Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

Nous remercions les Drs Christopher Moraes et Stephen A. Morin pour leur soutien à la conception et à la fabrication d'appareils. Cette étude a été soutenue par la subvention de bioengineering for Human Health de l'Université du Nebraska-Lincoln (UNL) et de l'Université du Nebraska Medical Center (UNMC), et l'AR070242 du NIH/NIAMS. Nous remercions Janice A. Taylor et James R. Talaska de l'Advanced Microscopy Core Facility du Centre médical de l'Université du Nebraska d'avoir fourni de l'aide en microscopie confocale.

REMARQUE : Portez de l'équipement de protection individuelle (EPI) comme des gants et une blouse de laboratoire pour chaque étape de ce protocole.
1. Fabrication de moule de maître
REMARQUE : Effectuez l'étape 1.1 - 1.3 dans une hotte de fumée.
<ol><li>Traitement du verre REMARQUE : Portez un écran facial, des gants et une blouse de laboratoire pour l'étape 1.1.<ol>
<li>Faire la solution Piranha (60 mL) en mélangeant l'acide sulfurique (H2SO<...

<ol>
	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+meet+cell+biology:+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays.">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Carde&#241;a, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation.">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li><li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays.">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression.">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).</li><li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro.">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li><li>M&#233;nard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate.">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li><li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force.">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li><li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings.">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li><li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation.">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li><li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading.">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li><li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression.">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li><li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth.">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li><li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsil&#228;, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes:+A+study+in+rabbits.">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li><li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression.">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li><li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth:+implications+for+scoliosis+progression.">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li><li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix.">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li><li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization.">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li><li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading.">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li><li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction.">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li><li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

Pour tester les effets du stress compressif sur les chondrocytes de plaque de croissance, nous avons développé le dispositif microfluidique de compression de chondrocyte (Figure 1) pour appliquer divers niveaux de stress compressif aux chondrocytes dans l'échafaudage d'hydrogel d'alginate pour 3D culture de manière à haut débit. Pour aider d'autres chercheurs à adopter notre appareil ou à développer des dispositifs similaires, nous avons fourni des détails sur les étapes de fabric...

Les plates-formes micro-ingénierie sont des outils précieux pour étudier la biologie moléculaire, cellulaire et tissulaire parce qu'elles permettent le contrôle dynamique des microenvironnements physiques et chimiques1,2,3 ,4,5,6,7,8. Ainsi, plusieurs hypothèses peuvent être testées simultanément d'une manière étroitement contrôlée. Dans le cas du cartilage de plaque de croissance, il y a de plus en plus d'évidences d'un rôle important de l'effort compressif en modulant la croissance d'os par l'action sur le cartilage de plaque de croissance9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Cependant, le mécanisme d'action du stress compressif - en particulier, comment le stress guide la formation de colonnes de chondrocytes dans la plaque de croissance - est mal compris.
L'objectif de ce protocole est de créer un dispositif de compression de chondrocyte suffoquement pneumatique26 pour élucider les mécanismes de la mécanobiologie dans les chondrocytes de plaque de croissance(figure 1a-c). Le dispositif se compose de deux parties : l'unité pneumatique d'actionnement et la construction de gel d'alginate. L'unité d'actionnement pneumatique microfluidique est fabriquée à l'aide de polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir de la photo et de la lithographie douce. Cette unité contient un tableau de 5 x 5 de minces ballons à membrane PDMS qui peuvent être gonflés différemment en fonction de leurs diamètres. La construction de gel d'alginate se compose des chondrocytes incorporés dans un tableau 5 x 5 des cylindres de gel d'alginate, et les constructions entières d'alginate-chondrocyte sont assemblées avec l'unité d'actionnement. Les constructions de gel d'alginate sont comprimées par les ballons PDMS gonflables pneumatiquement (figure 1b). Le dispositif microfluidique peut générer cinq niveaux différents de stress compressif simultanément dans une seule plate-forme basée sur les différences dans le diamètre du ballon PDMS. Ainsi, un essai à haut débit de la mécanobiologie de chondrocyte dans des conditions multiples de compression est possible.
Le dispositif microfluidique décrit dans ce protocole a beaucoup d'avantages au-dessus du dispositif conventionnel de compression tel que les fixateurs externes14,21,23 et les dispositifs macroscopiques de compression16, 19 ans, états-unis qui , 27 Annonces , 28 pour l'étude de la mécanobiologie du chondrocyte : 1) L'appareil microfluidique est rentable parce qu'il consomme un plus petit volume d'échantillons que le dispositif de compression macroscopique, 2) L'appareil microfluidique est efficace dans le temps parce qu'il peut tester plusieurs conditions de compression simultanément, 3) Le dispositif microfluidique peut combiner des stimuli mécaniques et chimiques en formant un gradient de concentration de produits chimiques basés sur le mélange limité dans les microcanaux, et 4) Diverses techniques de microscopie (time-lapse microscopie et fluorescence microscopie confocale) peut être appliquée avec le dispositif microfluidique fait de PDMS transparent.
Nous avons adopté et modifié la méthode de Moraes et coll.7,29 pour créer différents niveaux de stress compressif dans un seul appareil pour permettre des études de mécanobiologie à haut débit de la compression du chondrocyte. Notre approche est appropriée pour les cellules (p. ex. les chondrocytes) qui ont besoin d'un environnement culturel tridimensionnel (3D) et pour les essais biologiques après la compression des cellules. Bien que certains dispositifs de compression de cellules microfluidiques puissent comprimer des cellules cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D)30,31,32, ils ne peuvent pas être employés pour des chondrocytes parce que les chondrocytes cultivés 2D dédifférencier. Il existe des plates-formes microfluidiques pour la compression des cellules cultivées en 3D dans les hydrogels photopolyisés7,33, mais elles sont limitées dans l'isolation des cellules après des expériences de compression parce que l'isolation des cellules de photopolymérisés hydrogel n'est pas facile. En outre, les effets de l'exposition aux ultraviolets (UV) et des initiateurs de liaisons photo sur les cellules peuvent devoir être évalués. En revanche, notre méthode permet l'isolement rapide des cellules après des expériences de compression pour les essais post-biologiques parce que les hydrogels d'alginate peuvent être dépolymétés rapidement par des chélateurs de calcium. Les méthodes détaillées de fabrication et de caractérisation des appareils sont décrites dans ce protocole. Une brève procédure de fabrication du dispositif de compression microfluidique de chondrocyte est montrée dans la figure 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

Les stimuli mécaniques sont connus pour moduler les fonctions biologiques des cellules et des tissus. Des études récentes ont suggéré que le stress compressif modifie l'architecture du cartilage de la plaque de croissance et entraîne la modulation de la croissance des os longs des enfants. Pour déterminer le rôle du stress compressif dans la croissance osseuse, nous avons créé un dispositif microfluidique actionné par pression pneumatique, pour comprimer dynamiquement (ou statiquement) les chondrocytes de plaque de croissance incorporés dans les cylindres d'hydrogel d'alginate. Dans cet article, nous décrivons des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser cet appareil. Les avantages de notre protocole sont les : 1) Cinq différentes magnitudes de stress compressif peuvent être générées sur cinq répliques techniques dans une seule plate-forme, 2) Il est facile de visualiser la morphologie cellulaire par l'intermédiaire d'un microscope à lumière classique, 3) Les cellules peuvent être rapidement isolées de l'appareil après compression pour faciliter les essais en aval, et 4) La plate-forme peut être appliquée pour étudier la mécanobiologie de tout type de cellule qui peut se développer dans les hydrogels.

Cet article montre les étapes détaillées de la fabrication microfluidique du dispositif de compression de chondrocyte (Figure 2). L'appareil contient un tableau de 5 x 5 de constructions cylindriques alginate-chondrocytes, et ces constructions peuvent être comprimées avec cinq différentes magnitudes de compression (Figure 1, Figure 3 et Figure 4). La hauteur du microcanal pneumatique est d'environ...

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A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Cet article fournit des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser un dispositif microfluidique pneumatiquement actionnant pour la compression de chondrocyte.

Une plate-forme microfluidique pour stimuler les chondrocytes avec compression dynamique

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Ce dispositif de compression microfluidique activé pneumatiquement peut être employé pour étudier la mécanobiologie dans les cultures hydrogel 3D des chondrocytes de plaque de croissance. Le dispositif microfluidique est rentable et rentable dans le temps car il peut simultanément générer plusieurs magnitudes d’une compression sur de petits volumes d’échantillons, et diverses images microscopiques peuvent être appliquées avec l’appareil. Notre méthode peut également être appliquée à l’étude de la mécanobiologie d’autres types de cellules.Pour configurer la couche de microcanal, mélangez d’abord PDMS avec un rapport de poids de 10 prépolymères à un agent de séchage pendant cinq minutes. Ensuite, placez le moule sur un tampon de mousse et versez le mélange dans le moule principal. Dégazer le PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes et sandwich le PDMS dégazé avec un morceau de film de transparence.Serrez l’assemblage en sandwich avec la plaque de verre, les coussinets en mousse et les plaques de plexiglas. Guérir le PDMS à 80 degrés Celsius pendant six heures et isoler la couche PDMS et le film de transparence de la structure en sandwich. Activez les surfaces du PDMS et une plaque de verre propre avec le nettoyeur plasma pendant une minute avant de lier le PDMS sur la plaque de verre dans le four à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.Retirez ensuite le film de transparence. Pour la préparation de la fine membrane PDMS, faites tourner le PDMS non durci sur un film transparent à 1000 rotations par minute pendant une minute pour obtenir une couche PDMS de 60 micromètres d’épaisseur. Guérir partiellement le PDMS enduit de vrille à 80 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes avant d’utiliser le nettoyant plasmatique pour activer la couche PDMS microcanal sur la plaque de verre et la mince couche PDMS pendant une minute.Ensuite, lier la fine couche de membrane PDMS sur la couche pdms microcanal et placer les couches dans le four de 80 degrés Celsius pendant la nuit. Pour la préparation du bloc de tubes, placer les tubes métalliques verticalement sur une boîte de Pétri et verser délicatement le PDMS non durci dans le plat jusqu’à ce qu’environ 3/4 des tubes soient submergés. Après avoir dégazé le PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes, guérir le PDMS dans le four à 60 degrés Celsius pendant plus de six heures.À la fin du processus de séchage, couper un morceau de bloc PDMS contenant un tube et percer un trou dans la fine couche PDMS pour l’entrée. Activez le bloc PDMS et la fine couche PDMS avec le nettoyeur plasma. Après une minute, fixez le bloc PDMS au trou d’entrée de la fine couche PDMS et placez toute l’unité d’actionnement dans le four à 80 degrés Celsius pendant la nuit.Pour la préparation de moisissure de gel d’agarose, mélanger 5% d’agarose et 200 millimolar chlorure de calcium dans l’eau déionisée et chauffer la solution de gel agarose jusqu’à ébullition. Verser la solution de gel d’agarose bouillie dans un moule en aluminium et sandwich le moule avec la plaque de verre. Après cinq minutes, retirer le gel d’agarose solidifié du moule en aluminium.Plaque 150 microlitres de solution alginate-chondrocyte sur la plaque de verre aminosilanized et couvrir la solution avec le moule de gel d’agarose pendant trois minutes. À la fin de l’incubation, utilisez une lame de rasoir pour enlever la solution excessive de gel d’alginate et retirer le moule de gel agarose de la plaque. Ensuite, placez les constructions alginate-chondrocyte en solution de liaison croisée contenant du chlorure de calcium de 50 millimlaires et du chlorure de sodium de 140 millimlaires dans de l’eau déionisée pendant une minute.Pour assembler l’appareil, placez quatre espaceurs PDMS d’un millimètre d’épaisseur aux quatre coins de la mince couche PDMS de l’unité d’actionnement. Couvrir les chambres à air de la mince couche PDMS de 700 microlitres de milieu de culture des chondrocytes. À l’aide d’une microsope stéréo, placez la construction alginate-chondrocyte sur la mince couche PDMS, en prenant soin d’aligner les constructions avec les chambres à air, et pincez l’appareil avec des pinces imprimées en 3D.Pour l’actionnement de l’appareil, utilisez un morceau de tube de silicium pour connecter la sortie d’une pompe à air avec l’entrée d’une valve solénoïde. Utilisez un tube supplémentaire pour connecter la sortie de la valve solénoïde avec l’entrée de l’appareil assemblé. Connectez la valve solénoïde avec un générateur de fonction et utilisez une onde carrée hertz produite par le générateur de fonction pour manipuler la valve solénoïde.Ensuite, allumez la pompe à air pour actionner l’appareil pneumatiquement. Le dispositif de compression des chondrocytes microfluidiques contient cinq par cinq tableaux de constructions cylindriques d’alginate-chondrocyte et ces constructions peuvent être compressées avec cinq magnitudes différentes de compression. Dans cet exemple, la colonne de gel a été compressée de 33,8% de hauteur par le plus grand ballon PDMS et la souche compressive qui en résulte des constructions de gel a augmenté d’environ 5% par incrément de 0,2 millimètre et le diamètre du ballon PDMS.La déformation compressive des chondrocytes a été déterminée en imagerie des cellules dans un 613 par 613 par 40 à 55 micromètres de volume près du centre de construction de gel. Ici, une image d’un chondrocyte qui a été comprimé de 16% par le plus grand ballon PDMS est montré. Dans ce graphique, la distribution des valeurs mesurées de la souche de compression cellulaire peut être observée.Dans cette analyse, les cellules ont été compressées plus globalement par de plus grands ballons PDMS. Pris ensemble, ces données suggèrent que les quantités de gel alginate et de compression des chondrocytes sont contrôlées par le diamètre des ballons PDMS sous une pression constante de 14 kilopascals. Pour assurer la répétabilité des performances de l’appareil, la création d’une fine membrane PDMS avec une épaisseur et une élasticité constantes est cruciale.À la suite de cette procédure, divers essais biologiques, tels que l’immunofluorescence et l’hybridation in situ peuvent être effectués. En utilisant cette technique, de nombreuses questions sur la mécanotransduction dans la plaque de croissance ou les chondrocytes articulaires peuvent être répondues.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

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