Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
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Ringraziamo il team PLATIM per il supporto tecnico, arezki Boudaoud e i membri del team Biophysic presso il laboratorio RDP per le discussioni utili.

1.Misura delle proprietà meccaniche delle pareti cellulari
 NOT:</</c0> Viene presentato un esempio del gynoecium in via di sviluppo dell'Arabidopsis.
<ol><li>Preparazione dei campioni biologici
	<ol>
<li>Raccogliere un bocciolo di fiore chiuso allo stage 9 a 10 (circa 0,5 mm di lunghezza) in base alle fasi pubblicate determinazione per Arabidopsis4. Sotto un binocolo, utilizzando belle pinzette, aprire con attenzione il ger...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

L'emergere di forme nelle piante è determinato principalmente dal tasso coordinato e dalla direzione della crescita nel tempo e nello spazio. Le cellule vegetali sono racchiuse in una parete cellulare rigida fatta di una matrice polisaccartide, che le incolla insieme. Di conseguenza, l'espansione cellulare è controllata dall'equilibrio tra la pressione del turgor che tira sulla parete cellulare e la rigidità della parete cellulare che resiste a questa pressione. Al fine di comprendere i meccanismi alla base dello svil...

La microscopia a forza atomica (AFM) appartiene alla famiglia di microscopia a sonda a scansione (SPM), dove una punta con un raggio di solito di pochi nanometri scansiona la superficie di un campione. Il rilevamento di una superficie non si ottiene tramite metodi ottici o basati su elettroni, ma tramite le forze di interazione tra la punta e la superficie del campione. Pertanto, questa tecnica non si limita alla caratterizzazione topografica di una superficie campione (risoluzione 3D che può scendere a pochi nanometri), ma consente anche la misurazione di qualsiasi tipo di forza di interazione come l'elettrostatica, van der Waals o forze di contatto. Inoltre, la punta può essere utilizzata per applicare le forze sulla superficie di un campione biologico e misurare la deformazione risultante, la cosiddetta "indentazione", al fine di determinarne le proprietà meccaniche (ad esempio, il modulo di Young, le proprietà viscoelastice).
Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari delle piante sono essenziali per essere prese in considerazione quando si cerca di comprendere i meccanismi alla base dei processi di sviluppo1,2,3. Infatti, queste proprietà sono strettamente controllate durante lo sviluppo, in particolare poiché l'ammorbidimento della parete cellulare è necessario per consentire alle cellule di crescere. AFM può essere utilizzato per misurare queste proprietà e studiare il modo in cui cambiano tra organi, tessuti o stadi di sviluppo.
In questo articolo, descriviamo come usiamo AFM per misurare sia le proprietà meccaniche della parete cellulare che la pressione del turgor. Queste due applicazioni sono dimostrate su due diversi microscopi AFM e sono descritte qui dopo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

Qui presentiamo l'uso della microscopia a forza atomica per far rientrare i tessuti delle piante e recuperare le sue proprietà meccaniche. Utilizzando due diversi microscopi in modalità di rientro, mostriamo come misurare un modulo elastico e usarlo per valutare le proprietà meccaniche della parete cellulare. Inoltre, spieghiamo anche come valutare la pressione del turgor. I principali vantaggi della microscopia a forza atomica sono che è non invasiva, relativamente rapida (5-20 min), e che praticamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale vivente superficialmente piatto può essere analizzato senza la necessità di trattamento. La risoluzione può essere molto buona, a seconda della dimensione della punta e del numero di misure per unità di area. Una limitazione di questo metodo è che dà solo accesso diretto allo strato di cellule superficiali.

Figura 1A e Figura 1B mostra una schermata che illustra il risultato dei passaggi da 1.3.4 a 1.3.6 del protocollo, utilizzato per individuare un'area di interesse in cui acquisire la mappa di QI. Vale la pena ricordare che la regione di interesse è stata scelta per non essere su una superficie inclinata (cioè il più piatta possibile). In realtà, come notato da Routier et al.5, se l'asse di rientro non ...

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Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Qui, presentiamo la microscopia a forza atomica (AFM), operata come strumento di nano- e micro-rientranza su cellule e tessuti. Lo strumento consente l'acquisizione simultanea della topografia della superficie 3D del campione e delle sue proprietà meccaniche, tra cui il modulo della parete cellulare Young e la pressione del turgor.

Uso della microscopia a forza atomica per misurare le proprietà meccaniche e la pressione del turgor delle cellule vegetali e dei tessuti vegetali

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Le proprietà meccaniche delle cellule vegetali sono essenziali per essere prese in considerazione quando si cerca di comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo. La microscopia a forza atomica può essere usata per misurare queste proprietà, e seguire il modo in cui cambiano, tra organi, tessuti, tutte le fasi dello sviluppo. I principali vantaggi di questa tecnica, è che non è invasiva, è relativamente rapida e non richiede un trattamento quindi può essere applicata direttamente ai campioni viventi.Per qualcuno che è nuovo a questa procedura, la sezione cis del campione è davvero critica, quindi assicurati di avere davvero una corretta fissazione meccanica del campione. La dimostrazione visiva di questa procedura, è fondamentale per comprendere meglio la complessità della fissazione del campione, il controllo di qualità degli alimenti e la configurazione della misurazione. A dimostrare la procedura saranno Simone Bovio, ingegnere e Yuchen Long, post doc nel mio laboratorio.Per iniziare, posizionare un pezzo di nastro a doppia parte al centro di una piastra di petri di cinque centimetri di diametro. Aggiungere un campione di genesium che è stato isolato da un bocciolo di fiori al nastro. Aggiungere rapidamente acqua al piatto fino a quando il campione non è completamente coperto in modo da evitare la disidratazione.Quindi, posizionare il campione su uno stadio AFM e spostare la testa in modo che sia sopra il campione. Dopo aver calibrato il cantilever, nel software, assicurarsi che il sistema sia in modalità QI, e avvicinarsi al campione con una forza del set point di quindici nano newton. Quindi, impostare una lunghezza Z di quattro micron e impostare l'area di scansione su ottanta per ottanta micron al quadrato con il numero di pixel impostato su quaranta per quaranta.Quindi vai al pannello delle impostazioni di imaging avanzate e imposta la modalità a velocità costante. Inoltre, impostare estendere la velocità di ingresso della traccia a duecento micron al secondo e la frequenza di campionamento a venticinque kilo hertz. Una volta impostati i parametri, spostare la punta nell'area di interesse del campione.Verificare che l'area da scansionare sia priva di detriti, individuare una regione il più piatta possibile e innestare, quindi iniziare la scansione e utilizzare la scansione rapida a bassa forza per verificare se il campione si muove. Una volta posizionata un'area di interesse, selezionare un'area 40 per 40-60 Micron al quadrato e aumentare il numero di pixel a due pixel per micron. Successivamente, aumentare il set point a cinquecento nano newton, per ottenere un'indentazione da cento a duecento nanometri.Diminuire la lunghezza Z a due micron e la velocità del tratto di ingresso di estensione a cento micron al secondo, quindi aumentare la frequenza del campione a cinquanta kilohertz e iniziare a scansionare il campione. Al termine, salvare l'output sia come immagine che come file di dati. Aprire il software di elaborazione dati e caricare il file di dati.Fare clic sul pulsante usa questa mappa per l'elaborazione batch per utilizzare gli stessi parametri su tutte le curve della mappa, quindi andare a caricare il processo predefinito e selezionare hertz fit. Passare quindi all'operazione della linea di base commutabile e impostare sottrai su offset più inclinazione e X min tra il quaranta e il sessanta per cento. Nella linguetta della posizione verticale della punta, selezionare a tenuta stavola, se si preferisce lavorare su dati non elaborati.Per selezionare il modello di adattamento appropriato, passare alla scheda adatta all'elasticità e selezionare una delle opzioni in base alla forza di adesione prevista. Se non è presente alcuna adesione o adesione debole, utilizzare la curva di avvicinamento e preferire utilizzare il modello di isnader hertz. In caso di adesione più forte, utilizzare il modello di Dergen Milia Dortoprov o DMD e lavorare su una curva ritardata.Ora imposta i parametri geometrici della punta in base alla forma nominale della punta. La punta utilizzata in questo esperimento è una punta sferica, con il raggio di quattrocento nanometri. Impostare quindi il rapporto Poisson su 0,5 e selezionare le curve di spostamento.Aggiungere una seconda routine di adattamento dell'elasticità, facendo clic sull'icona tramite la finestra principale e ripetendo le stesse impostazioni dei parametri. Infine, specificate il rientro desiderato in X min, quindi tenete e applicate a tutti per iterare i passaggi precedenti su tutte le curve della mappa. Salvare i risultati per ottenere un'immagine in un file tsv punto.Per misurare con rapidi cambi di soluzione, montare un campione in una piastra di Petri, tenendo un piccolo pezzo di masttico adesivo. Sigillare rapidamente lo spazio tra il masttico e la base del campione con colla biocompatibile. Attendere che la colla si solidifichiamo e quindi immergere il campione in un mezzo di coltura di apice liquido, contenente lo 0,1% di miscela di conservazione delle piante.Dopo aver calibrato il sistema, aprire il software di acquisizione e passare prima alla finestra dei parametri di controllo. Lì impostare la costante di molla sulla costante di molla prodotta dal cantilever o sulla costante di molla determinata. Successivamente, impostare il raggio della punta su quattrocento nanometri, il rapporto poisson campione su 0,5, la linea del campione a centoventotto per garantire un'acquisizione rapida, la velocità di scansione a 0,2 hertz e la dimensione della scansione a un micron.Quindi vai alla finestra della rampa e imposta la dimensione della rampa su cinque micron, la soglia del trig al massimo e il numero di campioni a quattromilaseicentootto. Con tutti i parametri impostati, avvicinati attentamente al campione manualmente. Quando la sonda è relativamente vicina alla superficie del campione, fare clic su approccio.Al contatto, aumentare gradualmente le dimensioni della scansione e modificare la velocità di scansione, fino a raggiungere il bilanciamento desiderato senza danneggiare il campione o la punta. Riposizionare la scansione se l'area di misura non è come desiderato. Se soddisfatto, fai clic sul pulsante, punta e scatta, per avviare il punto e sparare alla finestra.Specificare una directory di salvataggio e un nome di file. Quindi fare clic su rampa sulla scansione successiva per avviare la registrazione. Al termine della scansione, l'interfaccia software verrà reindirizzata alla finestra della rampa.Fare clic sull'immagine digitalizzata per specificare le posizioni da indentare. Scegli almeno tre punti di indentazione per cella vicino al suo centro bacche, impostalo per ripetere l'indentazione tre volte per lato, quindi fai clic su rampa e cattura. Nel software di analisi, aprire il file MCA punto, questo mostra la posizione di ogni curva di forza sull'immagine digitalizzata.Quindi aprire una curva di forza da analizzare. Fare clic sul pulsante di correzione della linea di base e trascinare le linee del trattino blu sulla curva di forza, fino a estendere l'inizio della linea di base di origine ed estendere l'arresto della linea di base di origine o rispettivamente allo 0% e all'80%. Quindi fai clic su esegui.Fare quindi clic sul pulsante del filtro dell'auto della scatola e quindi su Esegui per smussare la curva di forza. Quindi fare clic sul pulsante di rientro. Nella finestra di input, impostate la curva attiva da estendere, il quinto metodo sul modello linearizzato, il limite massimo di adattamento della forza al 99%, il limite di adattamento della forza min al 75% e il modello di adattamento alla rigidità.Analizzare le curve di forza in un batch. A tale scopo, fare clic sul pulsante Esegui cronologia, specificare la directory dei report e aggiungere altre curve di forza che richiedono lo stesso trattamento. Al termine, fare clic su Esegui.Quando il valore di K è montato in batch, fare clic sulla cronologia e passare a cinque rientri per tornare alla finestra di rientro. Una volta lì, modificare il limite massimo di adattamento della forza al dieci per cento e il limite di adattamento della forza min all'uno per cento. Quindi impostare il modello di adattamento su Hertzian.Aprire quindi il file appropriato per visualizzare i diversi canali analizzati. Nella finestra del canale alto fare clic sul pulsante della sezione. Ciò consentirà la misurazione della curvatura della superficie del campione necessaria per la deduzione della pressione del turgore.Quindi disegnare una linea attraverso l'asse lungo di una cella, spostare i limiti della linea del trattino sui bordi della cella e registrare il valore del raggio. Infine seguire nel protocollo di testo, per calcolare il modulo medio del giovane, la costante di molla, E, K, e la pressione di turgore per ogni cella. L'immagine a sinistra è una mappa del modulo del giovane, ottenuta analizzando l'intera rientrazione fino al set point di forza definito dall'utente mentre l'immagine a destra, mostra il risultato dell'analisi dei primi cento nanometri di indentazione.Qui, le due mappe sembrano molto simili, tuttavia, la variazione della profondità di indentazione può portare in alcuni casi a evidenziare meglio le eterogeneità del campione, che possono essere utili per identificare la posizione o per fornire informazioni sul comportamento delle strutture interne. Per ogni punto su queste mappe, c'è una curva di forza sottostante. La curva mostrata qui, ha due effetti che vale la pena menzionare.Prima di tutto, se la parte di avvicinamento della curva di forza termina a cinquecento nano newton. Il movimento verso il basso della punta continua. Ciò significa che la forza finale applicata dalla punta è superiore al previsto.La seconda cosa da notare è l'onda sulla curva di retrazione evidenziata dall'ellisse. Tale agitazione può essere un indicatore dello spostamento o della vibrazione del campione sotto l'azione della punta e può essere necessario passare a un metodo di fissazione diverso. Utilizzando la procedura documentata in questo articolo, tutti i parametri chiave per una deduzione della pressione del turgore ad eccezione dello spessore della parete cellulare possono essere recuperati da scansioni e rientranze AFM.La curva di forza dell'indentazione profonda nella posizione della croce rossa descrive il modulo del giovane parete cellulare e l'apparente rigidità del campione a diversi regimi della curva. La fissazione del campione è fondamentale. Durante il processo di misurazione, prestare attenzione ai segni di instabilità del campione.Scegliete con cura una regione con superficie piana per garantire l'indentazione perpendicolare. Seguendo questa procedura, è possibile monitorare le proprietà meccaniche nel tempo e le diverse condizioni. Si possono anche sovrapporre misure meccaniche con immagini confocali per studi correlativi.Questa tecnica apre la strada al collegamento della biomeccanica con lo sviluppo della fisiologia e altri processi biologici.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sviluppo e Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Sviluppo di popolazioni indotte di lesioni locali indotte dal targeting NEI genomi (TILLING) in colture di grano piccolo mediante mutagenesi metannata etilareale

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...