Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
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Wir danken Drs. Christopher Moraes und Stephen A. Morin für ihre Unterstützung bei gerätedesign und -herstellung. Diese Studie wurde durch das Bioengineering for Human Health Stipendium der University of Nebraska-Lincoln (UNL) und des University of Nebraska Medical Center (UNMC) und das Stipendium AR070242 vom NIH/NIAMS unterstützt. Wir danken Janice A. Taylor und James R. Talaska von der Advanced Microscopy Core Facility am University of Nebraska Medical Center für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.

HINWEIS: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe und Labormantel für jeden Schritt in diesem Protokoll.
1. Meister formherstellung
HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.1 - 1.3 in einer Dunstabzugshaube aus.
<ol><li>Glasbehandlung HINWEIS: Tragen Sie einen Gesichtsschutz, Handschuhe und einen Labormantel für Schritt 1.1.<ol>
<li>Machen Sie Piranha-Lösung (60 ml) durch Mischen von Schwefelsäure(H2SO4) und Wasserstoffpero...

<ol>
	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. 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T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

Um die Auswirkungen der Druckspannung auf Wachstumsplattenchondrozyten zu testen, haben wir das mikrofluidische Chondrozytenkompressionsgerät (Abbildung 1) entwickelt, um verschiedene Druckgrade auf die Chondrozyten im Alginat-Hydrogelgerüst für 3D anzuwenden. Kultur auf hochdurchsatzweise. Um andere Forscher bei der Einführung unseres Geräts oder der Entwicklung ähnlicher Geräte zu unterstützen, haben wir in diesem Protokollartikel Details zu den Schritte zur Geräteherstellung bere...

Mikroentwickelte Plattformen sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der molekularen, zellulären und Gewebebiologie, da sie eine dynamische Steuerung sowohl der physikalischen als auch der chemischen Mikroumgebungen ermöglichen1,2,3 ,4,5,6,7,8. So können mehrere Hypothesen gleichzeitig streng kontrolliert getestet werden. Im Falle des Wachstumsplattenknorpels gibt es zunehmend Hinweise auf eine wichtige Rolle der Druckspannung bei der Modulation des Knochenwachstums durch Wirkung auf die Wachstumsplatte Knorpel9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Der Wirkmechanismus der Druckspannung – insbesondere, wie Stress die Bildung von Chondrozytensäulen in der Wachstumsplatte leitet – wird jedoch schlecht verstanden.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine pneumatisch betätigende mikrofluidische Chondrozytenkompressionsvorrichtung26 zu schaffen, um Mechanismen der Mechanobiologie in Wachstumsplattenchondrozyten aufzuklären (Abbildung 1a-c). Das Gerät besteht aus zwei Teilen: der pneumatischen Betätigungseinheit und dem Alginat-Gel-Konstrukt. Die mikrofluidische pneumatische Betätigungseinheit wird aus Polydimethylsiloxan (PDMS) auf Basis der Photo- und Softlithographie hergestellt. Diese Einheit enthält ein 5 x 5 Array von dünnen PDMS-Membranballons, die je nach Durchmesser unterschiedlich aufgeblasen werden können. Das Alginat-Gel-Konstrukt besteht aus den Chondrozyten, die in ein 5 x 5-Array von Alginat-Gel-Zylindern eingebettet sind, und die gesamten Alginat-Chondrozyten-Konstrukte werden mit der Betätigungseinheit zusammengesetzt. Die Alginat-Gel-Konstrukte werden durch die pneumatisch aufgeblasenen PDMS-Ballons komprimiert (Abbildung 1b). Das mikrofluidische Gerät kann auf der Grundlage von Unterschieden im PDMS-Ballondurchmesser fünf verschiedene Druckstufen gleichzeitig in einer einzigen Plattform erzeugen. Somit ist ein Hochdurchsatztest der Chondrozytenmechanobiologie unter mehrfachen Kompressionsbedingungen möglich.
Das in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Gerät hat gegenüber dem herkömmlichen Kompressionsgerät viele Vorteile, wie z. B. externe Fixatoren14,21,23 und makroskopische Kompressionsgeräte16, 19 , 27 , 28 für das Studium der Chondrozyten-Mechanobiologie: 1) Das mikrofluidische Gerät ist kostengünstig, da es ein geringeres Volumen an Proben verbraucht als das makroskopische Kompressionsgerät, 2) Das mikrofluidische Gerät ist zeiteffektiv, da es mehrere Kompressionsbedingungen gleichzeitig, 3) Das mikrofluidische Gerät kann mechanische und chemische Reize kombinieren, indem es einen Konzentrationsgradienten von Chemikalien bildet, der auf der begrenzten Vermischung in Mikrokanälen basiert, und 4) Verschiedene Mikroskopietechniken (Zeitraffer Mikroskopie und Fluoreszenzkonfokalmikroskopie) kann mit dem mikrofluidischen Gerät aus transparentem PDMS aufgetragen werden.
Wir übernahmen und modifizierten die Methode von Moraes et al.7,29, um verschiedene Druckspannungsniveaus in einem einzigen Gerät zu schaffen, um hochdurchsatz-mechanobiologische Studien der Chondrozytenkompression zu ermöglichen. Unser Ansatz eignet sich für Zellen (z.B. Chondrozyten), die eine dreidimensionale (3D) Kulturumgebung benötigen, und für biologische Tests nach dem Komprimieren von Zellen. Obwohl einige mikrofluidische Zellkompressionsgeräte Zellen komprimieren können, die auf zweidimensionalen (2D) Substraten kultiviert sind30,31,32, können sie nicht für Chondrozyten verwendet werden, da 2D-kultivierte Chondrozyten dedifferenziert. Es gibt mikrofluidische Plattformen zum Komprimieren von 3D-kultivierten Zellen in photopolymerisierten Hydrogelen7,33, aber sie sind in der Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten begrenzt, da die Isolierung von Zellen von photopolymerisierten Hydrogel ist nicht einfach. Darüber hinaus müssen die Auswirkungen der UV-Exposition (UV) und der Photovernetzung von Initiatoren auf Zellen möglicherweise bewertet werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht unsere Methode eine schnelle Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten für postbiologische Assays, da Alginathydrogele schnell durch Kalziumchelatoren depolymerisiert werden können. Die detaillierten Methoden zur Geräteherstellung und -charakterisierung werden in diesem Protokoll beschrieben. Abbildung 2zeigt ein kurzes Verfahren zur Herstellung des mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgeräts .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

Mechanische Reize sind dafür bekannt, biologische Funktionen von Zellen und Geweben zu modulieren. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Druckstress die Knorpelarchitektur der Wachstumsplatte verändert und zu einer Wachstumsmodulation langer Knochen von Kindern führt. Um die Rolle der Druckspannung beim Knochenwachstum zu bestimmen, haben wir ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das durch pneumatischen Druck betätigt wird, um Wachstumsplattenchondrozyten, die in Alginat-Hydrogel-Zylinder eingebettet sind, dynamisch (oder statisch) zu komprimieren. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Methoden zum Herstellung und Charakterisieren dieses Geräts. Die Vorteile unseres Protokolls sind: 1) Fünf verschiedene Größen von Druckspannung können auf fünf technischen Replikationen in einer einzigen Plattform erzeugt werden, 2) Es ist einfach, Zellmorphologie über ein herkömmliches Lichtmikroskop zu visualisieren, 3) Zellen können schnell isoliert werden vom Gerät nach der Kompression, um nachgeschaltete Assays zu erleichtern, und 4) Die Plattform kann angewendet werden, um Mechanobiologie jeder Zellart zu studieren, die in Hydrogelen wachsen kann.

Dieser Artikel zeigt detaillierte Schritte der mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgerätefertigung (Abbildung 2). Das Gerät enthält 5 x 5 Arrays von zylindrischen Alginat-Chondrozytenkonstrukten, und diese Konstrukte können mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden(Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Höhe des pneumatischen Mikrokanals beträgt ca. 90 m, und ...

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A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Dieses pneumatisch aktivierte mikrofluidische Kompressionsgerät kann verwendet werden, um mechanobiologie in 3D-Hydrogelkulturen von Wachstumsplattenchondrozyten zu studieren. Das mikrofluidische Gerät ist kosten- und zeiteffektiv, da es gleichzeitig mehrere Größen einer Kompression auf kleinen Probenvolumina erzeugen kann und verschiedene mikroskopische Bildgebungen mit dem Gerät angewendet werden können. Unsere Methode kann auch auf das Studium der Mechanobiologie anderer Zelltypen angewendet werden.Um die Mikrokanalschicht einzurichten, mischen Sie zunächst PDMS mit einem Gewichtsverhältnis von 10 Prepolymeren zu einem Härtungsmittel für fünf Minuten. Als nächstes legen Sie die Form auf ein Schaumstoffpad und gießen Sie die Mischung in die Master-Form. Das PDMS 30 Minuten in einer Vakuumkammer entgasen und das entgaste PDMS mit einem Stück Transparenzfolie verdrehen.Klemmen Sie die Sandwich-Baugruppe mit der Glasplatte, Schaumstoffpolstern und Plexiglasplatten. Das PDMS sechs Stunden lang bei 80 Grad Celsius aushärten und die PDMS-Schicht und den Transparenzfilm von der Sandwichstruktur isolieren. Aktivieren Sie die Oberflächen des PDMS und eine saubere Glasplatte mit dem Plasmareiniger für eine Minute, bevor Sie das PDMS 30 Minuten lang auf die Glasplatte im 80-Grad-Celsius-Ofen kleben.Entfernen Sie dann den Transparenzfilm. Zur Herstellung der dünnen PDMS-Membran eine 60 Mikrometer dicke PDMS-Schicht auf einer Transparenzfolie mit 1.000 Umdrehungen pro Minute zu drehen. Das spinbeschichtete PDMS bei 80 Grad Celsius 20 bis 30 Minuten lang teilweise aushärten, bevor der Plasmareiniger die Mikrokanal-PDMS-Schicht auf der Glasplatte und die dünne PDMS-Schicht für eine Minute aktiviert.Dann die dünne PDMS-Membranschicht auf die Mikrokanal-PDMS-Schicht kleben und die Schichten über Nacht in den 80-Grad-Celsius-Ofen legen. Zur Rohrblockzubereitung Metallrohre vertikal auf eine Petrischale legen und ungehärtetes PDMS vorsichtig in die Schale gießen, bis etwa 3/4 der Rohre untergetaucht sind. Nach der Entgasung des PDMS in einer Vakuumkammer für 30 Minuten, härten Sie das PDMS im Ofen bei 60 Grad Celsius für mehr als sechs Stunden aus.Schneiden Sie am Ende des Aushärtungsprozesses ein Stück PDMS-Block mit einem Rohr und stanzen Sie ein Loch in die dünne PDMS-Schicht für den Einlass. Aktivieren Sie den PDMS-Block und die dünne PDMS-Schicht mit dem Plasmareiniger. Nach einer Minute den PDMS-Block am Einlassloch der dünnen PDMS-Schicht befestigen und die gesamte Betätigungseinheit über Nacht bei 80 Grad Celsius in den Ofen stellen.Zur Herstellung von Agarose-Gel-Formen 5%Agarose und 200 Millimolar Calciumchlorid in entionisiertem Wasser mischen und die Agarose-Gel-Lösung bis zum Kochen erhitzen. Gießen Sie die gekochte Agarose-Gel-Lösung in eine Aluminiumform und verschließen Sie die Form mit der Glasplatte. Nach fünf Minuten das erstarrte Agarosegel aus der Aluminiumform entfernen.Platte 150 Mikroliter Alginat-Chondrozyten-Lösung auf die aminosilanisierte Glasplatte und bedecken Sie die Lösung drei Minuten lang mit Agarose-Gelform. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Rasierklinge, um die übermäßige Alginat-Gel-Lösung zu entfernen und die Agarose-Gelform von der Platte zu entfernen. Dann legen Sie die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte in eine Vernetzungslösung mit 50 Millimolar Calciumchlorid und 140 Millimolar-Natriumchlorid in deionisiertem Wasser für eine Minute.Um das Gerät zu montieren, lokalisieren Sie vier ein Millimeter dicke PDMS-Abstandshalter auf die vier Ecken der dünnen PDMS-Schicht der Betätigungseinheit. Bedecken Sie die Luftkammern der dünnen PDMS-Schicht mit 700 MikroliterChdrozytenkulturmedium. Platzieren Sie das Alginat-Chondrozyten-Konstrukt mit einem Stereo-Mikrosope auf der dünnen PDMS-Schicht, wobei Sie darauf achten, die Konstrukte an den Luftkammern auszurichten, und das Gerät mit 3D-gedruckten Klemmen einklemmen.Zur Betätigung des Geräts verwenden Sie ein Stück Siliziumschläuche, um den Auslass einer Luftpumpe mit dem Einlass eines Magnetventils zu verbinden. Verwenden Sie ein zusätzliches Rohrstück, um den Auslass des Magnetventils mit dem Einlass des montierten Geräts zu verbinden. Verbinden Sie das Magnetventil mit einem Funktionsgenerator und verwenden Sie eine vom Funktionsgenerator erzeugte Einhertz-Quadratwelle, um das Magnetventil zu manipulieren.Schalten Sie dann die Luftpumpe ein, um das Gerät pneumatisch zu betätigen. Das mikrofluidische Chondrozyten-Kompressionsgerät enthält fünf mal fünf Arrays zylindrischer Alginat-Chondrozytenkonstrukte, die mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden können. In diesem Beispiel wurde die Gelsäule durch die größte PDMS-Ballonumstiegumzahl um 33,8 % in der Höhe komprimiert, und die resultierende Druckdehnung der Gelkonstrukte wurde um etwa 5 % pro 0,2-Millimeter-Schritt und dem PDMS-Ballondurchmesser erhöht.Die komprimive Verformung der Chondrozyten wurde durch DieAbbildung der Zellen in einem 613 mal 613 durch 40 bis 55 Mikrometer Volumen in der Nähe des Gelkonstruktzentrums bestimmt. Hier wird ein Bild einer Chondrozyte gezeigt, die durch den größten PDMS-Ballon um 16% komprimiert wurde. In diesem Diagramm kann die Verteilung der gemessenen Zellkompressionsdehnungswerte beobachtet werden.In dieser Analyse wurden die Zellen durch größere PDMS-Ballons insgesamt stärker komprimiert. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Mengen an Alginat-Gel und Chondrozytenkompression durch den Durchmesser der PDMS-Ballons unter einem konstanten Druck von 14 Kilopascal gesteuert werden. Um die Wiederholbarkeit der Geräteleistung zu gewährleisten, ist die Erstellung einer dünnen PDMS-Membran mit konstanter Dicke und Elastizität von entscheidender Bedeutung.Nach diesem Verfahren können verschiedene biologische Assays wie Immunfluoreszenz und In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden. Mit dieser Technik können viele Fragen zur Mechanotransduktion in Wachstumsplatten oder Gelenkchdrozyten beantwortet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Forschung

Biotechnik

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