Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

אנו מודים לד"ר כריסטופר מוראיס וסטיבן א. מורין על תמיכתם בעיצוב ובייצור המכשירים. מחקר זה היה נתמך על ידי Bioהנדסאים למענק בריאות האדם מאוניברסיטת נברסקה-לינקולן (UNL) ו אוניברסיטת נברסקה המרכז הרפואי (UNL), ולהעניק AR070242 מ NIH/NIAMS. אנו מודים לג א. טיילור ו ג'יימס ר. Talaska של המתקן המיקרוסקופיה המתקדמת במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה למתן סיוע במיקרוסקופיה.

הערה: לבשו ציוד הגנה אישי (PPE) כגון כפפות ומעיל מעבדה לכל שלב בפרוטוקול זה.
1. ייצור עובש מאסטר
הערה: בצע את השלב 1.1-1.3 במכסה המנוע.
<ol><li>טיפול בזכוכית הערה: לבש מגן פנים, כפפות ומעיל מעבדה לשלב 1.1.<ol>
<li>להפוך את הפתרון פיראניה (60 mL) על ידי ערבוב חומצה גופרתית (H2</su...

<ol>
	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+meet+cell+biology:+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays.">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Carde&#241;a, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation.">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li><li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays.">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression.">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).</li><li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro.">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li><li>M&#233;nard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate.">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li><li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force.">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li><li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings.">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li><li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation.">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li><li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading.">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li><li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression.">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li><li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth.">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li><li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsil&#228;, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes:+A+study+in+rabbits.">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li><li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression.">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li><li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth:+implications+for+scoliosis+progression.">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li><li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix.">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li><li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization.">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li><li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading.">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li><li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction.">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li><li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

כדי לבדוק את ההשפעות של לחץ מדגיש על לוחית הצמיחה כונדרוציטים, פיתחנו את מכשיר הדחיסה microflu, כונדרוציטים (איור 1) כדי להחיל רמות שונות של מתח בלחץ על כונדרוcytes בפיגום הידרו-ג'ל לתלת-ממד תרבות בדרכים של תפוקה גבוהה. כדי לסייע לחוקרים אחרים לאמץ את המכשיר שלנו או לפתח מכשירים דו?...

פלטפורמות מיקרו מהונדסים הם כלים יקרי ערך ללמוד את הביולוגיה מולקולרית, תאית, רקמות ברמה כי הם לאפשר שליטה דינמית הן מיקרוסביבות פיזיות וכימיות1,2,3 ,4,5,6,7,8. לפיכך, ניתן לבדוק השערות רבות באופן סימולטני בצורה מבוקרת היטב. במקרה של סחוס הצלחת הצמיחה, יש להגדיל את העדויות של תפקיד חשוב של הלחץ בלחיצה בצמיחה עצם מודליטינג באמצעות פעולה על הסחוס לוחית הצמיחה9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. עם זאת, מנגנון הפעולה של מתח ברור – בפרט, כיצד מנחה המתח את היווצרות עמודי כונדרוציטים בצלחת הצמיחה-מובן בצורה גרועה.
המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור התקן מיקרופלאידיג מיקרו מבחינה כונדרולוגיה מכשיר דחיסה26 כדי להבהיר מנגנונים של מכניביולוגיה בצלחת הצמיחה כונדרוציטים (איור 1א-ג). המכשיר מורכב משני חלקים: יחידת האקטוציה הפניאומטית ובניית ג'ל האלגיאט. יחידת האקטואריה הפניאומטית של מיקרופלואידיג מפוברק בעזרת polydiמתיל siloxane (PDMS) בהתבסס על הצילום-וליתוגרפיה הרכה. יחידה זו מכילה 5 x 5 מערך של בלוני קרום PDMS דק אשר ניתן מנופח באופן שונה בהתבסס על קטרים שלהם. בניית ג'ל קילוף פלסטיצידיות מורכב כונדרוציטים מוטבע 5 x 5 מערך של בגלילים ג'ל קילוף פלסטיצידיות, ואת בנייה קילוף פלסטיצידיות כונדרוציטים מורכבים עם יחידת הגשמה. מבנים ג'ל קילוף פלסטיצידיות נדחסים על ידי בלונים pdms מנופח בדרך הריאה (איור 1b). המכשיר המיקרו-פלואידיג יכול ליצור חמש רמות שונות של לחץ הדוק בו זמנית בפלטפורמה אחת המבוססת על הבדלים בקוטר בלון PDMS. לפיכך, ניתן לבדוק את התפוקה הגבוהה של כונדרולוגיה ביולוגית בתנאי דחיסה מרובים.
המכשיר microflu, המתואר בפרוטוקול זה יש יתרונות רבים על התקן הדחיסה המקובלת כגון תופסני חיצוניים14,21,23 ו התקנים דחיסה מאקרוסקופי16, מיכל בן 19 , בן 27 , 28 ללימוד כונדרוביולוגיה מכניאולוגיה: 1) המכשיר microflu, מיקרופלואידים הוא עלות אפקטיבית משום שהוא צורכת נפח קטן יותר של דגימות מאשר התקן דחיסה מאקרוסקופי, 2) המכשיר microflu, c הוא הזמן יעיל כי זה יכול לבדוק מספר תנאי דחיסה בו זמנית, 3) מכשיר המיקרו-פלואידיג יכול לשלב גירויים מכניים וכימיים על ידי יצירת מעבר ריכוז של כימיקלים המבוססים על ערבוב מוגבל במיקרוערוצים, ו-4. טכניקות מיקרוסקופ שונות (בזמן הצניחה מיקרוסקופיה ומיקרוסקופיה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית) ניתן להחיל עם מכשיר מיקרופלואידיג מתוצרת PDMS שקופה.
אימצנו ושינו את השיטה של moraes ואח '7,29 כדי ליצור רמות מצוקה שונות של הלחץ במכשיר אחד כדי לאפשר תפוקה גבוהה לימודי מכניבביולוגיה של דחיסת כchondrocyte. הגישה שלנו מתאים לתאים (למשל, כונדרוציטים) אשר צריך תלת מימדי (3d) התרבות הסביבה עבור בחני יולוגי לאחר דחיסת תאים. למרות שחלק מהתקני הדחיסה של תא microflu, מיקרופלואידים יכולים לדחוס תאים הנמצאים בשימוש בשני מימדים (2d) ב-30,31,32, לא ניתן להשתמש בהם עבור כונדרוציטים כגון כונדרוציטים מסוג 2d להבדיל. יש פלטפורמות מיקרופלואידיג לדחיסת תאים תלת-ממדיים באמצעות הידרו-ג'ל פוטופוליזציה7,33, אבל הם מוגבלים בבידוד תאים אחרי ניסויים בדחיסה משום שבידוד תאים מפוטופוליזציה הידרוג'ל אינו קל. בנוסף, ההשפעות של אולטרה סגול (UV) חשיפה ומיזמים מרובי קישורים על התאים ייתכן שיהיה צורך להעריך. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשרת בידוד מהיר של תאים לאחר ניסויים הדחיסה עבור פוסט ביולוגי בחני כי קילוף פלסטיצידיות הידרוג יכול להיות מקובע במהירות על ידי מכשירי סידן. בפרוטוקול זה מתוארים השיטות המפורטות לייצור ואפיון. הליך קצר עבור בדיית כונדרופלואידיג מכשיר דחיסה מוצג באיור 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

גירויים מכניים ידועים לווסת פונקציות ביולוגיות של תאים ורקמות. מחקרים שנעשו לאחרונה הציעו כי הלחץ בלחיצה משנה את ארכיטקטורת הסחוס לוחית הצמיחה ותוצאות אפנון גדילה של עצמות ארוכות של ילדים. כדי לקבוע את התפקיד של מתח הדוק בצמיחת העצם, יצרנו מכשיר מיקרופלואידיג המופעל על ידי הלחץ הפניאומטי, באופן דינאמי (או סטטי) לדחוס את צלחת הצמיחה כונדרוציטים מוטבע בגלילים הידרוג'ל של קילוף פלסטיצידיות. במאמר זה אנו מתארים שיטות מפורטות לבדיית ואפיון התקן זה. היתרונות של הפרוטוקול שלנו הם: 1) חמישה גניטודות שונים של לחץ מדגיש ניתן ליצור על חמש משכפל טכני בפלטפורמה אחת, 2) קל לדמיין את המבנה התא באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי, 3) תאים יכולים להיות מבודדים במהירות מהמכשיר לאחר הדחיסה כדי להקל על המטה במורד הזרם, ו -4) ניתן ליישם את הפלטפורמה על מנת ללמוד מכניאולוגיה של כל סוג תא שיכול לצמוח בהידרולים.

מאמר זה מציג שלבים מפורטים של התקן הדחיסה של המיקרופלואידיג (איור 2). המכשיר מכיל 5 x 5 מערכים של גליל alginate מבנים כונדרוציטים, ובנייה אלה ניתן לדחוס עם חמישה גניטודות שונים של דחיסה (איור 1, איור 3 ואיור 4). הגובה של המיקרוערוץ הפנ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

זה מופעל pneumatically התקן דחיסה microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד mechanobiology בתרבויות הידרוג'ל 3D של chondrocytes צלחת צמיחה. המכשיר microfluidic הוא עלות זמן יעיל כי זה יכול בו זמנית לייצר סדרי גודל מרובים של דחיסה על כמויות קטנות של דגימות, הדמיות מיקרוסקופיות שונות ניתן להחיל עם המכשיר. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת גם על חקר mechanobiology של סוגי תאים אחרים.כדי להגדיר את שכבת המיקרו-ערוצים, ערבב תחילה PDMS עם יחס משקל של 10 prepolymers לסוכן ריפוי אחד במשך חמש דקות. לאחר מכן מניחים את התבנית על כרית קצף ויוצקים את התערובת לתוך תבנית האב. דגה PDMS בתא ואקום במשך 30 דקות כריך PDMS degassed עם פיסת סרט שקיפות.מהדקים את המכלול הכריך עם צלחת הזכוכית, רפידות הקצף וצלחות הפלקסיגלס. מרפאים את ה-PDMS ב-80 מעלות צלזיוס למשך שש שעות ומבודדים את שכבת ה-PDMS ואת סרט השקיפות מהמבנה הכריך. הפעל את המשטחים של PDMS וצלחת זכוכית נקייה עם מנקה הפלזמה במשך דקה אחת לפני מליטה PDMS על צלחת הזכוכית בתנור 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן הסר את סרט השקיפות. להכנת קרום PDMS הדק, מעיל ספין PDMS לא מאובטח על סרט שקיפות ב 1, 000 סיבובים לדקה במשך דקה אחת כדי לקבל שכבת PDMS עבה 60 מיקרומטר. לרפא חלקית את PDMS מצופה ספין ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות לפני השימוש מנקה פלזמה כדי להפעיל את שכבת PDMS microchannel על צלחת הזכוכית ואת שכבת PDMS דקה במשך דקה אחת.לאחר מכן קשרו את שכבת הממברנה הדקה PDMS לשכבת המיקרו-שאנל PDMS והצבו את השכבות בתנור של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להכנת בלוק צינורות, מניחים צינורות מתכת אנכית על צלחת פטרי ויוצקים בעדינות PDMS לא מאובטח לתוך המנה עד כ 3/4 של הצינורות שקועים. לאחר degassing PDMS בתא ואקום במשך 30 דקות, לרפא את PDMS בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך יותר משש שעות.בסוף תהליך הריפוי, חותכים חתיכת בלוק PDMS המכיל צינור אחד וניקוב חור בשכבת PDMS הדקה עבור המפרצון. הפעל את בלוק PDMS ואת שכבת PDMS הדקה עם מנקה הפלזמה. לאחר דקה אחת, חבר את בלוק PDMS לחור הפנימי של שכבת PDMS הדקה והצב את כל יחידת התב"ע בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.להכנת עובש ג'ל אגרוז, יש לערבב 5% אגרוז ו-200 מילימולרים סידן כלורי במים דה-יוניים לחמם את תוסף ג'ל אגרוז עד לרתיחה. יוצקים את תווי ג'ל אגרוז מבושל לתוך תבנית אלומיניום כריך את התבנית עם צלחת הזכוכית. לאחר חמש דקות, להסיר את ג'ל אגרוז מוצק מן עובש אלומיניום.צלחת 150 microliters של פתרון אלגינט-כונדרוציטים על צלחת זכוכית aminosilanized ולכסות את הפתרון עם עובש ג'ל אגרוז במשך שלוש דקות. בסוף הדגירה, להשתמש בסכין גילוח כדי להסיר את פתרון ג'ל אלגינט מוגזם ולהסיר את עובש ג'ל אגרוז מהצלחת. לאחר מכן מניחים את המבנים alginate-chondrocyte לתוך פתרון קישור צולב המכיל 50 כלוריד סידן מילימולר ו 140 מילימולר נתרן כלורי במים deionized במשך דקה אחת.להרכבת ההתקן, אתר ארבעה מפזרי PDMS בעובי מילימטר אחד על ארבע הפינות של שכבת PDMS הדקה של יחידת התב"א. מכסים את תאי האוויר של שכבת PDMS הדקה עם 700 מיקרוליטרים של מדיום תרבות כונדרוציטים. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים את מבנה האלגינט-כונדרוציטים על שכבת ה-PDMS הדקה, דואגים ליישר את המבנים עם תאי האוויר ולהדק את ההתקן באמצעות מלחציים המודפסים בתלת-ממד.לתיעול המכשיר, השתמשו בפיסת צינורות סיליקון כדי לחבר את השקע של משאבת אוויר עם ההקדמה של שסתום סולנואיד. השתמש חתיכה נוספת של צינורות כדי לחבר את השקע של שסתום סולנואיד עם ההתחברות של המכשיר התאספו. חבר את שסתום סולנואיד עם מחולל פונקציה ולהשתמש גל מרובע אחד הרץ שנוצר על ידי מחולל הפונקציה כדי לתפעל את שסתום סולנואיד.לאחר מכן הפעל את משאבת האוויר כדי להפעיל את ההתקן באופן פנאומטי. התקן דחיסת כונדרוציט microfluidic מכיל חמישה על חמישה מערכים של מבנים גליליים אלגינט-chondrocyte ומבנהים אלה ניתן לדחוס עם חמישה סדרי גודל שונים של דחיסה. בדוגמה זו, עמודת הג'ל נדחסה על ידי 33.8% גובה על ידי בלון PDMS הגדול ביותר ואת המתח הדחוס וכתוצאה מכך של מבני ג'ל גדל בכ 5% לכל תוספת של 0.2 מילימטר ואת קוטר בלון PDMS.עיוות דחוס של chondrocytes נקבע על ידי הדמיה התאים ב 613 על ידי 613 על ידי 40 עד 55 מיקרומטר נפח ליד מרכז בניית ג'ל. כאן מוצגת תמונה של כונדרוציטים שדחוסה ב- 16% על-ידי בלון PDMS הגדול ביותר. בגרף זה, ניתן לראות את התפלגות ערכי זן דחיסת התאים הנמדדים.בניתוח זה, התאים נדחסו באופן כללי יותר על ידי בלוני PDMS גדולים יותר. יחד, נתונים אלה מראים כי כמויות של ג'ל אלגינט ודחיסת כונדרוציטים נשלטים על ידי קוטר בלוני PDMS תחת לחץ מתמיד של 14 קילו-פסקל. כדי להבטיח את יכולת החזרה של ביצועי ההתקן, יצירת קרום PDMS דק עם עובי וגמישות קבועים היא קריטית.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות ביולוגיות שונות, כגון כשל חיסוני והכלאה באתרו. באמצעות טכניקה זו, שאלות רבות על mechanotransduction בצלחת הצמיחה או chondrocytes פרקים ניתן לענות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...