Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Vi vil gjerne takke PLATIM-teamet for deres tekniske støtte, samt Arezki Boudaoud og medlemmer av Biophysic-teamet på RDP-laboratoriet for nyttige diskusjoner.

1. mål av Cell Wall mekaniske egenskaper
Merk: Eksempel på utvikling gynoecium av Arabidopsis presenteres.
<ol><li>Utarbeidelse av biologiske prøver
	<ol>
<li>Samle en lukket blomst knopp på trinn 9 til 10 (ca 0,5 mm lang) i henhold til publiserte stadier bestemmelse for Arabidopsis4. Under en kikkert, ved hjelp av fin pinsett, forsiktig åpne knopp for å sjekke utviklingstrinn og samle gynoecium som ligger i sentrum av ...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

Fremveksten av former i planter er i hovedsak bestemt av koordinert hastighet og retning av vekst i tid og rom. Plant celler er innkapslet i en stiv cellevegg laget av en polysaccharidic matrise, som lim dem sammen. Som et resultat, er celle ekspansjon styres av likevekt mellom turgor trykk trekke på celle veggen, og stivhet av celle veggen motstå dette presset. For å forstå mekanismene underliggende utvikling, er det viktig å kunne måle både celle veggen mekaniske egenskaper samt turgor trykk i ulike vev eller ce...

Atomic Force mikroskopi (AFM) tilhører skanning sonde mikroskopi (SPM) familie, der et tips med en radius av vanligvis noen nanometer skanner overflaten av en prøve. Påvisning av en overflate er ikke oppnådd via optiske eller elektron-baserte metoder, men via samspillet krefter mellom spissen og prøven overflaten. Dermed er denne teknikken ikke begrenset til topografisk karakterisering av en prøve overflate (3D-oppløsning som kan gå ned til noen få nanometer), men også tillater måling av alle typer interaksjon styrker som elektrostatisk, Van der Waals eller kontakt krefter. Videre kan spissen brukes til å anvende styrker på overflaten av en biologisk prøve og måle den resulterende deformasjon, den såkalte "innrykk", for å bestemme dens mekaniske egenskaper (for eksempel Young ' s modul, viskoelastiske egenskaper).
Mekaniske egenskaper av anlegget celle vegger er viktig å bli tatt hensyn til når du prøver å forstå mekanismer underliggende utviklingsmessige prosesser1,2,3. Faktisk er disse egenskapene strengt kontrollert under utvikling, spesielt siden celle veggen mykgjørende er nødvendig for å tillate cellene å vokse. AFM kan brukes til å måle disse egenskapene og studere hvordan de skifter mellom organer, vev eller utviklingsmessige stadier.
I denne utredningen, beskriver vi hvordan vi bruker AFM å måle både celle veggen mekaniske egenskaper og turgor trykk. Disse to programmene er demonstrert på to forskjellige AFM mikroskop og er detaljert her etter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

Vi presenterer her bruk av Atomic Force mikroskopi å rykke plante vev og gjenopprette sine mekaniske egenskaper. Ved hjelp av to forskjellige mikroskop i Innrykks modus viser vi hvordan man måler en elastisk modul og bruker den til å evaluere mekaniske egenskaper for celle veggen. I tillegg forklarer vi også hvordan man evaluerer turgor trykk. De viktigste fordelene med Atomic Force mikroskopi er at det er ikke-invasiv, relativt rask (5 ~ 20 min), og at nesten alle typer levende plante vev som er overfladisk flat kan analyseres uten behov for behandling. Oppløsningen kan være veldig god, avhengig av spissen størrelse og på antall målinger per enhet området. En begrensning av denne metoden er at den bare gir direkte tilgang til det overfladiske celle laget.

Figur 1a og figur 1B viser et skjermbilde som illustrerer resultatet av trinnene 1.3.4 til 1.3.6 av protokollen, brukes til å finne en region av interesse hvor å erverve Qi kartet. Det er verdt å nevne at den regionen av interesse har blitt valgt for ikke å være på en skråstilt overflate (dvs. så flat som mulig). Egentlig, som lagt merke til av routier et al.5, hvis Innrykks aksen ikke er vinkelret...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Her presenterer vi Atomic Force mikroskopi (AFM), opererte som en nano-og mikro-innrykk verktøyet på celler og vev. Instrumentet tillater samtidig oppkjøp av 3D overflate topografi av prøven og dens mekaniske egenskaper, inkludert celle veggen Youngs modul så vel som turgor trykk.

Bruk av Atomic Force mikroskopi å måle mekaniske egenskaper og turgor Pressure av Plant celler og Plant vev

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Mekaniske egenskaper av planteceller er avgjørende for å bli tatt hensyn til når du prøver å forstå mekanismer underliggende utvikling. Atomkraftmikroskopi kan brukes til å måle disse egenskapene, og følge måten de endrer seg på, mellom organer, vev, alle utviklingsstadier. De viktigste fordelene med denne teknikken, er at det ikke er noen invasiv, det er relativt raskt og det krever ikke behandling, slik at den kan brukes direkte på levende prøver.For noen som er ny på denne prosedyren, cis delen av prøven er veldig kritisk, så sørg for at du virkelig har riktig mekanisk fiksering av prøven. Visuell demonstrasjon av denne prosedyren, er avgjørende for å bedre forstå vanskelighetene med prøvefiksering, kvalitetskontroll av foster og måleoppsett. Å demonstrere prosedyren vil være Simone Bovio, en ingeniør og Yuchen Long, en post doc i laboratoriet mitt.For å begynne, plasser et stykke dobbeltsidig tape i midten av fem centimeter diameter petriskål. Legg til en prøve av genesium som har blitt isolert fra en blomsterknopp til båndet. Tilsett raskt vann til fatet til prøven er helt dekket for å unngå dehydrering.Deretter plasserer du prøven på et AFM-stadium og flytter hodet slik at det er over prøven. Etter å ha kalibrert cantilever, i programvaren, sørg for at systemet er i QI-modus, og nærmer prøven med en settpunktkraft på femten nano newtons. Deretter angir du en Z-lengde på fire mikrometer og setter skanneområdet til åtti med åtti mikron kvadrert med antall piksler satt til førti.Deretter går du til panelet for avanserte bildeinnstillinger og setter modusen til konstant hastighet. I tillegg, sett utvide angi sporhastigheter til to hundre mikrometer per sekund, og prøvefrekvensen til tjuefem kilo hertz. Når parameterne er angitt, flytter du tipset til interesseområdet i utvalget.Kontroller at området som skal skannes er fritt for rusk, finn et område som er så flatt som mulig, og delta, start deretter skanningen og bruk den raske skanningen med lav kraft til å sjekke om prøven beveger seg. Når et interesseområde er plassert, velger du et område som er førti til førti til seksti med seksti Mikron kvadrert, og øker pikselnummeret til to piksler per mikron. Deretter øker du settpunktet til fem hundre nano newtons, for å få en innrykk på hundre til to hundre nanometer.Reduser Z-lengden til to mikrometer, og forlengningshastigheten til hundre mikron per sekund, øk deretter samplingsfrekvensen til femti kilohertz, og begynn å skanne prøven. Når du er ferdig, lagrer du utdataene som både et bilde og en datafil. Åpne databehandlingsprogramvaren og last inn datafilen.Klikk på bruk dette kartet for satsvis behandling knappen for å bruke de samme parametrene på alle kurver av kartet, og deretter gå for å laste inn forhåndsdefinert prosess og velg hertz passform. Deretter går du til byttbar baselinjeoperasjon, og setter fra til forskyvning pluss tilt, og X min mellom førti og seksti prosent. Velg på glatt stramt i kategorien vertikal spissposisjon, hvis du foretrekker å arbeide med rådata.Hvis du vil velge riktig tilpasningsmodell, går du til kategorien elastisitetspass og velger ett av alternativene basert på den forventede vedheftsstyrken. Hvis det ikke finnes noen eller svak vedheft, bruker du tilnærmingskurven og foretrekker å bruke hertz-isadermodellen. Ved sterkere vedheft, bruk modellen av Dergen Milia Dortoprov eller DMD og arbeid på en retardkurve.Still nå spissen geometriske parametere basert på nominell spissform. Spissen som brukes i dette eksperimentet er en sfærisk spiss, med radius på fire hundre nanometer. Deretter angir du Poisson-forholdet til 0,5, og velger skiftkurver.Legg til en ekstra elastisitetspassrutine ved å klikke på ikonet ved hovedvinduet, og gjenta de samme parameterinnstillingene. Til slutt angir du ønsket innrykk i X min og deretter beholde og bruke på alle for å gjenta de forrige trinnene på alle kurvene på kartet. Lagre resultatene for å få et bilde i en dot tsv-fil.For å måle med raske løsningsendringer, monter en prøve i en petriskål, holder et lite stykke lim mastic. Tet raskt gapet mellom mastik og prøvebasen med biokompatibelt lim. Vent til limet stivner og senk deretter prøven i flytende apex kulturmedium, som inneholder 0,1 prosent plantebevaringsblanding.Etter kalibrering av systemet, åpne anskaffelsesprogramvaren og gå først til kontrollparametervinduet. Der satt våren konstant til cantilever produsert våren konstant eller bestemt våren konstant. Deretter setter du spissradiusen til fire hundre nanomålere, prøveprosenten til 0,5, prøvelinjen til ett hundre og tjueåtte for å sikre rask oppkjøp, skannehastigheten til 0,2 hertz og skannestørrelsen til ett mikron.Deretter går du til rampevinduet og setter rampestørrelsen til fem mikrometer, trigterskelen til maksimum, og antall prøver til fire tusen seks hundre og åtte. Med alle parametrene satt, forsiktig nærme prøven manuelt. Når sonden er relativt nær prøveoverflaten, klikker du tilnærming.Ved kontakt øker du skannestørrelsen gradvis og endrer skannehastigheten til en ønsket balanse er nådd uten å skade prøven eller spissen. Flytt skanningen hvis måleområdet ikke er som ønsket. Når du er fornøyd, klikker du på knappen, pek og skyt, for å starte pek- og opptaksvinduet.Angi en lagringskatalog og et filnavn. Klikk deretter på rampe på neste skanning for å starte opptaket. Når skanningen er fullført, vil programvaregrensesnittet omdirigere til rampevinduet.Klikk på det skannede bildet for å angi posisjonene som skal rykkes inn. Velg minst tre innrykksikter per celle i nærheten av bærsenteret, angi at den skal gjenta innrykket tre ganger per side, og klikk deretter rampe og fange. I analyseprogramvaren åpner du filen DOT MCA, viser dette posisjonen til hver kraftkurve på det skannede bildet.Deretter åpner du en kraftkurve som skal analyseres. Klikk på grunnlinjekorrigeringsknappen, og dra de blå streklinjene på kraftkurven til du utvider kildebaselinjestarten og utvider kildebaselinjestopp, eller henholdsvis 0 prosent og 80 prosent. Klikk deretter på utføre.Klikk deretter på knappen for bilfilter, og klikk på utfør for å jevne ut kraftkurven. Klikk deretter innrykkknappen. I inndatavinduet angir du den aktive kurven som skal utvides, den femte metoden til linearisert modell, maks kraft til å passe grensen til 99 prosent, min force passer grensen til 75 prosent, og tilpasningsmodellen til stivhet.Analyser kraftkurvene i en satsvis gruppe. Hvis du vil oppnå dette, klikker du kjør logg-knappen, angir rapportkatalogen og legger til andre kraftkurver som krever samme behandling. Når du er ferdig, klikker du Kjør.Når verdien for K er satsvis montert, klikker du logg og går til fem innrykk for å gå tilbake til innrykkvinduet. Når du er der, endre maksimal kraft passform grensen til ti prosent og min kraft passer grensen til en prosent. Sett deretter tilpasningsmodellen til Hertzian.Deretter åpner du den aktuelle filen for å vise de forskjellige skannede kanalene. I det høye kanalvinduet klikker du på inndelingsknappen. Dette vil tillate måling av prøveoverflate krumning som kreves for turgor trykkfradrag.Deretter tegner du en linje over den lange aksen i én celle, flytter grensene for bindestreklinjen til cellekantene og registrerer radiusverdien. Til slutt følger du med i tekstprotokollen, for å beregne den gjennomsnittlige unges modulus, vårkonstant, E, K og turgortrykket for hver celle. Bildet til venstre er et kart over de unges modulus, oppnådd ved å analysere hele innrykk opp til det brukerdefinerte kraftsettpunktet mens bildet til høyre viser resultatet av analysen av de første hundre nanometer innrykk.Her ser de to kartene svært like ut, men variasjonen av innrykkdybden kan i noen tilfeller føre til bedre å markere prøve heterogeneties, noe som kan være nyttig for å identifisere plasseringen eller for å gi informasjon om oppførselen til interne strukturer. For hvert punkt på disse kartene er det en underliggende kraftkurve. Kurven vist her, har to effekter som er verdt å nevne.Først av alt, hvis tilnærmingsdelen av kraftkurven slutter på fem hundre nano newtons. Den nedadgående spissen bevegelsen fortsetter. Det betyr at den endelige kraften spissen har brukt, er høyere enn forventet.Den andre tingen å legge merke til, er bølgen inn på tilbaketrekningskurven uthevet av ellipsen. Slik vinking kan være en indikator på prøven flytte eller vibrerende under virkningen av spissen og bytte til en annen fiksering metode kan være nødvendig. Ved hjelp av prosedyren som er dokumentert i denne artikkelen, kan alle de viktigste parametrene for et turgortrykkfradrag med unntak av celleveggtykkelse hentes fra AFM-skanninger og innrykk.Kraftkurven av dyp innrykk i Røde Kors-posisjonen beskriver celleveggens unge modulus og prøvens tilsynelatende stivhet ved ulike regimer i kurven. Prøvefiksering er avgjørende. Under måleprosessen, vær oppmerksom på tegn på prøve ustabilitet.Velg forsiktig en region med flat overflate for å sikre vinkelrett innrykk. Etter denne prosedyren kan man overvåke mekaniske egenskaper over tid og forskjellige forhold. Man kan også overlegge mekaniske målinger med konfokale bilder for korrelative studier.Denne teknikken baner vei for å knytte biomekanikk med fysiologiutvikling og andre biologiske prosesser.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetiske Field (Gmf) og Plant Evolution: Gransker effekten av Gmf Reversal på<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Utvikling og Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammer for langvarig konfokal imaging av rot og hypokotylutvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

AC confocal Live bildebehandling av skyte apikal Meristems fra forskjellige plantearter

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Utvikling av målretting indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) populasjoner i små korn avlinger av etanol Methanesulfonate mutagenese

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for å undersøke Arabidopsis thaliana Root Development på en celle type-spesifikk skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging av Microtubule Cytoskeleton og Mikromekanisk manipulering av Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...