Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

Vi takker DRs. Christopher Moraes og Stephen A. Morin for deres støtte til indretningen design og fabrikation. Denne undersøgelse blev støttet af Bioengineering for human Health Grant fra University of Nebraska-Lincoln (UNL) og University of Nebraska Medical Center (UNMC), og Grant AR070242 fra NIH/NIAMS. Vi takker Janice A. Taylor og James R. Talaska fra Advanced Micro scopy Core Facility på University of Nebraska Medical Center for at yde assistance med confokal mikroskopi.

Bemærk: bær personlige værnemidler (PPE) såsom handsker og lab coat for hvert trin i denne protokol.
1. Master skimmel fabrikation
Bemærk: Udfør trin 1,1-1,3 i en stinkhætte.
<ol><li>Glas behandling Bemærk: bær et ansigts skjold, handsker og en laboratorie frakke til trin 1,1.<ol>
<li>Opløsningen af Piranha (60 mL) blandes ved at blande svovlsyre (H2so4) og hydrogenperoxid (h2O2) med et volumen forhold på 3...

<ol>
	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+meet+cell+biology:+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays.">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Carde&#241;a, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation.">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li><li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays.">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression.">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).</li><li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro.">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li><li>M&#233;nard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate.">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li><li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force.">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li><li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings.">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li><li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation.">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li><li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading.">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li><li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression.">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li><li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth.">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li><li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsil&#228;, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes:+A+study+in+rabbits.">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li><li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression.">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li><li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth:+implications+for+scoliosis+progression.">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li><li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix.">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li><li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization.">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li><li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading.">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li><li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction.">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li><li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

For at teste effekten af tryk belastning på vækstpladen chondrocytter, udviklede vi mikrofluidisk af kompressionsanordning (figur 1) for at anvende forskellige niveauer af kompressions stress til chondrocytter i alginat hydrogel stilladset for 3D kultur i høj kapacitet. For at hjælpe andre forskere til at vedtage vores enhed eller til at udvikle lignende enheder, vi leverede oplysninger om indretningen fabrikation trin i denne protokol artikel.
De afgørende s...

Mikrokonstruerede platforme er værdifulde værktøjer til at studere Molekylær, cellulær og vævsniveau biologi, fordi de muliggør dynamisk kontrol af både de fysiske og kemiske mikromiljøer1,2,3 ,4,5,6,7,8. Således kan flere hypoteser testes samtidigt på en stramt kontrolleret måde. I tilfælde af vækst plade brusk, der er stigende beviser for en vigtig rolle i trykkende stress i modulering knoglevækst gennem handling på vækstpladen brusk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men virkningsmekanismen af kompressions stress-især, hvordan stress guider dannelsen af af kolonner i vækstpladen-er dårligt forstået.
Formålet med denne protokol er at skabe en pneumatisk aktuerende mikrofluidisk af kompressionsanordning26 for at belyse mekanismerne for mekanismebiologi i vækstpladen chondrocytter (figur 1a-c). Anordningen består af to dele: den pneumatiske aktuerings enhed og alginatgel konstruktionen. Den mikrofluidiske pneumatiske aktuerings enhed er fremstillet ved hjælp af Polydimethylsiloxan (PDMS) baseret på foto-og Soft-litografi. Denne enhed indeholder en 5 x 5 array af tynde PDMS membran balloner, som kan oppustet forskelligt baseret på deres diametre. Alginat gel konstruktionen består af chondrocytter indlejret i en 5 x 5 matrix af alginat gel cylindre, og hele alginat-chondrocyte konstruktioner samles med aktuerings enheden. Alginat gel-konstrukterne komprimeres af de pneumatisk oppustet PDMS-balloner (figur 1b). Den mikrofluidisk enhed kan generere fem forskellige niveauer af tryk belastning samtidigt i en enkelt platform baseret på forskelle i PDMS ballon diameter. Således er en høj gennemløb test af af mechanobiology under flere kompressionsforhold muligt.
Den mikrofluidisk-enhed, der er beskrevet i denne protokol, har mange fordele i forhold til den konventionelle kompressionsanordning, såsom eksterne fixatorer14,21,23 og makroskopiske kompressions anordninger16, 19 , 27 , 28 for at studere af mechanobiology: 1) er den mikrofluidiske enhed omkostningseffektiv, fordi den bruger mindre mængder af prøver end den makroskopiske kompressionsanordning, 2) den mikrofluidiske enhed er tidseffektiv, fordi den kan teste flere kompressionsforhold samtidigt, 3) den mikrofluidisk enhed kan kombinere mekaniske og kemiske stimuli ved at danne en koncentration gradient af kemikalier baseret på den begrænsede blanding i mikrokanaler, og 4) forskellige mikroskopi teknikker (time-lapse mikroskopi og fluorescens Konfokal mikroskopi) kan anvendes med den mikrofluidisk enhed lavet af gennemsigtige PDMS.
Vi har vedtaget og modificeret metoden til Moraes et al.7,29 at skabe forskellige trykkende stress niveauer i en enkelt enhed for at muliggøre High-gennemløb mechanobiology undersøgelser af af kompression. Vores tilgang er passende for celler (f. eks. chondrocytter), som har brug for tredimensionale (3D) kultur miljø og for biologiske assays efter komprimering af celler. Selv om nogle mikrofluidiske celle kompressions anordninger kan komprimere celler, der dyrkes på to-dimensionelle (2D) substrater30,31,32, kan de ikke bruges til chondrocytter, fordi 2D-dyrkede chondrocytter dedifferentiere. Der er mikrofluidiske platforme til komprimering af 3D-dyrkede celler i photopolymerized silicagelrogeler7,33, men de er begrænsede i isolerende celler efter komprimering eksperimenter, fordi isolerende celler fra photopolymeriseret hydrogel er ikke let. Desuden, virkningerne af ultraviolet (UV) eksponering og foto binding initiatorer på celler kan være nødvendigt at blive evalueret. I modsætning hertil tillader vores metode hurtig isolering af celler efter kompression eksperimenter for post biologiske assays, fordi alginat silicagelrogeler kan depolymeriseres hurtigt af calciumchelatorer. Den detaljerede anordning fabrikation og karakterisering metoder er beskrevet i denne protokol. I figur 2vises en kort procedure for opdigte af mikrofluidisk af kompressionsanordning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

Mekaniske stimuli er kendt for at moduere biologiske funktioner af celler og væv. Nylige undersøgelser har antydet, at trykkende stress ændrer vækst plade brusk arkitektur og resulterer i vækst graduering af lange knogler af børn. For at bestemme rollen for trykbærende stress i knoglevækst, skabte vi en mikrofluidisk-enhed, der aktiveres af pneumatisk tryk, til dynamisk (eller statisk) komprimering af vækstpladen chondrocytter indlejret i alginat hydrogel cylindre. I denne artikel beskriver vi detaljerede metoder til opdigte og karakterisering af denne enhed. Fordelene ved vores protokol er: 1) fem forskellige størrelser af kompressions stress kan genereres på fem tekniske replikater i en enkelt platform, 2) det er nemt at visualisere celle morfologi via et konventionelt lys mikroskop, 3) celler kan hurtigt isoleres fra enheden efter komprimering for at lette downstream-assays, og 4) platformen kan anvendes til at studere mechanobiologi af enhver celletype, der kan vokse i hydrogels.

Denne artikel viser detaljerede trin af mikrofluidic af kompressionsanordning fabrikation (figur 2). Enheden indeholder en 5 x 5 arrays af cylindrisk alginat-chondrocyte konstruktioner, og disse konstruktioner kan komprimeres med fem forskellige størrelser af kompression (figur 1, figur 3 og figur 4). Højden af den pneumatiske mikrokanal er omkring 90 μm, og PDMS ballon diametre er henholdsvis 1,2, 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Denne artikel indeholder detaljerede metoder til at fabrikere og karakterisere en pneumatisk aktivering mikrofluidisk enhed til af kompression.

En Microfluidic platform til stimulering af chondrocytter med dynamisk kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Denne pneumatisk aktiveret mikrofluidisk kompressionsenhed kan bruges til at studere mekanobiologi i 3D hydrogelkulturer af vækstpladechondrocytter. Den mikrofluidiske enhed er omkostningseffektiv og tidseffektiv, fordi den samtidig kan generere flere størrelser af en komprimering på små mængder prøver, og forskellige mikroskopiske billedbilleder kan anvendes med enheden. Vores metode kan også anvendes til undersøgelse af mekanobiologi af andre celletyper.For at opsætte mikrokanallaget blandes PDMS med et vægtforhold på 10 præpolymerer til et hærdningsmiddel i fem minutter. Næste sted formen på en skum pad og hæld blandingen i master mold. Degas PDMS i et vakuumkammer i 30 minutter og sandwich de afgasset PDMS med et stykke gennemsigtighed film.Fastspænd den klemt fast med glasplade, skumpuder og plexiglasplader. Cure PDMS ved 80 grader Celsius i seks timer og isolere PDMS lag og gennemsigtighed film fra klemt struktur. Aktiver overfladen af PDMS og en ren glasplade med plasmarenseren i et minut, før PDMS bindes på glaspladen i 80 graders Celsius-ovnen i 30 minutter.Fjern derefter gennemsigtighedsfilmen. Til fremstilling af den tynde PDMS-membran drejes coaten uhærdet PDMS på en gennemsigtighedsfilm ved 1.000 rotationer i minuttet i et minut for at opnå et 60 mikrometer tykt PDMS-lag. Delvist hærde spinbelagt PDMS ved 80 grader Celsius i 20 til 30 minutter, før du bruger plasmarenseren til at aktivere mikrokanal-PDMS-laget på glaspladen og det tynde PDMS-lag i et minut.Lim derefter det tynde PDMS membranlag på mikrokanalens PDMS-lag og læg lagene i 80-graders Celsius-ovnen natten over. Til fremstilling af slangeblok anbringes metalrør lodret på en petriskål, og der hældes forsigtigt uhærdede PDMS i skålen, indtil ca. 3/4 af rørene er nedsænket. Efter afgasning af PDMS i et vakuumkammer i 30 minutter, helbrede PDMS i ovnen ved 60 grader Celsius i mere end seks timer.I slutningen af hærdningsprocessen skæres et stykke PDMS-blok, der indeholder et rør, og der slås et hul i det tynde PDMS-lag til indløbet. Aktivér PDMS-blokken og det tynde PDMS-lag med plasmarenseren. Efter et minut fastgøres PDMS-blokken til indløbshullet i det tynde PDMS-lag, og hele aktiveringsenheden i ovnen sættes i ovnen ved 80 grader Celsius natten over.For agarose gel skimmel forberedelse, bland 5% agarose og 200 millimolar calciumchlorid i deioniseret vand og varme agarose gel opløsning indtil kogning. Hæld den kogte agarose gel opløsning i en aluminium skimmel og sandwich formen med glaspladen. Efter fem minutter skal du fjerne den størknede agarosegel fra aluminiumsformen.Plade 150 mikroliter af alginat-chondrocyt opløsning på den aminossilaniserede glasplade og dække opløsningen med agarose gel skimmel i tre minutter. Ved slutningen af inkubationen skal du bruge et barberblad til at fjerne den overdrevne alginatgelopløsning og fjerne agarosegelformen fra pladen. Derefter sættes alginat-chondrocytkonstruktionerne i krydsbindingsopløsning indeholdende 50 millimolar calciumchlorid og 140 millimolar natriumchlorid i deioniseret vand i et minut.For at samle enheden skal du finde fire en millimeter tykke PDMS-afstandsanordninger på de fire hjørner af det tynde PDMS-lag i aktiveringsenheden. Dæk luftkamrene i det tynde PDMS-lag med 700 mikroliter chondrocyt kulturmedium. Ved hjælp af en stereo mikrosope, placere alginat-chondrocyte konstrukt på det tynde PDMS lag, idet du skal passe på at tilpasse konstruktioner med luftkamrene, og klemme enheden med 3D-printede klemmer.For aktivering af enheden, skal du bruge et stykke silicium slange til at forbinde udløbet af en luftpumpe med indløb af en magnetventil. Brug et ekstra stykke slange til at forbinde magnetventilens udløb med indløbet på den samlede enhed. Tilslut magnetventilen med en funktionsgenerator, og brug en en hertz kvadratisk bølge genereret af funktionsgeneratoren til at manipulere magnetventilen.Tænd derefter for luftpumpen for at aktivere enheden pneumatisk. Den microfluidic chondrocyte kompression enhed indeholder fem af fem arrays af cylindriske alginat-chondrocyte konstruktioner og disse konstruktioner kan komprimeres med fem forskellige størrelser af kompression. I dette eksempel blev gelkolonnen komprimeret med 33,8 % i højden af den største PDMS-ballon, og gelkonstruktionernes deraf følgende trykbelastning steg med ca. 5 % pr. 0,2 millimeter og PDMS-ballondiameteren.Kompressiv deformation af chondrocytterne blev bestemt ved at afbildre cellerne i en 613 af 613 med 40 til 55 mikrometervolumen nær gelkonstruktionen center. Her vises et billede af en chondrocyt, der blev komprimeret med 16% af den største PDMS-ballon. I denne graf kan fordelingen af de målte cellekomprimeringsstammeværdier observeres.I denne analyse blev cellerne komprimeret mere samlet af større PDMS-balloner. Samlet set tyder disse data på, at mængden af alginatgel og chondrocytkompression styres af diameteren af PDMS-ballonerne under et konstant tryk på 14 kilopascal. For at sikre, at enhedens ydeevne er repeterbar, er det afgørende at skabe en tynd PDMS-membran med en konstant tykkelse og elasticitet.Efter denne procedure, forskellige biologiske analyser, såsom immunfluorescens og in situ hybridisering kan udføres. Ved hjælp af denne teknik, mange spørgsmål om mechanotransduction i vækst plade eller leddepoter chondrocytter kan besvares.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikrofluid Platform for Måling neutrofilkemotaksi fra uforarbejdede fuldblod

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En Mikrofluid platform for langsigtet Multi-væv cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rod hår morfologi af Arabidopsis stiklinger i en to-lags mikrofluid Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...