Name: delivery of antibodies into the murine brain via convection-enhanced delivery
Uploaded: 2019-07-18T13:00:00
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この研究は、チューリッヒ大学(FK-15-057)、ノバルティス医学生物学財団(16C231)、スイス癌研究(KFS-3852-02-2016、KFS-4146-02-2017)のヨハネス・ヴォーム・ベルクとBRIDGEの実証概念(2017)の助成金によって支援されました。_177300) リンダ・シェルハンマー

ここに記載されているすべての方法は、ライセンス番号ZH246/15の下でスイス州獣医局によって承認されています。
ステップカテーテルの準備
<ol><li>カテーテルの工程のための融合シリカチューブの調製
	<ol>
<li>内径0.1mm、壁厚0.0325mmの融合シリカキャピラリーを30mmの長さに切ります。</li>
		<li>チューブにひび割れがないか調べ、マイクロフォージを使用して?...

<ol>
	<li>Scherrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+via+the+blood-brain+barrier.">Drug delivery via the blood-brain barrier.</a> Vascular Pharmacology. 38 (6), 349-354 (2002).</li><li>Barua, N. U., Gill, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+drug+delivery:+prospects+for+glioblastoma+treatment.">Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment.</a> CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-flow+microinfusion:+tissue+penetration+and+pharmacodynamics.">High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics.</a> American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).</li><li>Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastriatal+convection-enhanced+delivery+results+in+widespread+perivascular+distribution+in+a+pre-clinical+model.">Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).</li><li>Shoji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+convection-enhanced+delivery+of+an+anti-CD40+agonistic+monoclonal+antibody+induces+antitumor+effects+in+mouse+glioma+models.">Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models.</a> Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).</li><li>Souweidane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma:+a+single-centre,+dose-escalation,+phase+1+trial.">Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial.</a> The Lancet Oncology. , (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+immune+checkpoints+in+malignant+glioma.">Targeting immune checkpoints in malignant glioma.</a> Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).</li><li>Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+drug+delivery+to+the+brain:+therapeutic+potential+and+neuropathological+considerations.">Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations.</a> Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).</li><li>Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-Enhanced+Delivery.">Convection-Enhanced Delivery.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 358-371 (2017).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Nash, K. R., Gordon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection+Enhanced+Delivery+of+Recombinant+Adeno-associated+Virus+into+the+Mouse+Brain.">Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).</li><li>Ohlfest, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+antiangiogenic+gene+therapy+by+nonviral+gene+transfer+using+the+sleeping+beauty+transposon+causes+tumor+regression+and+improves+survival+in+mice+bearing+intracranial+human+glioblastoma.">Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma.</a> Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).</li><li>Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cannula+design+and+placement+for+convection-enhanced+delivery+in+rat+striatum.">Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).</li><li>Mamot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+distribution+of+liposomes+in+rodent+brains+and+brain+tumors+following+convection-enhanced+delivery.">Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery.</a> Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).</li><li>Saito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+affinity+of+the+infusate+affects+the+distribution+volume+during+convection-enhanced+delivery+into+rodent+brains:+implications+for+local+drug+delivery.">Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).</li><li>Oh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+distribution+of+small+molecules+and+viral+vectors+in+the+murine+brain+using+a+hollow+fiber+catheter.">Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).</li><li>Barua, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+implantable+catheter+system+with+transcutaneous+port+for+intermittent+convection-enhanced+delivery+of+carboplatin+for+recurrent+glioblastoma.">A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma.</a> Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).</li><li>Rosenbluth, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+an+in-dwelling+cannula+for+convection-enhanced+delivery.">Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).</li><li>Debinski, W., Tatter, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+for+the+treatment+of+brain+tumors.">Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors.</a> Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).</li><li>MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+in+brain+of+liposomes+after+convection+enhanced+delivery;+modulation+by+particle+charge,+particle+diameter,+and+presence+of+steric+coating.">Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating.</a> Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).</li><li>Chen, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+realistic+brain+tissue+phantom+for+intraparenchymal+infusion+studies.">A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies.</a> Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).</li><li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+drug+distribution+as+a+possible+explanation+for+the+results+of+the+PRECISE+trial.">Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial.</a> Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).</li><li>Wick, W., Weller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabedersen+to+target+transforming+growth+factor-beta:+when+the+journey+is+not+the+reward,+in+reference+to+Bogdahn+et+al.+(Neuro-Oncology+2011;13:132-142).">Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142).</a> Neuro-Oncology. 13 (5), 559-560 (2011).</li><li>Saito, R., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+therapeutics+for+malignant+gliomas.">Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas.</a> Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).</li><li>Bedussi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+from+the+mouse+brain+by+convection+of+interstitial+fluid+towards+the+ventricular+system.">Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).</li><li>Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+glioblastoma:+a+systematic+review.">Hallmarks of glioblastoma: a systematic review.</a> ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).</li><li>Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+pressure+in+intracranial+tumours+in+patients+and+in+rodents.">Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents.</a> British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).</li><li>Glushakova, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+clinical+biomarkers+of+caspase-mediated+apoptosis+associated+with+neuronal+and+neurovascular+damage+following+stroke+and+other+severe+brain+injuries:+Implications+for+chronic+neurodegeneration.">Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration.</a> Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).</li><li>Vom Berg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IL-12/IL-23+signaling+reduces+Alzheimer's+disease-like+pathology+and+cognitive+decline.">Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline.</a> Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).</li><li>Vom Berg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+IL-12+combined+with+CTLA-4+blockade+elicits+T+cell-mediated+glioma+rejection.">Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).</li><li>Kurdi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+administration+of+the+mTORC1+inhibitor+everolimus+induces+tolerance+and+decreases+autophagy+in+mice.">Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).</li></ol>

対流増強送達、または脳への圧力媒介薬物注入は、1990年初頭に最初に提案された3.このアプローチは、制御された方法で血液脳関門の背後にある大きな脳体の灌流を約束します2.しかし、これまでのところ、このアプローチを用いて行われた臨床試験はごくわずかであり、一部は臨床セットアップにおけるCEDが技術的に要求が厳しい24、25<...

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)と血液循環を分離する半透過性境界を形成する。しかし、治療薬でCNSに到達することは、脳腫瘍、アルツハイマー病(AD)またはパーキンソン病(PD)などの様々な疾患の文脈において必要である1。これは、新しい治療法の開発において重要になり、特に試験された薬物がBBB透過性が悪い場合またはその全身暴露が危険な毒性1、2につながる可能性がある場合。臨床的に使用される抗体のいくつかは、これらの特徴の両方を表示する。この問題の解決策は、BBBの真後ろに治療薬を提供することです。
対流増強送達(CED)は、大きな脳容積の効果的な灌流を可能にする神経外科技術である。これは、1つ以上のカテーテルを対象領域に外科的に取り付けることによって達成される。薬物塗布中に、カテーテルの開口部に圧力勾配が形成され、これは組織3、4におけるインフューサテ分散の駆動力となる。したがって、灌流範囲2、4、5を決定する拡散係数ではなく、注入の持続時間です。これは、従来と比較してはるかに大きな脳容積にわたってインフュージョンの均一な送達を提供し、脳内注射法2,6に基づく拡散を行う。同時に、この配信モダリティは、組織損傷2のリスクが低い。したがって、CEDは、CNS腫瘍の治療のための従来の化学療法薬の安全かつ有効な投与を可能にするだけでなく、他のCNS障害の多数における免疫調節剤またはアゴニストおよび拮抗抗体の送達を可能にする2 、7,8,9.CEDは現在、パーキンソン病、アルツハイマー病、ならびに高品位の神経膠腫2、7、8、10、11の治療で試験されている。
カテーテルの設計および注入のレジメンはCED 10、12、13、14、15、16の結果に影響を与える最も重要な要因の1つである。 さらに、それは、粒子の適度なサイズ、アニオン電荷、および低組織親和性10、17を含む、インフューザーの特定の物理化学的特性を必要とする。これらのパラメータのそれぞれは、標的にされる脳領域の組織学的特徴に従って潜在的に調整されなければならない 2,10,17.
ここでは、マウスのコーデートプタメン(線条体)に抗体溶液のCEDを行うための方法論について説明する。さらに、プロトコルは実験室のセットアップのステップカテーテルの準備を含み、インビトロでそれらをテストし、CEDを行う。
カニューレの形状、使用される材料、カテーテルの開口部の数によって異なる複数のカテーテルの設計があり、12、15、18、19、20 、21、22。鈍い端の金属の針から1mm突出した融合シリカキャピラリー製のステップカテーテルを使用しています。このカテーテルの設計は実験室で容易に製造することができ、生体内の脳のパレンキマに似た物理的なパラメータを持つアガロースブロックとインビトロでテストされると、良好なCED結果を生み出すことができます。
さらに、生体内で5μLのインフューサトを送送るためのランピングレジメンを実装しています。このようなプロトコルでは、射出速度が0.2 μL/minから最大0.8 μL/minに増加し、カテーテルに沿った逆流の可能性と組織損傷のリスクを最小限に抑えます16。このプロトコルを用いて、11分30秒の間にPBSの5μLで最大20 μgの抗体を有するマウスを正常に投与した。
プロトコルは、他の注入量のために容易に調整することができるか、または様々な他の物質、例えば、化学療法、サイトカイン、ウイルス粒子またはリポソーム2、10、14、18を注入する、22.抗体のリン酸緩衝生理食べ物(PBS)または人工脳脊髄液(aCSF)溶液と比較して、大幅に異なる物理化学的特性を有するインフュー酸塩を使用する場合は、追加の検証ステップが推奨されます。カテーテルアセンブリ、検証およびCEDのために、我々は通常の立体フレームに取付けられるドリルおよび注入の単位が付いている立体ロボットを使用してすべてのステップを記述する。この手順はまた、記載されたガラスマイクロシリンジを駆動することができるプログラム可能なマイクロ注入ポンプに接続された手動定位フレームで行うことができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G blunt end needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Janssen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1029754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior Schweiz AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Pfizer AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill bits, steel, size ISO 009</td>
			<td>Hager &#38; Meisinger</td>
			<td>1RF009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Reuss-Chemie AG</td>
			<td>179-VL03K-/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Helvepharm AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran, 2000 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Labatec Pharma AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High viscosity cyanoacrylate glue</td>
			<td>Migros</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidin</td>
			<td>Orion Pharma AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Roche Pharma AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Bausch + Lomb</td>
			<td>Vitamin A Blache</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm</td>
			<td>Postnova</td>
			<td>Z-FSS-100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame for mice</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic robot</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td>Drill and Injection Robot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical tissue adhesive</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>GLUture</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Bichsel</td>
			<td>1000004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of antibodies into the murine brain via convection-enhanced delivery

対流増強送達(CED)は、カテーテルシステムを使用して大きな脳容積の効果的な灌流を可能にする神経外科技術である。このようなアプローチは、血液脳関門(BBB)を通過して安全な送達方法を提供し、従って、毒性による全身暴露が望ましくない治療を可能にする。CEDは、カテーテルの設計、注入プロトコル、およびインフューサートの特性の最適化を必要とします。このプロトコルでは、マウスのコーデートプタメンに最大20 μgの抗体を含む溶液のCEDを実行する方法を説明する。ステップカテーテルの調製、インビトロでの試験、ランピング注射プログラムを用いたマウスでのCEDの実行について説明します。プロトコルは、他の注入量のために容易に調整することができ、化学療法、サイトカイン、ウイルス粒子、およびリポソームを含む様々なトレーサーまたは薬理学的に活性または不活性な物質を注入するために使用することができます。

このプロトコルは実験室の環境のCEDプロシージャの使用のためのステップカテーテル(図1)の準備を可能にする。漏れ、針路に沿って逆流、詰まりのためのカテーテルを制御するために、我々は、例えば、トリパンブルー溶液、アガロースブロックに染料の注射を行うことをお勧めします。図3は、CEDカテーテルを用いて0.5μL/分で1μLの注入後のトリ?...

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Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

対流増強送達(CED)は、大きな組織体積を直接灌流することにより、脳への治療薬の効果的な送達を可能にする方法である。プロシージャはカテーテルおよび最大限に活用された注入プロシージャの使用を要求する。このプロトコルは、マウス脳に抗体のCEDのための方法論を説明する。

対流強化送達によるマウス脳への抗体の送達

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

このプロトコルは、標的脳領域の調節可能な均一灌流のためのステップカテーテルシステムを使用して小さなげっ歯類で対流強化送達を行うために使用することができる。対流強化送達の利点は、組織の損傷や逆流をほとんど伴わない血液脳関門を迂回して、関心領域への物質の送達を可能にすることです。この技術は、主に抗体などの治療物質を脳に送達するのに有用である。したがって、多くの神経学的状態を標的にするために使用することができる。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるミハル・ベフフィンガーです。まず、内径0.1ミリメートル、壁厚0.325ミリメートルの長さ30ミリメートルの融合シリカキャピラリーチューブを切断します。亀裂のためのチューブを調べた後、チューブ開口部が滑らかな表面を持っていることを確認するために、端部を加熱するためにマイクロフォージを使用しています。次に、27ゲージの針を10マイクロリットルのシリンジに取り付け、シリンジを立体性ロボットに入れる。ロボットを使用して、硬い表面上に注射器を移動し、針の先端で表面に触れます。この位置に目を通した後、針の中に20ミリメートルの毛細血管が突き出るように針の中に融合したシリカ毛細血管を配置できるように針を上昇させる。ピペットを使用して、金属針から始まり、毛細血管の下端から10ミリメートル上に仕上げる毛細血管の上に高粘度シアノアクリル酸接着剤の2マイクロリットルを均等に広げます。金属針の先端から1ミリメートルのステップを形成する金属針に融合したシリカ毛細血管を固定するために、針の先端が参照面の上に1ミリメートルになるまで、金属針を下げる立体戦術ロボットを使用します。カテーテルステップの植え付けを避けるために、金属針の端に形成される余分な接着剤を除去します。顕微鏡の下の先端を確認して、余分な接着剤がすべて取り除かれたことを確認します。その後、接着剤が硬化し、ロボットからカテーテルで注射器を取り除くのを15分待ちます。ステップカテーテル試験のために切断された0.6%アガロースゲルを20 20ミリメートルブロックに固め、手動で濾過された0.4%トリパンブルー溶液の10マイクロリットルでステップカテーテルシリンジを充填します。定位ロボットを使用して、1分間に0.2マイクロリットルで1マイクロリットルの色素を分配し、固定手順中にカテーテルのステップのシールを評価します。トリパンブルーの溶液は、カテーテルの先端にのみ見えるはずです。紙のティッシュで染料を拭き取り、立体戦術ロボットにアガロースブロックを置きます。ロボットの較正は、カテーテルの先端がアガロースブロックの表面に対して参照されると述べた。特定の実験計画に従って、射出量の割合の系列を設定します。この溶液をマウスケーデートプタメンに注入するには、注射を3.5ミリメートルの深さでブレグマ位置から1ミリメートル前頭および1ミリメートルから2ミリメートルの側面にセットする。針が位置にあるときに対流強化配信手順を開始し、アガロースブロックにトリパンブルー溶液の5マイクロリットルを注入します。アガロースのトリパンブルー雲の形状とカテーテル管に沿った漏れの可能性を評価します。金属針の先端に大きな逆流は見えないはずです。注射後、カテーテルを2分間所定の位置に置き、針を1分あたり1ミリメートルで引き込み、取り外し中に脳への液体の適切な分散と注射管のシールを確実にする。ロボットに新しいアガロースブロックを入れ、1マイクロリットルの2回目の注射を毎分0.2マイクロリットルで開始し、アガロース内のカテーテルの詰まりを評価します。トリパンブルーは、注射開始直後にカテーテルの先端から再び雲を形成する必要があります。次に、シリンジの残り量が3マイクロリットルに対応しているかどうかを評価し、任意のバリエーションがカテーテル取り付けまたはシリンジプランジャーを通して流体の漏れを示す可能性があります。マウスの線条体への抗体注射のために麻酔マウスの皮膚ピンチに対する応答の欠如を確認し、ヘアトリマーで頭を剃る。ヨウ素溶液に浸した綿棒で皮膚を消毒します。メスを使用して、目の高さで頭蓋中線仕上げに沿って10ミリメートルの皮膚切開を行います。鼻クランプとイヤーバーを使用して、マウスを立体フレームに固定し、頭蓋骨の表面が水平でしっかりと固定されていることを確認します。シリンジを立体性ロボットに入れ、ドリルビットを基準点のカテーテル先端と同期させます。鉗子を使用して皮膚を引き込み、頭蓋骨表面のブレグマを局地化します。ドリルビットの先端を使用してソフトウェア内のブレグマを参照し、ブレグマ位置から1ミリメートルの正面と2ミリメートルの側面にドリルを移動します。硬膜を損傷しないようにバリ穴を開け、バリ穴の上に注射器を移動します。0.5~1マイクロリットルのシリンジを塗布し、カテーテルに気泡が残らないようにします。示されているように対流の強化された送達を開始し、注入スポットからの流体逆流の痕跡について頭蓋骨表面を観察します。送達およびカテーテル除去の終わりに注入ポンプは、注射の間にカテーテルが詰まる証拠を確認するために毎分0.2マイクロリットルで開始する。詰まりが発生しなかった場合は、注射液の滴は、カテーテル先端から来てすぐに観察されるべきである。示されているように、対流強化カテーテルを使用して1分間に0.5マイクロリットルで1マイクロリットルの色素を注入した後に形成されるトリパンブルーの雲のこの画像では、針路に沿った逆流はカテーテルステップの開始時に見えませんでした。そして分散した雲は所望の球形を形成した。しかし、鈍い端針を用いたこの画像では、有意な逆流が観察された。特に、対流強化送達は、従来の注射に比べて均一かつ少ない組織損傷様式でマウス脳への大量の灌流を可能にする。どちらのタイプの送達でも、脳梁の上に抗体およびデキストラン粒子の典型的な分布プロファイルがある。しかしながら、注入された抗体の分散プロファイルは、対流強化送達後の高分子量デキストランに対して観察されるよりも拡散し、異なる注入物間の分布の相違を例示する。カテーテルは脳の注入中に詰まらせる可能性がありますので、少量の注入物をゆっくりと分配することによって、すぐにそれをチェックすることが重要です。この手順は、脳に薬理学的に活性な化合物を提供する方法として役立つ可能性があり、病気の症状と期待される副作用の綿密な監視に続く必要があります。.この技術は、抗体を含む治療薬を用いた正確な脳領域の注入を可能にし、中枢神経系標的療法の開発に新たな可能性を開く。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

ミニ浸透圧の移植は、病態生理学的状態で脳の再編成を検討するためにポンプ冊子トレーサーの配達

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

CNSへの標的化物質送達のためのマウス顕微注入法<i&gt;経由で</i&gt;内頸動脈

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...