Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
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Agradecemos aos Drs. Christopher Moraes e Stephen A. Morin por seu suporte para design e fabricação de dispositivos. Este estudo foi apoiado pela bioengenharia para subsídio de saúde humana da Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL) e da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC), e Grant AR070242 da NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor e James R. talaska, da central de microscopia avançada do centro médico da Universidade de Nebraska, por fornecer assistência com microscopia confocal.

Nota: Use equipamento de proteção individual (EPI) como luvas e jaleco para cada passo neste protocolo.
1. fabricação do molde mestre
Nota: execute a etapa 1,1-1,3 em uma capa das emanações.
<ol><li>Tratamento de vidro Nota: Use um escudo facial, luvas e um jaleco para o passo 1,1.<ol>
<li>Faça a solução da piranha (60 mL) misturando O ácido sulfúrico (H2assim4) e O peróxido de hidrogênio (h2O2) com uma r...

<ol>
	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+meet+cell+biology:+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays.">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Carde&#241;a, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force.">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li><li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings.">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li><li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation.">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li><li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading.">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li><li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression.">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li><li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth.">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li><li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsil&#228;, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes:+A+study+in+rabbits.">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li><li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression.">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li><li>Aronsson, D. 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T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

Para testar os efeitos do estresse compressivo nos condrócitos da placa de crescimento, desenvolvemos o dispositivo de compressão microfluídico do condrócito (Figura 1) para aplicar vários níveis de estresse compressivo aos condrócitos no andaime de hidrogel de alginato para 3D cultura em formas de alta taxa de transferência. Para ajudar outros pesquisadores a adotar nosso dispositivo ou desenvolver dispositivos semelhantes, fornecemos detalhes das etapas de fabricação do dispositi...

As plataformas micro-projetadas são ferramentas valiosas para estudar a biologia molecular, celular, e do nível de tecido porque permitem o controle dinâmico dos microambientes físicose químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Assim, as hipóteses múltiplas podem simultaneamente ser testadas em uma maneira firmemente controlada. No caso da cartilagem da placa de crescimento, há evidências crescentes de um importante papel do estresse compressivo na modulação do crescimento ósseo através da ação sobre a cartilagem da placa de crescimento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. No entanto, o mecanismo de ação do estresse compressivo – em particular, como o estresse orienta a formação de colunas de condrócitos na placa de crescimento – é pouco compreendido.
O objetivo deste protocolo é criar um dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico de acionamento pneumaticamente26 para elucidar mecanismos de mecanobiologia em condrócitos de placa de crescimento (Figura 1a-c). O dispositivo consiste em duas porções: a unidade pneumática da atuação e a construção do gel do alginato. A unidade de acionamento pneumático microfluídico é fabricada com polidimetilsiloxano (PDMS) com base na foto e na Soft-litografia. Esta unidade contem uma disposição 5 x 5 de balões finos da membrana de PDMS que podem ser inflados diferentemente baseados em seus diâmetros. A construção do gel do alginato consiste nos condrócitos encaixados em uma disposição 5 x 5 de cilindros do gel do alginato, e os constructos inteiros do alginato-chondrocyte são montados com a unidade da atuação. As construções de gel de alginato são compactadas pelos balões PDMS inflacionados pneumaticamente (Figura 1b). O dispositivo microfluídico pode gerar cinco níveis diferentes de estresse compressivo simultaneamente em uma única plataforma baseada em diferenças no diâmetro do balão PDMS. Assim, um teste da elevado-taxa de transferência do mechanobiology do condrócitos circunstâncias múltiplas da compressão é possível.
O dispositivo microfluídico descrito neste protocolo tem muitas vantagens sobre o dispositivo de compressão convencional, tais como fixadores externos14,21,23 e dispositivos de compressão macroscópica16, 19 anos de , 27 anos de , 28 para estudar a mecanobiologia do condrócitos: 1) o dispositivo microfluídicos é cost-effective porque consome o volume menor das amostras do que o dispositivo macroscópico da compressão, 2) o dispositivo microfluídicos é tempo eficaz porque pode testar o múltiplo condições de compressão simultaneamente, 3) o dispositivo microfluídico pode combinar estímulos mecânicos e químicos, formando um gradiente de concentração de produtos químicos com base na mistura limitada em microcanais, e 4) várias técnicas de microscopia (lapso de tempo microscopia e microscopia confocal da fluorescência) podem ser aplicados com o dispositivo microfluídicos feito de PDMS transparente.
Adotou-se e modificou o método de Moraes et al.7,29 para criar diferentes níveis de estresse compressivo em um único dispositivo para possibilitar estudos de mecanobiologia de alta produtividade de compressão de condrócitos. Nossa aproximação é apropriada para pilhas (por exemplo, chondrocytes) que precisam o ambiente tridimensional (3D) da cultura e para ensaios biológicos após ter comprimindo pilhas. Embora alguns dispositivos de compressão celular microfluídico possam comprimir células cultivadas em substratos bidimensionais (2D)30,31,32, eles não podem ser usados para condrócitos porque os condrócitos cultivados em 2D desdiferenciam-se. Existem plataformas microfluídico para comprimir células 3D cultivadas em hidrogéis fotopolimerizados7,33, mas eles são limitados em isolar as células após experimentos de compressão porque isolar as células de fotopolimerizadas hidrogel não é fácil. Adicionalmente, os efeitos da exposição ultravioleta (UV) e dos iniciadores de reticulação da foto nas pilhas podem precisar de ser avaliados. Em contraste, nosso método permite o isolamento rápido de células após experimentos de compressão para ensaios pós-biológicos, pois os hidrogéis de alginato podem ser despolimerizados rapidamente por quelantes de cálcio. Os métodos detalhados da fabricação e da caracterização do dispositivo são descritos neste protocolo. Um breve procedimento para fabricar o dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos é mostrado na Figura 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

Estímulos mecânicos são conhecidos por modulam funções biológicas de células e tecidos. Estudos recentes sugerem que o estresse compressivo altera a arquitetura da cartilagem da placa de crescimento e resulta na modulação do crescimento de ossos longos de crianças. Para determinar o papel do stress compressivo no crescimento ósseo, criamos um dispositivo microfluídico acionado por pressão pneumática, para dinamicamente (ou estaticamente) comprimir condrócitos de placa de crescimento embutidos em cilindros de hidrogel de alginato. Neste artigo, descrevemos métodos detalhados para fabricar e caracterizar este dispositivo. As vantagens de nosso protocolo são: 1) cinco magnitudes diferentes do esforço compressivo podem ser gerados em cinco repetições técnicas em uma única plataforma, 2) é fácil visualizar a morfologia da pilha através de um microscópio de luz convencional, 3) as pilhas podem ràpida ser isoladas a partir do dispositivo após a compressão para facilitar os ensaios a jusante, e 4) a plataforma pode ser aplicada para estudar mecanobiologia de qualquer tipo de célula que pode crescer em hidrogéis.

Este artigo mostra etapas detalhadas da fabricação do dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico (Figura 2). O dispositivo contém uma matriz de 5 x 5 de construções cilíndricas de alginato-condrócito, e essas construções podem ser compactadas com cinco magnitudes diferentes de compressão (Figura 1, figura 3 e Figura 4). A altura do Microchannel pneumático é ao redor 90 μm, e ...

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A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Este dispositivo de compressão microfluida ativado pneumaticamente pode ser usado para estudar a mecanobiologia em culturas de hidrogel 3D de condrócitos de placas de crescimento. O dispositivo microfluido é econômico e demorado porque pode simultaneamente gerar múltiplas magnitudes de uma compressão em pequenos volumes de amostras, e várias imagens microscópicas podem ser aplicadas com o dispositivo. Nosso método também pode ser aplicado ao estudo da mecanobiologia de outros tipos de células.Para configurar a camada microcanal, misture primeiro o PDMS com uma razão de peso de 10 prepolímeros para um agente de cura por cinco minutos. Em seguida, coloque o molde em uma almofada de espuma e despeje a mistura no molde mestre. Degas o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos e sanduíche o PDMS desgaseado com um pedaço de filme de transparência.Aperte o conjunto sanduíche com a placa de vidro, almofadas de espuma e placas de plexiglass. Cure o PDMS a 80 graus Celsius por seis horas e isole a camada PDMS e o filme de transparência da estrutura sanduíche. Ative as superfícies do PDMS e uma placa de vidro limpa com o limpador de plasma por um minuto antes de ligar o PDMS à placa de vidro no forno Celsius de 80 graus por 30 minutos.Em seguida, remova o filme de transparência. Para a preparação da fina membrana PDMS, gire o PDMS sem correção em uma película de transparência a 1.000 rotações por minuto durante um minuto para obter uma camada PDMS de 60 micrômetros de espessura. Cure parcialmente o PDMS revestido de spin a 80 graus Celsius por 20 a 30 minutos antes de usar o limpador de plasma para ativar a camada PDMS microcanal na placa de vidro e na fina camada PDMS por um minuto.Em seguida, conecte a fina camada de membrana PDMS à camada PDMS microcanal e coloque as camadas no forno Celsius de 80 graus durante a noite. Para a preparação do bloco de tubulação, coloque os tubos metálicos verticalmente em uma placa de petri e despeje suavemente PDMS nãocurados na placa até que cerca de 3/4 dos tubos estejam submersos. Depois de desgasear o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos, cure o PDMS no forno a 60 graus Celsius por mais de seis horas.No final do processo de cura, corte um pedaço de bloco PDMS contendo um tubo e faça um furo na fina camada PDMS para a entrada. Ative o bloco PDMS e a fina camada PDMS com o limpador de plasma. Após um minuto, conecte o bloco PDMS ao orifício de entrada da fina camada PDMS e coloque toda a unidade de atuação no forno a 80 graus Celsius durante a noite.Para a preparação do molde de gel de agarose, misture 5% de agarose e 200 cloreto de cálcio mililitro em água deionizada e aqueça a solução de gel de agarose até ferver. Despeje a solução de gel de agarose cozida em um molde de alumínio e sanduiche o molde com a placa de vidro. Após cinco minutos, remova o gel de agarose solidificado do molde de alumínio.Placa 150 microliters de solução de alginato-condrocyte na placa de vidro aminosilanizada e cubra a solução com molde de gel agarose por três minutos. No final da incubação, use uma lâmina de barbear para remover a solução excessiva de gel alginato e remover o molde de gel de agarose da placa. Em seguida, coloque as construções de alginato-condrocito em solução transversal contendo 50 mililitros de cálcio e 140 milimilas de cloreto de sódio em água desionizada por um minuto.Para montar o dispositivo, localize quatro espaçadores PDMS de um milímetro de espessura nos quatro cantos da fina camada PDMS da unidade de atuação. Cubra as câmaras de ar da fina camada PDMS com 700 microliters de meio de cultura condrócito. Utilizando um microsope estéreo, coloque o construto alginato-condrocito sobre a fina camada PDMS, tomando o cuidado de alinhar os construtos com as câmaras de ar e fixar o dispositivo com grampos impressos em 3D.Para atuação do dispositivo, use um pedaço de tubo de silício para conectar a saída de uma bomba de ar com a entrada de uma válvula solenoide. Use um pedaço adicional de tubulação para conectar a saída da válvula solenoide com a entrada do dispositivo montado. Conecte a válvula solenoide com um gerador de função e use uma onda quadrada de hertz gerada pelo gerador de função para manipular a válvula solenoide.Em seguida, ligue a bomba de ar para acionar o dispositivo pneumaticamente. O dispositivo de compressão de condrocitos microfluidos contém cinco por cinco matrizes de construtos cilíndricos alginato-condrócito e esses construtos podem ser comprimidos com cinco magnitudes diferentes de compressão. Neste exemplo, a coluna de gel foi comprimida por 33,8% de altura pelo maior balão PDMS e a cepa compressiva resultante dos construtos de gel aumentou aproximadamente 5% por incremento de 0,2 milímetros e o diâmetro do balão PDMS.A deformação compressiva dos condrócitos foi determinada por imagem das células em um volume de 613 por 613 por 40 a 55 micrômetros perto do centro de construção de gel. Aqui é mostrada uma imagem de um condrócito que foi comprimido por 16% pelo maior balão PDMS. Neste gráfico, pode-se observar a distribuição dos valores da cepa de compressão celular medida.Nesta análise, as células foram compactadas mais globalmente por balões PDMS maiores. Juntos, esses dados sugerem que as quantidades de gel alginato e compressão de condrocitos são controladas pelo diâmetro dos balões PDMS sob uma pressão constante de 14 quilopascals. Para garantir a repetibilidade do desempenho do dispositivo, é crucial criar uma membrana PDMS fina com espessura e elasticidade constantes.Após esse procedimento, podem ser realizados diversos ensaios biológicos, como a imunofluorescência e a hibridização in situ. Utilizando essa técnica, muitas perguntas sobre mecanotransdução em placa de crescimento ou condrócitos articular podem ser respondidas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Bioengenharia

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

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O Chip Multi-organ - Uma plataforma microfluídica para longo prazo Coculture Multi-tecidos

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A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

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Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

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A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

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