Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

हम डिवाइस डिजाइन और निर्माण के लिए उनके समर्थन के लिए Drs. क्रिस्टोफर Moraes और स्टीफन ए मोरिन धन्यवाद. इस अध्ययन नेब्रास्का-Lincoln विश्वविद्यालय (यूएनएल) और नेब्रास्का मेडिकल सेंटर (UNMC) के विश्वविद्यालय से मानव स्वास्थ्य अनुदान के लिए Bioengineering द्वारा समर्थित किया गया था, और NIH से AR070242 अनुदान / हम Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता प्रदान करने के लिए नेब्रास्का मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में उन्नत माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा के जेनिस ए टेलर और जेम्स आर Talaska धन्यवाद.

नोट: इस प्रोटोकॉल में हर कदम के लिए इस तरह के दस्ताने और प्रयोगशाला कोट के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (PPE) पहनें।
1. मास्टर मोल्ड निर्माण
नोट: एक धूआं हुड में कदम 1.1 - 1.3 प्रदर्शन ?...

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	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. 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T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स पर संपीड़न तनाव के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने 3 डी के लिए एल्जिनेट हाइड्रोजेल पाड़ में कोन्ड्रोसाइट्स में कोन्ड्रोसाइट्स के लिए संपीड़न तनाव के विभिन्न स्तरों को ?...

सूक्ष्म इंजीनियर प्लेटफार्मों आणविक, सेलुलर, और ऊतक स्तर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं क्योंकि वे दोनों भौतिक और रासायनिक microenvironments1,2,3 के गतिशील नियंत्रण सक्षम ,4,5,6,7,8. इस प्रकार, कई hypotheses एक साथ एक कसकर नियंत्रित तरीके से परीक्षण किया जा सकता है. विकास प्लेट उपास्थि के मामले में, वहाँ विकास प्लेट उपास्थि9,10,11पर कार्रवाई के माध्यम से हड्डी के विकास को मॉडुलन में संपीड़न तनाव की एक महत्वपूर्ण भूमिका के सबूत बढ़ रहे हैं, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. हालांकि, संपीड़न तनाव की कार्रवाई की क्रिया - विशेष रूप से, कैसे तनाव विकास प्लेट में कोन्ड्रोसाइट कॉलम के गठन गाइड - खराब समझा जाता है.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक वायवीय रूप से संचालित माइक्रोप्रवाही कोन्ड्रोसाइट संपीड़न उपकरण26 को विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स में मेकोबायोलॉजी के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए बनाना है (चित्र 1ए-सी)। डिवाइस दो भागों के होते हैं: वायवीय actuation इकाई और alginate जेल का निर्माण. माइक्रोफ्लूइडिक वायवीय प्रवर्तक इकाई फोटो और मृदु-लिथोग्राफी के आधार पर पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके निर्मित है। इस इकाई पतली PDMS झिल्ली गुब्बारे जो अलग ढंग से उनके व्यास के आधार पर फुलाया जा सकता है की एक 5 x 5 सरणी शामिल हैं. ऐल्जिनेट जेल निर्माण में एल्जिनेट जेल सिलेंडरों की 5 x 5 सरणी में एम्बेडेड कोन्ड्रोसाइट्स होते हैं, और पूरे एल्गिनेट-कोन्ड्रोसाइट निर्माण actuation इकाई के साथ इकट्ठे होते हैं। ऐल्जिनेट जेल निर्माण वायवीय रूप से फुलाया PDMS गुब्बारे द्वारा संकुचित कर रहे हैं (चित्र 1b). microfluidic डिवाइस PDMS गुब्बारा व्यास में मतभेद के आधार पर एक ही मंच में एक साथ संपीड़न तनाव के पांच विभिन्न स्तरों उत्पन्न कर सकते हैं. इस प्रकार, कई संपीड़न स्थितियों के तहत कोन्ड्रोसाइट मेकोनोबायोलॉजी का एक उच्च-थ्रूपुट परीक्षण संभव है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित microfluidic डिवाइस इस तरह के बाहरी fixators 14 ,21,23 और स्थूल संपीड़न उपकरणों16के रूप में पारंपरिक संपीड़न डिवाइस पर कई फायदे हैं, 19 , 27 , 28 कोन्ड्रोसाइट मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए: 1) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस लागत प्रभावी है क्योंकि यह स्थूल संपीड़न डिवाइस की तुलना में नमूनों की छोटी मात्रा की खपत करता है, 2) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस समय प्रभावी है क्योंकि यह कई परीक्षण कर सकता है संपीड़न शर्तों एक साथ, 3) microfluidic डिवाइस microchannels में सीमित मिश्रण के आधार पर रसायनों की एकाग्रता ढाल बनाने के द्वारा यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजनाओं गठबंधन कर सकते हैं, और 4) विभिन्न माइक्रोस्कोपी तकनीक (समय चूक माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट कोनफोकल माइक्रोस्कोपी) को पारदर्शी पीडीएमएस से बने माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के साथ लागू किया जा सकता है।
हमने एक ही उपकरण में विभिन्न संपीडक तनाव के स्तर को बनाने के लिए मोरेस एट अल.7,29 की विधि को अपनाया और संशोधित किया ताकि कोन्ड्रोसाइट संपीड़न के उच्च-थ्रूपुट मेकोबायोलॉजी अध्ययन को सक्षम किया जा सके। हमारा दृष्टिकोण कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है (उदाहरण के लिए, chondrocytes) जो तीन आयामी (3 डी) संस्कृति पर्यावरण की जरूरत है और कोशिकाओं को संपीड़ित करने के बाद जैविक assays के लिए. हालांकि कुछ microfluidic सेल संपीड़न उपकरणों दो आयामी (2 डी) substrates30,31,32पर सुसंस्कृत कोशिकाओं को संपीड़ित कर सकते हैं , वे कोन्ड्रोसाइट्स के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है क्योंकि 2 डी सुसंस्कृत कोन्ड्रोसाइट्स अलग करना। वहाँ photopolymerized hydrogels 7 ,33में 3डी सुसंस्कृत कोशिकाओं को संपीड़ित करने के लिए microfluidic प्लेटफार्मों रहेहैं,लेकिन वे संपीड़न प्रयोगों के बाद कोशिकाओं को अलग करने में सीमित हैं क्योंकि photopolymerized से कोशिकाओं को अलग हाइड्रोजेल आसान नहीं है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं पर पराबैंगनी (यूवी) जोखिम और फोटो क्रॉसलिंकिंग आरंभककर्ताओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, हमारी विधि पोस्ट जैविक परख के लिए संपीड़न प्रयोगों के बाद कोशिकाओं के तेजी से अलगाव की अनुमति देता है क्योंकि alginate hydrogels कैल्शियम chelators द्वारा जल्दी depolymerized किया जा सकता है. विस्तृत डिवाइस निर्माण और विशेषता विधियों इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. माइक्रोफ्लुइडिक कोन्ड्रोसाइट संपीडन युक्ति के निर्माण के लिए एक संक्षिप्त प्रक्रिया चित्र 2 में दर्शायागया है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

यांत्रिक उद्दीपक कोशिकाओं और ऊतकों के जैविक कार्यों को मॉडुलित करने के लिए जाना जाता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि संपीड़न तनाव विकास प्लेट उपास्थि वास्तुकला को बदल देता है और बच्चों की लंबी हड्डियों के विकास मॉडुलन में परिणाम है। हड्डी के विकास में संपीड़न तनाव की भूमिका निर्धारित करने के लिए, हम एक microfluidic डिवाइस वायवीय दबाव द्वारा actuated बनाया, गतिशील रूप से (या स्थिर रूप से) सेक विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स alginate hydrogel सिलेंडरों में एम्बेडेड. इस आलेख में, हम इस डिवाइस को बनाने और विशेषता बनाने के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन करते हैं. हमारे प्रोटोकॉल के फायदे हैं: 1) एक ही मंच में पांच तकनीकी प्रतिकृति पर संपीड़न तनाव के पांच अलग अलग परिमाण उत्पन्न किया जा सकता है, 2) यह एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से सेल आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए आसान है, 3) कोशिकाओं को तेजी से अलग किया जा सकता है संपीड़न के बाद डिवाइस से डाउनस्ट्रीम परख की सुविधा के लिए, और 4) मंच hydrogels में विकसित कर सकते हैं कि किसी भी सेल प्रकार के mechanobiology का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

यह आलेख माइक्रोफ्लुइडिक कोन्ड्रोसाइट संपीड़न उपकरण संविक्षिप्ति के विस्तृत चरणों को दर्शाता है (चित्र 2)। इस उपकरण में बेलनाकार ऐल्जिनेट-कोन्ड्रोसाइट के 5 x 5 सरणियां हैं, और इन निर्माणों को...

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A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

यह लेख कोन्ड्रोसाइट संपीड़न के लिए एक वायवीय रूप से actuating microfluidic डिवाइस के निर्माण और विशेषता के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करता है।

गतिशील संपीड़न के साथ Chondrocytes उत्तेजक के लिए एक Microfluidic मंच

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

इस वायवीय रूप से सक्रिय माइक्रोफ्लुइडिक संपीड़न डिवाइस का उपयोग विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स की 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों में मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस लागत और समय प्रभावी है क्योंकि यह एक साथ नमूनों की छोटी मात्रा पर संपीड़न के कई परिमाण उत्पन्न कर सकता है, और डिवाइस के साथ विभिन्न सूक्ष्म इमेजिंग लागू किए जा सकते हैं। हमारी विधि को अन्य कोशिका प्रकारों के मशीनोबायोलॉजी के अध्ययन पर भी लागू किया जा सकता है।माइक्रोचैनल लेयर स्थापित करने के लिए, पहले पीडीएमएस को पांच मिनट के लिए एक इलाज एजेंट को 10 प्रीपॉलिमर के वजन अनुपात के साथ मिलाएं। अगले एक फोम पैड पर मोल्ड जगह है और मास्टर मोल्ड में मिश्रण डालना। 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम चैंबर में पीडीएमएस degas और पारदर्शिता फिल्म का एक टुकड़ा के साथ degassed PDMS सैंडविच ।ग्लास प्लेट, फोम पैड, और प्लेक्सीग्लास प्लेटों के साथ सैंडविच असेंबली को दबाएं। छह घंटे के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर पीडीएमएस का इलाज और सैंडविच संरचना से पीडीएमएस परत और पारदर्शिता फिल्म को अलग । पीडीएमएस की सतहों और प्लाज्मा क्लीनर के साथ एक साफ ग्लास प्लेट को 80 डिग्री सेल्सियस ओवन में ग्लास प्लेट पर 30 मिनट के लिए बांधने से पहले एक मिनट के लिए सक्रिय करें।इसके बाद ट्रांसपेरेंसी फिल्म को हटा दें। पतली पीडीएमएस झिल्ली की तैयारी के लिए, स्पिन कोट एक 60 माइक्रोमीटर मोटी पीडीएमएस परत प्राप्त करने के लिए एक मिनट के लिए प्रति मिनट 1, 000 घूर्णन पर एक पारदर्शिता फिल्म पर ठीक पीडीएमएस। कांच की प्लेट पर माइक्रोचैनल पीडीएमएस परत और एक मिनट के लिए पतली पीडीएमएस परत को सक्रिय करने के लिए प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करने से पहले 20 से 30 मिनट के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर स्पिन लेपित पीडीएमएस का आंशिक रूप से इलाज करें ।फिर पतली पीडीएमएस झिल्ली परत को माइक्रोचैनल पीडीएमएस परत पर बांधें और परतों को रात भर 80 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। टयूबिंग ब्लॉक तैयारी के लिए, धातु ट्यूबों को एक पेट्री डिश पर खड़ी रखें और धीरे-धीरे डिश में ठीक पीडीएमएस डालें जब तक कि ट्यूबों के लगभग 3/4 जलमग्न न हो जाएं। 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम चैंबर में पीडीएमएस degassing के बाद, छह घंटे से अधिक के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर ओवन में पीडीएमएस का इलाज ।इलाज प्रक्रिया के अंत में, एक ट्यूब युक्त पीडीएमएस ब्लॉक का एक टुकड़ा काटें और इनलेट के लिए पतली पीडीएमएस परत में एक छेद पंच करें। प्लाज्मा क्लीनर के साथ पीडीएमएस ब्लॉक और पतली पीडीएमएस परत को सक्रिय करें। एक मिनट के बाद, पीडीएमएस ब्लॉक को पतली पीडीएमएस परत के इनलेट छेद में संलग्न करें और पूरी एक्तुशन इकाई को रात भर 80 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।एगर उठे जेल मोल्ड तैयारी के लिए, डिओनाइज्ड पानी में 5% एगर उठे और 200 मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड मिलाएं और उबलते तक एगर उठे जेल समाधान को गर्म करें। उबले हुए एगर उठे जेल समाधान को एल्यूमीनियम मोल्ड में डालें और ग्लास प्लेट के साथ मोल्ड को सैंडविच करें। पांच मिनट के बाद, एल्यूमीनियम मोल्ड से जम एगर उठे जेल को हटा दें।अमीनोसिलाइज्ड ग्लास प्लेट पर एल्गिनेट-कोंड्रोसाइटे समाधान के 150 माइक्रोलीटर प्लेट करें और समाधान को तीन मिनट के लिए एगर उठे जेल मोल्ड के साथ कवर करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अत्यधिक एल्गिनेट जेल समाधान को हटाने और प्लेट से एगर उठे जेल मोल्ड को हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। फिर एल्गिनेट-कोंड्रोसाइट एक मिनट के लिए डिओनाइज्ड पानी में 50 मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड और 140 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड युक्त क्रॉस-लिंकिंग समाधान में निर्माण करें।डिवाइस को इकट्ठा करने के लिए, ऐक्ट्यूशन यूनिट की पतली पीडीएमएस परत के चार कोनों पर ४ १ मिलीमीटर मोटी पीडीएमएस स्पेसर्स का पता लगाएं । पतली पीडीएमएस परत के वायु कक्षों को 700 माइक्रोलीटर के साथ कवर करें। स्टीरियो माइक्रोसोप का उपयोग करके, पतली पीडीएमएस परत पर एल्गिनेट-कोंड्रोसाइट का निर्माण करें, जो निर्माणों को हवा कक्षों के साथ संरेखित करने का ध्यान रखते हैं, और डिवाइस को 3 डी-मुद्रित क्लैंप के साथ दबाते हैं।डिवाइस के एक्ट्यूएशन के लिए, एक हवा पंप के आउटलेट को सोनालिका वाल्व के इनलेट के साथ जोड़ने के लिए सिलिकॉन ट्यूबिंग के एक टुकड़े का उपयोग करें। इकट्ठे डिवाइस के इनलेट के साथ सोनालिका वाल्व के आउटलेट को जोड़ने के लिए ट्यूबिंग के एक अतिरिक्त टुकड़े का उपयोग करें। एक समारोह जनरेटर के साथ सोनालिका वाल्व कनेक्ट और सोनालिका वाल्व में हेरफेर करने के लिए समारोह जनरेटर द्वारा उत्पन्न एक हर्ट्ज वर्ग तरंग का उपयोग करें।फिर डिवाइस को वायवीय रूप से अभिनय करने के लिए एयर पंप चालू करें। माइक्रोफ्लुइडिक कोंड्रोसाइट संपीड़न डिवाइस में बेलनाकार एल्गिनेट-कोंड्रोसाइटे निर्माणों की पांच द्वारा पांच सरणी होती हैं और इन निर्माणों को संपीड़न के पांच अलग-अलग परिमाण के साथ संकुचित किया जा सकता है। इस उदाहरण में, जेल कॉलम को सबसे बड़े पीडीएमएस गुब्बारे द्वारा ऊंचाई में 33.8% से संकुचित किया गया था और जेल के परिणामस्वरूप कंप्रेसिव तनाव में लगभग 5% प्रति 0.2 मिलीमीटर वेतन वृद्धि और पीडीएमएस गुब्बारा व्यास में वृद्धि हुई।कोंड्रोसाइट्स का कंप्रेसिव डिफॉर्मेशन जेल निर्माण केंद्र के पास 40 से 55 माइक्रोमीटर की मात्रा द्वारा 613 द्वारा 613 में कोशिकाओं को इमेजिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। यहां एक chondrocyte की एक छवि है कि सबसे बड़ा पीडीएमएस गुब्बारा द्वारा 16% से संकुचित किया गया था दिखाया गया है । इस ग्राफ में, मापा सेल संपीड़न तनाव मूल्यों का वितरण देखा जा सकता है।इस विश्लेषण में, कोशिकाओं को बड़े पीडीएमएस गुब्बारे द्वारा समग्र रूप से संकुचित किया गया था। एक साथ लिया गया, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एल्गिनेट जेल और कोंड्रोसाइट संपीड़न की मात्रा 14 किलोपास्कल के निरंतर दबाव में पीडीएमएस गुब्बारे के व्यास द्वारा नियंत्रित की जाती है। डिवाइस प्रदर्शन की पुनरावृत्ति सुनिश्चित करने के लिए, एक निरंतर मोटाई और लोच के साथ एक पतली पीडीएमएस झिल्ली बनाना महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया के बाद, विभिन्न जैविक परख, जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस और सीटू संकरण में प्रदर्शन किया जा सकता है। इस तकनीक का इस्तेमाल करते हुए ग्रोथ प्लेट या आर्टिकुलर कोनड्रोसाइट्स में मेकेनोकडक्शन से जुड़े कई सवालों के जवाब दिए जा सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

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लंबे समय तक सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के संचालन के लिए एक बहुपरत Microfluidic मंच

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