Name: a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

Vi tackar DRS. Christopher Moraes och Stephen A. Morin för deras stöd för enheten design och tillverkning. Denna studie stöddes av bio Engineering för Human Health Grant från University of Nebraska-Lincoln (UNL) och University of Nebraska Medical Center (UNMC), och Grant AR070242 från NIH/NIAMS. Vi tackar Janice A. Taylor och James R. Talaska av den avancerade mikroskopi Core Facility vid University of Nebraska Medical Center för att ge hjälp med konfokalmikroskopi.

Obs: Använd personlig skyddsutrustning såsom handskar och labbrock för varje steg i detta protokoll.
1. Master mögel tillverkning
Obs: Utför steg 1,1-1,3 i ett draghuv.
<ol><li>Glas behandling Obs: Använd en ansiktsskärm, handskar och en labbrock för steg 1,1.<ol>
<li>Gör Piranha-lösning (60 mL) genom att blanda svavelsyra (H2so4) och väteperoxid (h2O2) med ett volym förhållande på 3:1. FÖRSIKTIGHET:...

<ol>
	<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress.">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li><li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+meet+cell+biology:+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays.">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Carde&#241;a, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation.">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li><li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays.">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression.">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).</li><li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro.">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li><li>M&#233;nard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate.">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li><li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force.">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li><li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings.">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li><li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation.">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li><li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading.">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li><li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression.">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li><li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth.">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li><li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsil&#228;, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes:+A+study+in+rabbits.">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li><li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression.">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li><li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth:+implications+for+scoliosis+progression.">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li><li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix.">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li><li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization.">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li><li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading.">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li><li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction.">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li><li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes:+previous+approaches+and+future+directions.">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li><li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology.">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li><li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus.">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li><li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression.">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li><li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture.">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).</li><li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation.">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li><li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valve-based+microfluidic+compression+platform:+single+axon+injury+and+regrowth.">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li><li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells.">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions.">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li><li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable,+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds.">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li></ol>

För att testa effekterna av tryckhållfasthet på tillväxtplattan chondrocyter, utvecklade vi mikroflödessystem Chondrocyte komprimerings enhet (figur 1) för att tillämpa olika nivåer av tryckhållfasthet på chondrocyter i alginat hydrogel ställningen för 3D kultur i högt genomflöde sätt. För att hjälpa andra forskare att anta vår enhet eller utveckla liknande enheter, tillhandahöll vi Detaljer om enhetens tillverkningssteg i denna protokoll artikel.
<p class="jove_conten...

Mikro-Engineered plattformar är värdefulla verktyg för att studera molekylär, cellulära och vävnadsnivå biologi eftersom de möjliggör dynamisk kontroll av både fysiska och kemiska mikromiljöer1,2,3 ,4,5,6,7,8. Således kan flera hypoteser testas samtidigt på ett väl kontrollerat sätt. När det gäller tillväxtplattan brosk, det finns ökande belägg för en viktig roll av tryckhållfasthet stress i modulerande bentillväxt genom åtgärder på tillväxtplattan brosk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men verkningsmekanismen för tryckhållfasthet-i synnerhet hur stress styr bildandet av Chondrocyte kolumner i tillväxtplattan-är dåligt förstådd.
Målet med detta protokoll är att skapa en pneumatiskt manövrerande mikrofluidisk Chondrocyte-komprimeringsenhet26 för att belysa mekanismerna för mechanobiologi i tillväxtplattan kondrocyter (figur 1a-c). Anordningen består av två delar: den pneumatiska aktiverings enheten och alginatgelkonstruktionen. Den mikrofluidiska pneumatiska aktiverings enheten är tillverkad med Polydimetylsiloxan (PDMS) baserad på foto-och mjuk litografi. Denna enhet innehåller en 5 x 5 array av tunna PDMS membran ballonger som kan pumpas på olika sätt baserat på deras diameter. Alginatgelkonstruktionen består av de kondrocyter som är inbäddade i en 5 x 5 uppsättning alginatgelcylindrar, och hela alginat-Chondrocyte-konstrukterna monteras med aktiverings enheten. Alginatgelkonstruktioner komprimeras av de pneumatiskt uppblåsta PDMS-ballongerna (figur 1b). Den mikroflödessystem enheten kan generera fem olika nivåer av kompressiv stress samtidigt i en enda plattform baserad på skillnader i PDMS ballong diameter. Således är ett högt genomflöde test av Chondrocyte Mekanobiologi under flera kompressionsförhållanden möjligt.
Den mikroflödessystem anordning beskrev i denne protokoll har många forellerna över den traditionell sammantryckningen anordning sådan som yttre fixeringssystemen14,21,23 och makroskopiska sammantryckningen anordningen16, 19 , 27 , 28 för att studera Chondrocyte mechanobiology: 1) den mikroflödessystem enheten är kostnadseffektiv eftersom den förbrukar mindre volym av prover än den makroskopiska komprimerings enhet, 2) den mikroflödessystem enheten är tidseffektiv eftersom den kan testa flera kompressionsförhållanden samtidigt, 3) den mikroflödessystem enheten kan kombinera mekaniska och kemiska stimuli genom att bilda en koncentration gradient av kemikalier baserade på den begränsade blandningen i mikrokanaler, och 4) olika mikroskopi tekniker (Time-lapse mikroskopi och fluorescenskonfokalmikroskopi) kan appliceras med mikroflödessystem-enheten gjord av transparenta PDMS.
Vi antog och modifierade metoden för Moraes et al.7,29 för att skapa olika tryck stressnivåer i en enda enhet för att möjliggöra hög genomströmning Mekanobiologi studier av Chondrocyte komprimering. Vårt tillvägagångssätt är lämpligt för celler (t. ex. chondrocyter) som behöver tredimensionell (3D) kulturmiljö och för biologiska analyser efter att komprimera celler. Även om vissa mikroflödessystem cell komprimerings enheter kan komprimera celler odlade på tvådimensionella (2D) substrat30,31,32, kan de inte användas för chondrocyter eftersom 2D odlade kondrocyter Dedifferentiering. Det finns mikroflödessystem plattformar för att komprimera 3D odlade celler i photopolymerized hydrogeler7,33, men de är begränsade i isolerar celler efter kompressions experiment eftersom isolera celler från photopolymerized hydrogel är inte lätt. Dessutom kan effekterna av ultraviolett (UV) exponering och foto crosslinking initierare på celler behöva utvärderas. I kontrast, vår metod tillåter snabb isolering av celler efter kompressions experiment för post biologiska analyser eftersom natriumalginat hydrogeler kan depolymeriseras snabbt av kalciumkelatorer. De detaljerade metoderna för enhets tillverkning och karakterisering beskrivs i detta protokoll. Ett kort förfarande för att tillverka den mikrofluidiska Chondrocyte-komprimeringsenheten visas i figur 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td>
			<td>United Chemical Technologies</td>
			<td>T2492-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Schwarzer Precision</td>
			<td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td>
			<td>We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate powder</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td>Pronova UP MVG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barb Straight Connectors (Metal tube)</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>EB40-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyed red aqueous fluorescent particles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam pad</td>
			<td>GRAINGER</td>
			<td>Item # 5GCE8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function / Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2633500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH1174-4LP</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-267-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>E3630A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid manifold</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>MSV10-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Pneumadyne</td>
			<td>S10MM-30-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-100</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131273 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-5</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>Y131252 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSX12445</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for stimulating chondrocytes with dynamic compression

Mekaniska stimuli är kända för att modulera biologiska funktioner av celler och vävnader. Nyligen genomförda studier har föreslagit att kompressiv stress förändrar tillväxtplattan brosk arkitektur och resulterar i tillväxt modulering av långa ben av barn. För att avgöra vilken roll kompressiv stress i bentillväxt, skapade vi en mikroflödessystem enhet aktiveras av pneumatiskt tryck, att dynamiskt (eller statiskt) komprimera tillväxtplattan kondrocyter inbäddade i natriumalginat hydrogel cylindrar. I den här artikeln beskriver vi detaljerade metoder för att tillverka och karakterisera den här enheten. Fördelarna med vårt protokoll är: 1) fem olika magnituder av tryckhållfasthet kan genereras på fem tekniska replikat i en enda plattform, 2) det är lätt att visualisera cellmorfologin via ett konventionellt ljusmikroskop, 3) celler kan snabbt isoleras från enheten efter komprimering för att underlätta nedströms analyser, och 4) plattformen kan tillämpas för att studera mechanobiologi av någon celltyp som kan växa i hydrogels.

Denna artikel visar detaljerade steg i mikroflödessystem Chondrocyte komprimering enhet Fabrication (figur 2). Enheten innehåller en 5 x 5 matriser av cylindriska alginate-Chondrocyte konstruktioner, och dessa konstruktioner kan komprimeras med fem olika magnituder av kompression (figur 1, figur 3 och figur 4). Höjden på den pneumatiska mikrokanalen är cirka 90 μm, och PDMS ballong diametrar är 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression at JoVE.com

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Den här artikeln innehåller detaljerade metoder för att tillverka och karakterisera en pneumatiskt aktiverande mikrofluidisk enhet för Chondrocyte-komprimering.

En Mikrofluidisk plattform för att stimulera kondrocyter med dynamisk kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Denna pneumatiskt aktiverade microfluidic komprimeringsanordning kan användas för att studera mekanobiologi i 3D hydrogel kulturer av tillväxtplatta chondrocytes. Den mikrofluidiska enheten är kostnad och tidseffektiva eftersom det samtidigt kan generera flera magnituder av en komprimering på små volymer av prover, och olika mikroskopiska avbildningar kan tillämpas med enheten. Vår metod kan också tillämpas på studiet av mekanobiologi av andra celltyper.För att ställa in mikrokanalskiktet, först blanda PDMS med en viktförhållande på 10 prepolymerer till ett härdningsmedel i fem minuter. Nästa plats formen på en skum pad och häll blandningen i befälhavaren mögel. Degas den PDMS i en vakuumkammare i 30 minuter och smörgås den avgasade PDMS med en bit av öppenhet film.Kläm fast den inklämda monteringen med glasplattan, skumdynor, och plexiglasplattor. Bota PDMS vid 80 grader Celsius i sex timmar och isolera PDMS-lagret och öppenhetsfilmen från den inklämda strukturen. Aktivera PDMS-ytorna och en ren glasskiva med plasmarengöraren i en minut innan du limmar fast PDMS-na på glasplattan i 80-graders Celsiusugnen i 30 minuter.Ta sedan bort insynsfilmen. För beredning av det tunna PDMS-membranet, spin coat oloppade PDMS på en öppenhet film på 1, 000 rotationer per minut i en minut för att få en 60 mikrometer tjock PDMS lager. Bota delvis de spinbelagda PDMS vid 80 grader Celsius i 20 till 30 minuter innan du använder plasmarengöraren för att aktivera mikrokanals PDMS-lagret på glasplattan och det tunna PDMS-lagret i en minut.Sedan band den tunna PDMS membranskikt på mikrokanal PDMS lager och placera skikten i 80-graders Celsius ugnen över natten. För slangblocksberedning, placera metallrör vertikalt på en petriskål och häll försiktigt ocured PDMS i skålen tills ca 3/4 av rören är nedsänkta. Efter avgasning av PDMS i en vakuumkammare i 30 minuter, bota PDMS i ugnen på 60 grader Celsius i mer än sex timmar.I slutet av härdningsprocessen, skär en bit PDMS block som innehåller ett rör och stansa ett hål i det tunna PDMS-lagret för inloppet. Aktivera PDMS-blocket och det tunna PDMS-lagret med plasmarengöringsmedlet. Efter en minut fäster du PDMS-blocket i inloppshålet på det tunna PDMS-lagret och placerar hela aktiveringsenheten i ugnen på 80 grader Celsius över natten.För agaros gel mögelberedning, blanda 5%agaros och 200 millimol kalciumklorid i avjoniserat vatten och värma agaros gellösningen tills kokning. Häll den kokta agarosgellösningen i en aluminiumform och smörgås formen med glasplattan. Efter fem minuter, ta bort den stelnade agarosgel från aluminium mögel.Plate 150 mikroliter av alginat-chondrocyte lösning på den aminosilaniserade glasplattan och täck lösningen med agaros gel mögel i tre minuter. I slutet av inkubationen, använd ett rakblad för att avlägsna den överdrivna alginat gellösningen och ta bort agarosgelformen från plattan. Placera sedan alginat-chondrocyte konstruktioner i tvärbindande lösning som innehåller 50 millimolar kalciumklorid och 140 millimolar natriumklorid i avjoniserat vatten i en minut.För att montera enheten, leta upp fyra en millimeter tjocka PDMS-distanser på de fyra hörnen på det tunna PDMS-lagret på aktiveringsenheten. Täck luftkamrarna i det tunna PDMS-skiktet med 700 mikroliter av chondrocyte odlingsmedium. Med hjälp av en stereo mikrosope, placera alginat-chondrocyte konstruktion på den tunna PDMS lager, var noga med att anpassa konstruktioner med luftkamrarna, och klämma enheten med 3D-tryckta klämmor.För aktivering av enheten, använd en bit av kiselrör för att ansluta utloppet av en luftpump med inloppet av en magnetventil. Använd ytterligare en bit slang för att ansluta magnetventilens utlopp med inloppet till den monterade enheten. Anslut magnetventilen med en funktion generator och använda en en hertz kvadratvåg som genereras av funktionsgeneratorn för att manipulera magnetventilen.Slå sedan på luftpumpen för att aktivera enheten pneumatiskt. Den mikrofluidiska kondrocyte komprimeringsanordningen innehåller fem av fem matriser av cylindriska alginate-chondrocyte konstruktioner och dessa konstruktioner kan komprimeras med fem olika magnituder av kompression. I det här exemplet komprimerades gelkolonnen med 33,8 %i höjd av den största PDMS-ballongen och den resulterande trycksila tryckningen hos gelkonstruktionerna ökade med ungefär 5%per 0,2 millimeters steg och PDMS-ballongdiametern.Compressive deformation av kondrocyter bestämdes genom avbildning cellerna i en 613 av 613 av 40 till 55 mikrometer volym nära gel konstruera centrum. Här visas en bild av en kondrocyte som komprimerades med 16%av den största PDMS-ballongen. I denna graf kan fördelningen av de uppmätta cellkompressionsstamvärdena observeras.I denna analys komprimerades cellerna mer övergripande av större PDMS-ballonger. Sammantaget tyder dessa data på att mängderna alginat gel och kondrocytekomprimering styrs av diametern på PDMS-ballongerna under ett konstant tryck på 14 kilopascal. För att säkerställa repeterbarheten av enhetens prestanda, skapa en tunn PDMS membran med en konstant tjocklek och elasticitet är avgörande.Efter denna procedur kan olika biologiska analyser, såsom immunofluorescens och in situ-hybridisering utföras. Med hjälp av denna teknik, många frågor om mechanotransduction i tillväxtplatta eller artikulära chondrocytes kan besvaras.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klämma som en robust, mikroflödes Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikroflödes Plattform för Mätning Neutrophil Chemotaxis från Cement helblod

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgeln Chip - En mikroflödes Plattform för Långsiktig Flervävnads Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rotahåret morfologi av Arabidopsis plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikroflödessystem plattform för längsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...