Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות לצוות הפלטים על התמיכה הטכנית שלהם, כמו גם ארצקי בודאוד וחברי צוות הביוסיק במעבדת RDP לדיונים מועילים.

1. מידה של מאפיינים מכניים של קיר התא
הערה: מוצג דוגמה של החלה התפתחות החלה ההתפתחות הבין-מידלית של Arabidopsis .
<ol><li>הכנת דגימות ביולוגיות
	<ol>
<li>לאסוף ניצן פרח סגור בשלב 9 עד 10 (כ 0.5 מ"מ זמן) לפי קביעת שלבים שפורסמו עבור Arabidopsis4. תחת המשקפת, באמצעו?...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

הופעתה של צורות בצמחים נקבעת בעיקר על ידי הקצב המתואם וכיוון הצמיחה בזמן ובמרחב. תאי הצמחים מארוזים בקיר תא קשיח העשוי ממטריצה פוליסכדידיום, אשר מדביק אותם יחד. כתוצאה מכך, הרחבת התא נשלטת על ידי שיווי משקל בין לחץ טורגור מושך את קיר התא, ואת הנוקשות של קיר התא התנגדות ללחץ זה. כדי להבין את ה...

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שייך מיקרוסקופ בדיקה סריקה (SPM) משפחה, שם טיפ עם רדיוס של בדרך כלל ננומטרים כמה סורקת את פני השטח של מדגם. גילוי משטח אינו מושג בשיטות אופטיות או באמצעות אלקטרון, אלא דרך כוחות האינטראקציה בין הקצה לבין משטח המדגם. לפיכך, טכניקה זו אינה מוגבלת לאפיון טופוגרפי של משטח לדוגמה (רזולוציה תלת-ממדית שיכולה לרדת לכמה ננומטר), אלא גם מאפשרת את המדידה של כל סוג של כוחות אינטרקציה כגון אלקטרוסטטית, ואן דר וואלס או כוחות מגע. יתר על כן, ניתן להשתמש בעצה כדי להחיל כוחות על פני השטח של דגימה ביולוגית ולמדוד את דפורמציה כתוצאה מכך, את מה שמכונה "כניסות", כדי לקבוע את תכונותיו המכאניות (למשל, מודולוס של יאנג, מאפיינים אלסטיים).
תכונות מכניות של קירות תא הצמח חיוניים להילקח בחשבון כאשר מנסים להבין מנגנונים בבסיס תהליכים התפתחותיים1,2,3. ואכן, מאפיינים אלה נשלטים באופן הדוק במהלך הפיתוח, במיוחד מאחר שריכוך הקירות התאי נדרש כדי לאפשר לתאים לצמוח. AFM יכול לשמש כדי למדוד מאפיינים אלה וללמוד את האופן שבו הם משתנים בין איברים, רקמות או שלבים התפתחותיים.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים AFM למדוד את שני הקירות התא תכונות מכניות ולחץ טורגור. שני יישומים אלה מומחש בשני מיקרוסקופים AFM שונים ומפורטים כאן לאחר מכן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

אנו מציגים כאן את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי לכניסה רקמות הצמח ולשחזר את תכונותיו המכאניות. באמצעות שני מיקרוסקופים שונים במצב כניסה, אנו מראים כיצד למדוד מודול אלסטי ולהשתמש בו כדי להעריך תכונות מכניות של קיר התא. בנוסף, אנו גם מסבירים כיצד להעריך לחץ טורגור. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופ הכוח האטומי הם שהוא לא פולשני, מהיר יחסית (5 ~ 20 דקות), וכי כמעט כל סוג של רקמת צמחים חיים שטוח באופן שטחי ניתן לנתח ללא צורך בטיפול. הרזולוציה יכולה להיות טובה מאוד, בהתאם לגודל הקצה ולמספר המידות לכל אזור יחידה. מגבלה אחת של שיטה זו היא שהיא מעניקה רק גישה ישירה לשכבת התא השטחית.

איור 1A ואיור 1a מציגים מסך צילום הממחיש את תוצאת השלבים ה1.3.4 ל1.3.6 של הפרוטוקול, המשמש לאיתור אזור מעניין היכן לרכוש את מפת ה-QI. ראוי לציין שאזור העניין נבחר כדי לא להיות על משטח מוטה (כלומר שטוח ככל האפשר). למעשה, כפי שהבחינו על ידי Routier ואח '<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

תכונות מכניות של תאי צמחים חיוניות שיש לקחת בחשבון כאשר מנסים להבין מנגנונים שבבסיס הפיתוח. מיקרוסקופ כוח אטומי יכול לשמש כדי למדוד תכונות אלה, ולעקוב אחר הדרך בה הם משנים, בין איברים, רקמות, כל השלבים ההתפתחותיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו, היא כי זה לא פולשני, זה מהיר יחסית וזה לא דורש טיפול אז זה יכול להיות מיושם ישירות על דגימות חיות.עבור מישהו חדש בהליך זה, סעיף cis של המדגם הוא קריטי באמת, כדי לוודא כי באמת יש לך קיבעון מכני תקין של המדגם. הדגמה חזותית של הליך זה, היא קריטית כדי להבין טוב יותר את המורכבות של קיבעון מדגם, בקרת איכות של פוסטרים הגדרת מדידה. הדגימה של ההליך תהיה סימון בוביו, מהנדסת ויוכן לונג, פוסט דוקטורט במעבדה שלי.כדי להתחיל, מניחים חתיכת סרט הדבקה דו צדדי במרכז צלחת פטרי בקוטר חמישה סנטימטרים. הוסף דגימה של ג'נסיום שבודדה מניצן פרחים לקלטת. מוסיפים במהירות מים לצלחת עד שהדגימה מכוסה לחלוטין כדי למנוע התייבשות.לאחר מכן, מניחים את המדגם על שלב AFM ומזיזים את הראש כך שהוא מעל המדגם. לאחר כייל את cantilever, בתוכנה, להבטיח כי המערכת היא במצב QI, וגישה המדגם עם כוח נקודה מוגדרת של חמישה עשר ננו ניוטון. לאחר מכן, הגדר אורך Z של ארבעה מיקרון והגדר את אזור הסריקה ל-שמונים על שמונים מיקרון בריבוע עם מספר הפיקסלים שנקבע לארבעים על ארבעים.לאחר מכן עבור אל לוח הגדרות ההדמיה המתקדם והגדר את המצב למהירות קבועה. בנוסף, להגדיר להאריך להאריך להאריך את מהירויות המסלול למאתיים מיקרון לשנייה, ואת קצב המדגם לעשרים וחמישה קילו הרץ. לאחר הגדרת הפרמטרים, העבר את הטיפ לאזור העניין בדגימה.ודא שהאזור שיש לסרוק נקי מפסולת, אתר אזור שטוח ככל האפשר, ועסוק, ולאחר מכן התחל את הסריקה ולהשתמש בסריקת הכוח הנמוך המהירה כדי לבדוק אם המדגם זז. לאחר אזור עניין כפי שנמצא, בחר אזור ארבעים על ארבעים עד שישים על שישים מיקרון בריבוע, והגדל את מספר הפיקסל לשני פיקסלים למיקרון. לאחר מכן, להגדיל את הנקודה שנקבעה לחמש מאות ננו ניוטון, כדי לקבל חריץ של מאה עד מאתיים ננו מטרים.הקטן את אורך ה- Z לשני מיקרון, והרחב את מהירויות דרכי הכניסה למאה מיקרון לשנייה, ולאחר מכן הגדל את קצב הדגימה לחמישים קילוהרץ והתחל לסרוק את הדגימה. בסיום, שמור את הפלט הן כתמונה והן כקובץ נתונים. פתח את תוכנת עיבוד הנתונים וטען את קובץ הנתונים.לחץ על השימוש במפה זו ללחצן עיבוד אצווה כדי להשתמש באותם פרמטרים על כל עקומות המפה, ולאחר מכן עבור לטעון תהליך מוגדר מראש ובחר הרץ להתאים. לאחר מכן, עבור לפעולת קו בסיס הניתנת להחלפה והגדר חיסור להיסט פלוס הטיה, ו- X min בין ארבעים ל-שישים אחוזים. בכרטיסיה מיקום תיאור אנכי, בחר במצב חלק הדוק, אם אתה מעדיף לעבוד על נתונים גולמיים.כדי לבחור את דגם מתאים, עבור אל לשונית התאמה גמישות, ובחר אחת האפשרויות בהתבסס על חוזק ההיתוך הצפוי. אם אין הידבקות או הידבקות חלשה, לאחר מכן להשתמש בעקומת הגישה ומעדיפים להשתמש במודל הרץ isnader. במקרה של הידבקות חזקה יותר, השתמש במודל של Dergen Milia Dortoprov או DMD ולעבוד על עקומה מפגרת.כעת הגדר את הפרמטרים הגיאומטריים של הקצה בהתבסס על צורת קצה נומינלי. הקצה המשמש בניסוי זה הוא קצה כדורי, עם רדיוס של 400 ננומטר. לאחר מכן, הגדר את יחס פואסון ל- 0.5 ובחר עקומות הזזה.הוסף שגרת התאמה גמישות שנייה, על ידי לחיצה על הסמל ליד החלון הראשי, וחזור על אותן הגדרות פרמטר. לבסוף, ציין את הכניסה הרצויה ב- X min ולאחר מכן שמור והחל על הכל כדי לחזור על השלבים הקודמים בכל עקומות המפה. שמור את התוצאות כדי להשיג תמונה בקובץ tsv נקודה.כדי למדוד עם שינויים בפתרון מהיר, הר מדגם בצלחת פטרי, מחזיק חתיכה קטנה של מסטיק דבק. לאטום במהירות את הפער בין המסטיק לבסיס המדגם עם דבק תואם ביולוגית. המתן עד שהדבק יתמצק ולאחר מכן הטביע את המדגם במדיום תרבות איפקס נוזלי, המכיל 0.1 אחוז תערובת שימור צמחים.לאחר כיול המערכת, פתח את תוכנת הרכישה ועבור תחילה לחלון פרמטר הסימון. שם קבע את קבוע האביב ל קבוע האביב המיוצר של cantilever או קבוע האביב הנחוש. לאחר מכן, הגדר את רדיוס הקצה ל-400 ננומטר, את יחס הפואסון לדוגמה ל-0.5, את קו הדגימה למאה ועשרים ושמונה כדי להבטיח רכישה מהירה, את קצב הסריקה ל-0.2 הרץ ואת גודל הסריקה למיקרון אחד.לאחר מכן עבור לחלון הרמפה והגדר את גודל הרמפה לחמישה מיקרון, את סף הטריגונומטריה למקסימום, ואת מספר הדגימות לארבעת אלפים שש מאות ושמונה. עם כל הפרמטרים להגדיר, בזהירות לגשת לדוגמה באופן ידני. כאשר החללית קרובה יחסית למשטח המדגם, לחץ על התקרבות.במגע, הגדל בהדרגה את גודל הסריקה ושנה את קצב הסריקה, עד לקבלת איזון רצוי מבלי לפגוע בדגימה או בקצה. הקם מחדש את הסריקה אם אזור המדידה אינו רצוי. כאשר מרוצה, לחץ על הכפתור, הצבע ולירות, כדי ליזום את הנקודה ולירות חלון.ציין ספריית שמירה ושם קובץ. לאחר מכן לחץ על רמפה בסריקה הבאה כדי ליזום הקלטה. לאחר השלמת הסריקה, ממשק התוכנה יפנה מחדש לחלון הרמפה.לחץ על התמונה הסרוקה כדי לציין את המיקומים כדי להסיט פנימה. בחר לפחות שלושה מראות כניסה לכל תא ליד מרכז פירות היער שלו, הגדר אותו כך שיחזור על הכניסה שלוש פעמים בכל צד ולאחר מכן לחץ על שיפוע ולכידה. בתוכנת הניתוח, לפתוח את קובץ MCA נקודה, זה מראה את המיקום של כל עקומת כוח על התמונה הסרוקה.ואז לפתוח עקומת כוח אחת כדי לנתח. לחץ על לחצן תיקון קו הבסיס וגרור את קווי המקף הכחולים בעקומות הכוח, עד להרחבת נקודת ההתחלה של קו הבסיס המשמש כמקור ולהרחבת עצירת קו הבסיס המשמש כמקור, או ב- 0 אחוזים ו- 80 אחוזים בהתאמה. לאחר מכן לחץ על ביצוע.לאחר מכן לחצו על לחצן מסנן המכונית של התיבה ולחצו על הלחצן 'בצע' כדי להחליק את עקומת הכוח. לאחר מכן לחץ על לחצן הכניסה. בחלון הקלט, הגדר את העקומה הפעילה כך שתרחיב, את השיטה החמישית לדגם ליניארי, את גבול התאמה הכוח המרבי ל- 99 אחוזים, את גבול התאם של הכוח הטחון ל- 75 אחוזים ואת מודל מתאים לנוקשות.נתח את עקומות הכוח באצווה. כדי לבצע זאת, לחץ על לחצן היסטוריית הפעלה, ציין ספריית דוח והוסף עקומות כוח אחרות הדורשות טיפול זהה. לאחר שתסיים, לחץ על הפעל.כאשר הערך עבור K מצויד באצווה, לחץ על היסטוריה ולעבור לחמש כניסות כדי לחזור לחלון הכניסה. ברגע שיש, לשנות את כוח מקסימלי להתאים גבול לעשרה אחוזים וכוח דקה להתאים גבול לאחוז אחד. ואז להגדיר את המודל בכושר להרציאן.לאחר מכן, פתח את הקובץ המתאים כדי להציג את הערוצים הסרוקים השונים. בחלון ערוץ גבוה, לחץ על כפתור המקטע. זה יאפשר את המדידה של עקמומיות משטח מדגם הנדרש עבור ניכוי לחץ טורגור.לאחר מכן צייר קו לאורך הציר הארוך של תא אחד, הזז את גבולות קו המקף אל קצות התא והתזמן את ערך הרדיוס. לבסוף בצע בפרוטוקול הטקסט, כדי לחשב את מודולוס של הצעיר הממוצע, קבוע האביב, E, K, ואת הלחץ טורגור עבור כל תא. התמונה משמאל היא מפה של המודולוס של הצעירים, המתקבלת על ידי ניתוח כל הכניסה עד לנקודת הגדרת הכוח המוגדרת על ידי המשתמש בעוד התמונה מימין, מראה את התוצאה של ניתוח מאה ננו מטרים הראשונים של הכניסה.כאן, שתי המפות נראות דומות מאוד עם זאת, הווריאציה של עומק הכניסה יכולה להוביל במקרים מסוימים כדי להדגיש טוב יותר את ההטרוגניות לדוגמה, אשר יכול להיות מועיל לזיהוי המיקום או לספק מידע על ההתנהגות של מבנים פנימיים. עבור כל נקודה במפות אלה, קיימת עקומת כוח המשמשת כבסיס. העקומה המוצגת כאן, יש שתי השפעות שכדאי להזכיר.קודם כל, אם חלק הגישה של עקומת הכוח מסתיים בחמש מאות ננו ניוטון. תנועת הקצה כלפי מטה ממשיכה. כלומר, הכוח הסופי שהוחל על-ידי הקצה גבוה מהצפוי.הדבר השני שיש לשים לב אליו, הוא הגל בעקומות הנסיגה המודגשות על ידי האליפסה. נפנוף כזה יכול להיות אינדיקטור של מדגם נע או רוטט תחת הפעולה של הקצה ואת המעבר לשיטת קיבוע שונה עשוי להידרש. באמצעות ההליך המתועד במאמר זה, ניתן לאחזר את כל הפרמטרים העיקריים עבור ניכוי לחץ טורגור למעט עובי קיר התא מסריקות AFM וכניסות.עקומת הכוח של חריץ עמוק בעמדת הצלב האדום מתארת את המודולוס של קיר התא הצעיר ואת הנוקשות לכאורה של המדגם במשטרים שונים של העקומה. קיבעון לדוגמה הוא קריטי. במהלך תהליך המדידה, לשים לב סימנים של חוסר יציבות מדגם.בחרו בקפידה אזור עם משטח שטוח כדי להבטיח כניסה ניצבת. בעקבות הליך זה, ניתן לפקח על תכונות מכניות לאורך זמן ותנאים שונים. אפשר גם כיסוי מדידות מכניות עם תמונות confocal למחקרים קוטלטיביים.טכניקה זו סוללת את הדרך לחיבור ביומכניקה עם התפתחות הפיזיולוגיה ותהליכים ביולוגיים אחרים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; ביטוי פיתוח וג&#39;ין

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

פיתוח מיקוד המושרה נגעים מקומיים בשנת Genomes (לעיבוד קרקע) אוכלוסיות בגידולים גרעינים קטנים על ידי אתיל מתיונין מוטאנזיס

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...