundert Nanometer Einzug zeigt.Hier sehen die beiden Karten jedoch sehr ähnlich aus, die Variation der Einzugstiefe kann in einigen Fällen dazu führen, Stichprobenheterogenitäten besser hervorzuheben, was hilfreich sein kann, um den Standort zu identifizieren oder Informationen über das Verhalten interner Strukturen bereitzustellen. Für jeden Punkt auf diesen Karten gibt es eine zugrunde liegende Kraftkurve. Die hier gezeigte Kurve hat zwei Effekte, die erwähnenswert sind.Zunächst einmal, wenn der Annäherungsteil der Kraftkurve bei fünfhundert Nanonewton endet. Die Abwärtsspitzenbewegung geht weiter. Das bedeutet, dass die letzte Kraft, die von der Spitze angewendet wird, höher ist als erwartet.Die zweite Sache zu bemerken, ist die Welle in auf der Rückzugskurve durch die Ellipse hervorgehoben. Ein solches Winken kann ein Indikator für Probenseinwen sein, die sich unter der Wirkung der Spitze bewegen oder vibrieren, und es kann erforderlich sein, zu einer anderen Fixierungsmethode zu wechseln. Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Verfahren können alle wichtigen Parameter für einen Turgordruckabzug mit Ausnahme der Zellwanddicke aus AFM-Scans und Einzügen abgerufen werden.Die Kraftkurve des tiefen Einzugs an der Rotkreuzposition beschreibt den Modul der Zellwandjungundung und die scheinbare Steifigkeit der Probe bei verschiedenen Regimen der Kurve. Die Probenfixierung ist von entscheidender Bedeutung. Achten Sie während des Messvorgangs auf Anzeichen von Probeninstabilität.Wählen Sie sorgfältig eine Region mit flacher Oberfläche aus, um eine senkrechte Einrückung zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren kann man mechanische Eigenschaften im Laufe der Zeit und verschiedene Bedingungen überwachen. Man kann auch mechanische Messungen mit konfokalen Bildern für korrelative Studien überlagern.Diese Technik ebnet den Weg für die Verknüpfung von Biomechanik mit physiologen der Entwicklung und anderen biologischen Prozessen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Entwicklung und Genexpression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Entwicklung von Targeting Induzierte lokale Läsionen IN Genomen (TILLING) Populationen in Kleinkornkulturen durch Ethylmethansulfonat-Mutagenese

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging von Microtubule Cytoskeleton und mikromechanische Manipulation der Arabidopsis Schießen apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...