Name: use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Vi vill tacka PLATIM team för deras tekniska stöd, liksom arezki Boudaoud och medlemmar av Biophysic teamet på RDP Lab för hjälpsamma diskussioner.

1. mått på cell Väggs mekaniska egenskaper
Anmärkning: Exempel av den framkallande gynoecium av Arabidopsis framläggas.
<ol><li>Beredning av de biologiska proverna
	<ol>
<li>Samla en sluten blomma knopp vid etapp 9 till 10 (ca 0,5 mm lång) enligt publicerade stadier bestämning för Arabidopsis4. Under en kikare, med fin pincett, öppna försiktigt knoppen för att kontrollera utvecklingsstadiet och samla in gynoecium l...

<ol>
	<li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis.">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li><li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants?.">Can mechanics control pattern formation in plants?.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li><li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth.">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis.">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li><li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+In-vivo+analysis+of+morphogenesis+in+plants.">Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants.</a> Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li><li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically,+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa.">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li><li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity,+elasticity,+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls:+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy.">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152 (2017).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+growth+of+plant+cell+walls.">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li><li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers.">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li><li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers.">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li><li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination.">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li><li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+(SNAP)+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples.">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

Uppkomsten av former i växter bestäms främst av den samordnade takten och riktningen av tillväxten under tid och rum. Växtceller är inneslutna i en styv cell vägg gjord av en polysackarid matris, som livar ihop dem. Som ett resultat, cell expansion styrs av balansen mellan saft tryck dra på cellväggen, och stelhet i cellväggen motstå detta tryck. För att förstå mekanismerna bakom utvecklingen är det viktigt att kunna mäta både mekaniska egenskaper i cellväggen och saft-tryck i olika vävnader eller cell...

Atomkraft mikroskopi (AFM) tillhör scanning sond mikroskopi (SPM) Familj, där ett tips med en radie av vanligtvis några nanometer skannar ytan av ett prov. Detektering av en yta uppnås inte via optiska eller elektronbaserade metoder, utan via interaktions krafterna mellan spetsen och prov ytan. Således är denna teknik inte begränsad till topografisk karakterisering av ett prov yta (3D-upplösning som kan gå ner till några nanometer), men också möjliggör mätning av någon typ av interaktions styrkor såsom elektrostatisk, van der Waals eller kontakt styrkor. Dessutom kan spetsen användas för att tillämpa krafter på ytan av ett biologiskt prov och mäta den resulterande deformationen, den så kallade "indrag", för att bestämma dess mekaniska egenskaper (t. ex. Youngs Modulus, viskoelastiska egenskaper).
Mekaniska egenskaper hos växternas cellväggar är viktiga att ta hänsyn till när man försöker förstå mekanismerna bakom utvecklingsprocesserna1,2,3. Faktum är att dessa egenskaper är tätt kontrollerade under utveckling, särskilt eftersom cellväggen mjukgörande krävs för att tillåta celler att växa. AFM kan användas för att mäta dessa egenskaper och studera hur de förändras mellan organ, vävnader eller utvecklingsstadier.
I detta dokument beskriver vi hur vi använder AFM för att mäta både mekaniska egenskaper i cellväggen och saft-tryck. Dessa två applikationer visas på två olika AFM Mikroskop och beskrivs här efter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:700px;" width="700">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Growth medium</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1000x vimatin stock solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">132-66-1</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 10 &#956;M. Add after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agar-agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">9002-18-0</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">agarose</td>
			<td style="width:155px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:151px;">9012-36-6</td>
			<td>used to make solid ACM, 0.8% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Arabidopsis medium</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">DU0742.0025</td>
			<td>For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">13477-34-4</td>
			<td>add to Arabidopsis medium, 2mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MURASHIGE &#38; SKOOG MEDIUM</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">M0221.0025</td>
			<td>Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N6-benzyladenine (BAP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">1214-39-7</td>
			<td>used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">oryzalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:151px;">19044-88-3</td>
			<td>for oryzalin treatement, 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">plant preservation mixture (PPM)</td>
			<td style="width:155px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">1310-58-3</td>
			<td>used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;">Duchefa Biochimie</td>
			<td style="width:151px;">57-50-1</td>
			<td>used to make ACM, 1% w/v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tools for AFM</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BioScope Catalyst BioAFM</td>
			<td style="width:155px;">Bruker</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Nanowizard III + CellHesion</td>
			<td style="width:155px;">JPK (Bruker)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>The AFM used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Patafix</td>
			<td style="width:155px;">UHU</td>
			<td style="width:151px;">D1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reference elasitic structure</td>
			<td style="width:155px;">NanoIdea</td>
			<td style="width:151px;">2Z00026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Reprorubber-Thin Pour</td>
			<td style="width:155px;">Flexbar</td>
			<td style="width:151px;">16135</td>
			<td>biocompatible glue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spherical AFM tips</td>
			<td style="width:155px;">Nanoandmore</td>
			<td style="width:151px;">SD-SPHERE-NCH-S-10</td>
			<td>Tips used for measuring mechanical properties.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues

Vi presenterar här användningen av atomkraft mikroskopi att strecksats växt vävnader och återvinna dess mekaniska egenskaper. Med hjälp av två olika Mikroskop i indrag läge, visar vi hur man mäter en elastisk Modulus och använda den för att utvärdera cell Väggs mekaniska egenskaper. Dessutom förklarar vi hur man kan utvärdera saft tryck. De viktigaste fördelarna med atomkraft mikroskopi är att det är icke-invasiv, relativt snabb (5 ~ 20 min), och att praktiskt taget alla typer av levande växtvävnad som är ytligt platt kan analyseras utan behov av behandling. Upplösningen kan vara mycket bra, beroende på spets storlek och antalet mätningar per areaenhet. En begränsning av denna metod är att den endast ger direkttillgång till det ytliga cell skiktet.

Figur 1a och figur 1b visar en skärmdump som illustrerar resultatet av stegen 1.3.4 till 1.3.6 i protokollet, som används för att lokalisera en region av intresse där att förvärva Qi kartan. Det är värt att nämna att regionen av intresse har valts för att inte vara på en lutande yta (dvs. så platt som möjligt). Faktiskt, som märkte av Routier et al.5, om indenteringen axeln inte är vinkelrä...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues at JoVE.com

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Här presenterar vi Atom kraftmikroskopi (AFM), som drivs som ett nano-och mikro-indenteringsverktyg på celler och vävnader. Instrumentet möjliggör samtidig förvärv av 3D-ytan topografi av provet och dess mekaniska egenskaper, inklusive cell Wall Youngs Modulus samt saft tryck.

Användning av atomkraft mikroskopi för att mäta mekaniska egenskaper och turgor trycket av växtceller och växt vävnader

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Mekaniska egenskaper hos växtceller är väsentliga att beaktas när man försöker förstå mekanismer underliggande utveckling. Atomkraftmikroskopi kan användas för att mäta dessa egenskaper, och följa hur de förändras, mellan organ, vävnader, alla utvecklingsstadier. De viktigaste fördelarna med denna teknik, är att det är ingen invasiv, det är relativt snabbt och det kräver inte behandling så det kan direkt appliceras på levande prover.För någon som är ny på detta förfarande, cis avsnitt av provet är verkligen kritisk, så se till att du verkligen har korrekt mekanisk fixering av provet. Visuell demonstration av detta förfarande, är avgörande för att bättre förstå krångligheter prov fixering, kvalitetskontroll av foster och mätning setup. Demonstrera förfarandet kommer att Simone Bovio, en ingenjör och Yuchen Long, en post doc i mitt laboratorium.Till att börja placera en bit dubbelsidig tejp i mitten av fem centimeter diameter petriskål. Lägg till ett prov av genesium som har isolerats från en blomknopp till bandet. Tillsätt snabbt vatten till skålen tills provet är helt täckt så att dehydrering undviks.Därefter placerar du provet på en AFM-scen och flyttar huvudet så att det är över provet. Efter att ha kalibrerat fribärande, i programvaran, se till att systemet är i QI-läge, och närma sig provet med en börskraft på femton nano newton. Därefter ställer du in en Z-längd på fyra mikrometer och ställer in skanningsområdet på åttio med åttio mikron i kvadrat med antalet pixlar som är satt till fyrtio av fyrtio.Gå sedan till den avancerade bildhanteringsinställningarpanelen och ställ in läget på konstant hastighet. Dessutom, ange förlänga ange spårhastigheter till två hundra mikrometer per sekund, och provhastigheten till tjugofem kilo hertz. När parametrarna har ställts in flyttar du spetsen till den region som är av intresse på provet.Kontrollera att området som ska skannas är fritt från skräp, lokalisera en region som är så platt som möjligt och engagera, sedan påbörja skanningen och använda den snabba låg kraft skanning för att kontrollera om provet rör sig. När ett område av intresse som varit beläget, välj en region som är fyrtio av fyrtio till sextio av sextio Micron kvadrat, och öka pixel nummer till två pixlar per mikron. Nästa, öka börsen till femhundra nano newton, för att få en indrag av ett hundra till två hundra nano meter.Minska Z-längden till två mikrometer, och förlänga in i tarmkanalen hastigheter till hundra mikrometer per sekund, sedan öka provhastigheten till femtio kilohertz, och börja skanna provet. När du är klar sparar du utdata som både en bild och en datafil. Öppna databehandlingsprogrammet och ladda datafilen.Klicka på använd denna karta för batchbearbetning knapp i syfte att använda samma parametrar på alla kurvor av kartan, sedan gå till last fördefinierade processen och välj hertz passform. Därefter går du till omkopplingsbar baslinjedrift, och ställ in subtrahera till offset plus tilt, och X min mellan fyrtio och sextio procent. På fliken vertikala spetsposition, välj på släta tätt, om du föredrar att arbeta på rådata.Om du vill välja lämplig passningsmodell går du till fliken för elasticitetspassning och väljer ett av alternativen baserat på den förväntade vidhäftningsstyrkan. Om ingen eller svag vidhäftning är närvarande, sedan använda inflygningskurvan och föredrar att använda modellen hertz isnader. Vid starkare vidhäftning, använd modellen av Dergen Milia Dortoprov eller DMD och arbeta på en retardkurva.Ställ nu in spetsgeometriska parametrar baserat på nominell spetsform. Spetsen som används i detta experiment är en sfärisk spets, med radien av fyra hundra nano meter. Därefter ställer du in Poisson-förhållandet till 0,5, och väljer skiftkurvor.Lägg till en andra elasticitet passar rutin, genom att klicka på ikonen av huvudfönstret, och upprepa samma parameter inställningar. Ange slutligen önskad indrag i X min sedan hålla och gälla för alla att iterera föregående steg på alla kurvor av kartan. Spara resultaten för att få en bild i en dot tsv-fil.För att mäta med snabba lösningsbyten, montera ett prov i en petriskål, som håller en liten bit av lim mastix. Snabbt täta gapet mellan mastix och provbasen med biokompatibla lim. Vänta på att limmet stelnar och sedan dränka provet i flytande spets odlingsmedium, som innehåller 0,1 procent växt bevarande blandning.Efter att ha kalibrerat systemet, öppna förvärvsprogramvaran och gå först till checkparameterfönstret. Där ställa fjäderkonstanten till cantilever's tillverkade fjäderkonstanten eller den beslutsamma fjäderkonstanten. Därefter ställer du in spetsradien på fyrahundra nanomätare, urvals poisson-förhållandet till 0,5, provlinjen till etthundratjugoåtton för att säkerställa snabb förvärv, skanningshastigheten till 0,2 hertz och skanningsstorleken till en mikron.Gå sedan till rampfönstret och ställ in rampstorleken på fem mikrometer, trigtröskeln till maximum och antalet prover till fyra tusen sexhundraåtta. Med alla de parametrar som ställts in, närma sig noggrant provet manuellt. När sonden är relativt nära provytan klickar du på tillvägagångssätt.Vid kontakt, gradvis öka skanningsstorlek och ändra skanningshastigheten, tills en önskad balans nås utan att skada provet eller spetsen. Flytta skanningen om mätregionen inte är som önskat. När nöjd, klicka på knappen, peka och skjuta, för att inleda punkt och skjuta fönster.Ange en sparkatalog, och ett filnamn. Klicka sedan på ramp på nästa skanning för att initiera inspelning. När genomsökningen är klar kommer programvarugränssnittet att omdirigera till rampfönstret.Klicka på den skannade bilden för att ange de positioner som ska dras in. Välj minst tre indragssikten per cell nära det är bärcentrum, ställ in den för att upprepa indraget tre gånger per sida och klicka sedan på ramp och fånga. I analysprogramvaran, öppna filen dot MCA, detta visar positionen för varje kraftkurva på den skannade bilden.Öppna sedan en kraftkurva som ska analyseras. Klicka på korrigeringsknappen för baslinjen och dra de blå strecklinjerna på kraftkurvan, tills den förlänger källbaslinjens start och utökar källbaslinjestoppet eller vid 0 respektive 80 procent. Klicka sedan på execute.Klicka nästa på knappen box bil filter, och klicka exekvera för att jämna ut kraftkurvan. Klicka sedan på indragsknappen. I inmatningsfönstret, ange aktiv kurvan att förlänga, den femte metoden till linjära modellen, max kraft passar gränsen till 99 procent, min kraft passar gränsen till 75 procent, och passar modellen till styvhet.Analysera kraftkurvorna i en sats. Du åstadkommer detta genom att klicka på knappen för körhistorik, ange rapportkatalog och lägga till andra kraftkurvor som kräver samma behandling. När du är klar klickar du på kör.När värdet för K är batch monterat klickar du på historik och går till fem indrag för att återgå till indenteringsfönstret. Väl där, ändra max kraft passar gränsen till tio procent och min kraft passar gränsen till en procent. Ställ sedan in passningsmodellen på Hertzian.Öppna därefter lämplig fil för att visa de olika skannade kanalerna. I fönstret med hög kanal klickar du på sektionsknappen. Detta kommer att möjliggöra mätning av provytan krökning som krävs för turgor tryckavdrag.Rita sedan en linje över den långa axeln i en cell, flytta strecklinjens gränser till cellkanterna och registrera radievärdet. Slutligen följa med i textprotokollet, för att beräkna medelvärdet youngs modulus, våren konstant, E, K, och turgor trycket för varje cell. Bilden till vänster är en karta över de ungas modulus, erhållen genom att analysera hela indraget upp till användaren definierade kraft börpunkt medan bilden till höger, visar resultatet av analysen av de första hundra nano meter indrag.Här ser de två kartorna mycket lika dock variationen av indragsdjupet leda i vissa fall till bättre markera prov heterogeneties, vilket kan vara till hjälp för att identifiera platsen eller för att ge information om beteendet hos interna strukturer. För varje punkt på dessa kartor finns det en underliggande kraftkurva. Kurvan som visas här, har två effekter som är värda att nämna.Först och främst, om tillvägagångssättet del av kraft kurvan slutar vid fem hundra nano newton. Den nedåtgående spetsen rörelsen håller på att gå. Vilket innebär att den slutliga kraft som tillämpas av spetsen är högre än väntat.Den andra sak att märka, är vågen i på indragningskurvan markeras av ellipsen. Sådan vinka kan vara en indikator på prov rörliga eller vibrerande under verkan av spetsen och byta till en annan fixeringsmetod kan krävas. Med hjälp av förfarandet dokumenteras i den här artikeln kan alla de viktigaste parametrarna för en turgor tryckavdrag med undantag för cellvägg tjocklek hämtas från AFM-skanningar och indrag.Kraftkurvan för djup inbuktning vid röda korsets läge beskriver cellväggen Youngs modulus och provets skenbara styvhet vid olika regimer i kurvan. Provfixering är avgörande. Under mätprocessen, var uppmärksam på tecken på prov instabilitet.Välj försiktigt en region med plan yta för att säkerställa vinkelrät indrag. Efter denna procedur kan man övervaka mekaniska egenskaper över tid och olika förhållanden. Man kan också överlagra mekaniska mätningar med confocal bilder för korrelativa studier.Denna teknik banar väg för att koppla samman biomekanik med fysiologiutveckling och andra biologiska processer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field (Gmf) och växt Evolution: att undersöka effekterna av Gmf Återföring på<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Utveckling och Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammare för långsiktig konfokalbildning av rot- och hypokotylutveckling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hela-mount Clearing och färgning av Arabidopsis blomma organ och Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Confocal levande avbildning av skjuta Apical Meristems från olika växtarter

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Utveckling av riktade inducerade lokala lesioner i genomer (TILLING) populationer i små spannmålsgrödor med Etylmetanesulfonatmuta Genes

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Översätta Ribosom Affinity Rening (TRAP) för att undersöka Arabidopsis thaliana Root Development på en celltyp-specifik skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Cell Imaging av Microtubule Cytoskelett och mikromekanisk manipulation av den Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...