Name: micromanipulation of circulating tumor cells for downstream molecular analysis and metastatic potential assessment
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment at JoVE.com

אנו מודים לכל המטופלים שתרמו דם עבור המחקר שלנו, כמו גם כל קלינאים מעורבים ואחיות לימוד. אנו מודים לינס אברדט, בירק, ו ד ר קאטארינה Uhlig מ-ALS פתרונות מעבדה אוטומטיות GmbH לתמיכה רציפה. אנו מודים לכל חברי מעבדת Aceto למשוב ולדיונים. מחקר במעבדה Aceto נתמך על ידי מועצת המחקר האירופי, האיחוד האירופי, המדע הלאומי למדעים הלאומית, הסרטן השוויצרי ליג, באזל סרטן הליגה, שני הקנטונים של בזל דרך ETH ציריך, ואוניברסיטת בזל.

כל ההליכים הכרוכים בדגימות דם מהחולים נערכו בהסכמת הסכמה מושכלת של המשתתפים. הליכים הופעל על פי פרוטוקולים EKNZ BASEC 2016-00067 ו-EK 321/10, שאושרו על ידי לוח הסקירה המוסרי והמוסדי (ועדת האתיקה מערב/מרכז שוויץ [EKNZ]), ובציות להכרזת הלסינקי.
כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיו?...

<ol>
	<li>Talmadge, J. E., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+centennial+series:+the+biology+of+cancer+metastasis:+historical+perspective.">AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective.</a> Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).</li><li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biological+Principles+of+Metastasis.">Emerging Biological Principles of Metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li><li>Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+Route+to+Metastasis:+Circulating+Tumor+Cell+Clusters+and+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition.">En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).</li><li>Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+clusters:+What+we+know+and+what+we+expect+(Review).">Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review).</a> International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Pantel, K., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+circulating+tumor+cells.">The biology of circulating tumor cells.</a> Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).</li><li>Hou, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+and+molecular+characteristics+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+microemboli+in+patients+with+small-cell+lung+cancer.">Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).</li><li>Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+TRF2,+SOX10,+and+CD10+in+circulating+tumor+microemboli+detected+in+metastatic+melanoma+patients.+A+potential+impact+for+the+assessment+of+disease+aggressiveness.">High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness.</a> Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinally+collected+CTCs+and+CTC-clusters+and+clinical+outcomes+of+metastatic+breast+cancer.">Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).</li><li>Mu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+assessment+of+the+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+and+their+clusters+in+patients+with+advanced-stage+breast+cancer.">Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+microemboli+(CTM)+and+vimentin++circulating+tumor+cells+(CTCs)+detected+by+a+size-based+platform+predict+worse+prognosis+in+advanced+colorectal+cancer+patients+during+chemotherapy.">Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy.</a> Cancer Cell International. 17, 6 (2017).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+Microemboli+in+Gastric+Cancer.">Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer.</a> Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).</li><li>Chang, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Significance+of+Circulating+Tumor+Microemboli+as+a+Prognostic+Marker+in+Patients+with+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma.">Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.</a> Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).</li><li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+clusters+are+oligoclonal+precursors+of+breast+cancer+metastasis.">Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis.</a> Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).</li><li>Cheung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyclonal+breast+cancer+metastases+arise+from+collective+dissemination+of+keratin+14-expressing+tumor+cell+clusters.">Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).</li><li>Giuliano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective+on+Circulating+Tumor+Cell+Clusters:+Why+It+Takes+a+Village+to+Metastasize.">Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize.</a> Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).</li><li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis.">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11, 33 (2016).</li><li>Gkountela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cell+Clustering+Shapes+DNA+Methylation+to+Enable+Metastasis+Seeding.">Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding.</a> Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. , (2019).</li><li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system:+the+clinician's+guide+to+breast+cancer+treatment?.">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment?.</a> Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).</li><li>Sarioglu, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+label-free,+physical+capture+of+circulating+tumor+cell+clusters.">A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters.</a> Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System.">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).</li><li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li><li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells.">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).</li><li>Went, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+EpCam+protein+expression+in+human+carcinomas.">Frequent EpCam protein expression in human carcinomas.</a> Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).</li><li>Soysal, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM+expression+varies+significantly+and+is+differentially+associated+with+prognosis+in+the+luminal+B+HER2(+),+basal-like,+and+HER2+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer.">EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer.</a> British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells.">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li><li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microfilter+device+for+selective+capture,+electrolysis+and+genomic+analysis+of+human+circulating+tumor+cells.">Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells.</a> Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility.">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li></ol>

האפיון המולקולרי של CTCs מחזיק בהבטחה לשפר את הבנתנו את התהליך הגרורתי ולהדריך את התפתחות הטיפולים החדשים נגד גרורות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הפרוטוקולים הללו המאפשרים CTC מיקרומניפולציה וניתוח במורד הזרם, כולל שניהם תא יחיד המבוסס על מבוססי תאים, ניתוח ביטוי גנים בהשתלה vivo עבור פ...

ביטוי קליני של גרורות באיברים רחוקים מייצג את השלב הסופי של התקדמות הסרטן וחשבונות עבור יותר מ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן1. המעבר מתוך מחלה מקומית למחלה גרורתית הוא תהליך רב שלב, לעתים קרובות מתווכת על ידי במחזור תאים סרטניים (ctcs)2,3,4. תאים אלה הם לשפוך מן הגידול העיקרי לתוך זרימת הדם מועברים לאיברים מרוחקים, שם הם יכולים extravasate ולהקים נגעים גרורתית5,6. למרות גידולים מוצקים יכולים לשחרר מספר גבוה יחסית של CTCs, רוב CTCs נועדו למות, בשל כוחות להטות גבוה במחזור, anoikis-בתיווך מוות תאים, התקפה חיסונית או יכולות מוגבלות כדי להסתגל מיקרוסביבה זרה7. לכן, זה מרכזי להקים כלים המאפשרים את הניתוח של התכונות המולקולריות של אלה CTCs כי הם מצוידים ביכולת זריעת גרורות. מחקרים האחרונים פרה וקליניים מראים כי הנוכחות והכמות של ctcs יחיד ואשכולות CTC קשורה לתוצאה גרועה יותר בחולים עם סוגים שונים של גידולים מוצקים8,9,10 , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 . אשכולות CTC הם קבוצות של שניים או יותר ctcs מחוברים זה לזה במהלך המחזור ויעילים יותר ביצירת גרורות לעומת ctcs אחד3,15,16. תאים בתוך אשכול שומרים על הדבקה חזקה תא תא באמצעות הצמתים desmosomes וחסיד, אשר עשוי לסייע להתגבר על אנואיקיס17,18. לאחרונה, הבחנו כי התקבצות של CTCs מקושרת לhypאומולציה של אתרי הכריכה של שולי-והפצת שעתוק הקשורים, המובילה ליכולת מוגברת ליזום בהצלחה את גרורות19. CTC הדיסוציאציה גורמת לשיפוצים של אתרי האיגוד המרכזיים, וכתוצאה מכך, הדיכוי של הפוטנציאל הגרורתי שלהם19. בנוסף אשכולות של תאים סרטניים, CTCs יכול גם לשייך לתא הדם הלבן (לעתים קרובות נויטרופילים) כדי לשמור על רמות התפשטות גבוהות במחזור ולהגדיל יכולת גרורתית שלהם20. עם זאת, הביולוגיה של CTCs מובנת רק בחלק ומספר שאלות נשארות פתוחות, כולל התכונות המולקולריות והפגיעויות של תאים בודדים ומקובצים באשכולות.
בשנים האחרונות הוקמו מספר אסטרטגיות שינצלו את דפוסי הביטוי של משטח התא, כמו גם תכונות פיזיות של ctcs לבידוד שלהם21,22,23,24, 25. אנטיגן-שיטות בידוד תלוי להסתמך בעיקר על הביטוי של משטח התא אפיתל מולקולה הדבקה של תא (epcam)26. השימוש התכוף ביותר (בזמן הנוכחי) הפלטפורמה היחידה של ה-FDA עבור ספירה CTC, היא מערכת CellSearch, אשר מבוססת על הליך שני שלבים כדי לבודד CTCs21. בשלב הראשון, רכיבי פלזמה מוסרים על ידי צנטריפוגה, בעוד CTCs נלכדים עם מגנטי מגנטיים מצמידים אנטי EpCAM נוגדנים. בשלב השני, הפתרון CTC-מועשר מוכתם עבור נוקלאובטים (dapi-חיוביים) תאים המבטא ציטוקרטין (CK)8,18,19, בעוד תאי דם לבנים (wbcs) מזוהים באמצעות ה סמן CD45. לבסוף, תאים שנתפסו ממוקמים על פלטפורמת הקרנה משולבת CTCs מזוהים באמצעות הביטוי של EpCAM, אקס, ו DAPI תוך שלילי עבור CD45. למרות שהדבר נחשב לסטנדרט הזהב לספירת CTC, ניתוח מולקולרי במורד הזרם מאתגר עם טכנולוגיה זו בשל האילוצים הטבועים באחזור CTC. בנוסף, בהינתן הליך הבידוד שלה, CellSearch עשוי להעדיף את העשרת CTCs עם רמות EpCAM גבוהות יותר לעומת CTCs עם ביטוי התחתון EpCAM, בשל למשל סרטן טרוגניות27 או downregulation של סמנים אפיתל 28,29. כדי להתגבר על מגבלות אלה, טכנולוגיות בלתי תלויות אנטיגן להעשרה של CTCs הופיעו. לדוגמה, CTC-ichip משלבת הפרדה הידרודינמית של תאים נוקלאוטיים, כולל ctcs ו-wbcs מרכיבי הדם הנותרים, ולאחריו דלדול אימונוגנטית של נוגדן מתויג wbcs, המאפשר טיהור של ctcs מתויגים וקיימא ב פתרון25. בנוסף, העובדה כי רוב ctcs הם קצת יותר גדול מאשר כדוריות הדם האדומות (rbcs) או wbcs הובילו לפיתוח של טכנולוגיות העשרה מבוססות CTC גודל23,30 (למשל, מערכת parsortix (זווית)) אשר עושה שימוש ב מבוססי מיקרופלואידיג טכנולוגיה, הכוללת ערוץ היצרות על פני קלטת ההפרדה, תאים מובילים לפער מסוף של 10, 8, 6.5 או 4.5 יקרומטר (גדלים שונים זמינים בהתאם לקוטר צפוי של תאים סרטניים היעד). רוב תאי הדם עוברים דרך הפער הצר, בעוד CTCs לכודים בשל גודלם (אבל גם בשל deformability התחתון שלהם) והם, לכן, נשמרים בקלטת. החזרת כיוון הזרימה מאפשרת שחרורו של CTCs שנתפסו, אשר נמצאים במצב בר קיימא ומתאים לניתוח במורד הזרם. באופן עצמאי של הפרוטוקול הנבחר עבור בידוד CTC, עם זאת, הליכים שלאחר העשרה טיפוסי עדיין להניב CTCs כי הם מעורבים עם מספר קטן יחסית של RBCs ו-WBCs, ביצוע ניתוח של CTCs טהור או בצובר מאתגרת. כדי לטפל בבעיה זו, הקמנו זרימת עבודה המאפשרת תפעול CTC ללא הטיה פוטנציאלית שהוצגה על-ידי מזהמים של תאי דם. תוספת של כתמים חיסוניים מראש, עם שילובים משתנה נוגדן, מבדיל CTCs מתאי הדם ואף מאפשר לזהות תת קבוצות CTC עם פרופילים ביטוי משטח-סמן ברורים. זה הליך להתאמה אישית מאוד יכול להיות בשילוב נוסף עם יישומים ספציפיים במורד הזרם.
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המתחילה ממוצר CTC-מועשר (שהושג עם כל טכנולוגיית CTC העשרה של בחירה) ומשלבת מספר גישות כדי לקבל תובנה לביולוגיה של CTC ברזולוציה של תא בודד. בקיצור, זרימת העבודה שלנו מאפשרת זיהוי של CTCs יחיד, אשכולות CTC ו CTC-WBC אשכולות על ידי החיסונית לחיות, ואחריו מיקרומניפולציה תא יחיד וניתוח במורד באמצעות פרוטוקולי vivo culturing לשעבר, תא בודד רצף, ו ב vivo גרורות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1003px;" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:333px;">Anti-human EpCAM-AF488</td>
			<td style="width:145px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:353px;">CST5198</td>
			<td style="width:171px;">clone: VU1D9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X DPBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>no calcium, no magnisium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-wells Ultra-low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-human CD45-BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304041</td>
			<td>clone: HI30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-human EGFR-FITC&#160;</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX11400</td>
			<td>clone: ICR10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-human HER2-AF488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>324410</td>
			<td>clone: 24D2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-mouse CD45-BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103139</td>
			<td>clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BD Vacutainer K2EDTA</td>
			<td>BD</td>
			<td>366643</td>
			<td>for human blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Celector</td>
			<td>ALS</td>
			<td>CC1001</td>
			<td>core unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellD software</td>
			<td>ALS</td>
			<td></td>
			<td>version 3.0</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Micro tube 1.3 mL K3EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.3395.005</td>
			<td>for mouse blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PCR-02-L-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RLT Plus</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>1053393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SUPERase&#160; In RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>&#160;1 U/&#181;L&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of circulating tumor cells for downstream molecular analysis and metastatic potential assessment

דם גרורות המועברות חשבונות עבור מקרי מוות הקשורים לסרטן, כרוך במחזור תאים סרטניים (CTCs) כי הם מצליחים בהקמת גידולים חדשים באתרים מרוחקים. CTCs נמצאים במחזור הדם של חולים כמו תאים בודדים (CTCs יחיד) או כאגרגטים רב-תאיים (אשכולות CTC ו CTC-לבן האשכולות תא דם), עם האחרון המציג יכולת גרורתית גבוה יותר. מעבר לספירה, ניתוח פנומיטיות ומולקולרי הוא חשוב במיוחד כדי לנתח את ביולוגיה של CTC ולזהות פגיעויות שניתן לשאת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של זרימת עבודה הכוללת CTC כתמים ומיקרומניפולציה, התרבות הvivo ex כדי להעריך את יכולות ההתרבות וההישרדות של תאים בודדים, ו ב vivo גרורות-היווצרות assays. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול להשגת הדיסוציאציה של אשכולות CTC לתאים בודדים וחקירה של טרוגניות באשכול. עם גישות אלה, למשל, אנחנו בדיוק לכמת הישרדות ופוטנציאל מתרבים של CTCs יחיד תאים בודדים בתוך אשכולות CTC, מוביל אותנו התבוננות כי תאים בתוך אשכולות להציג הישרדות טוב יותר התפשטות לשעבר תרבויות vivo לעומת CTCs יחיד. בסך הכל, זרימת העבודה שלנו מציעה פלטפורמה כדי לנתח את המאפיינים של CTCs ברמת התא בודד, במטרה לקראת זיהוי של מסלולים הרלוונטיים גרורות והבנה טובה יותר של CTC ביולוגיה.

זרימת העבודה המוצגת מאפשרת הכנת CTCs בודדים, בין CTCs יחיד או מופרדים מאשכולות CTC. CTCs מהחולים או הגידול הנושאת עכברים מועשרים מדם שלם עם שיטות CTC-העשרה זמין ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים נגד סמנים הקשורים לסרטן (למשל, EpCAM, ירוק) ו-WBC ספציפיים סמנים (למשל, CD45, אדום) (איור 1A </...

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment at JoVE.com

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment (Video) | JoVE

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד מכיוון שהוא מאפשר זיהוי ובחירה של תאים בודדים ממאגר של תאים מעורבים לניתוח במורד הזרם הבא ברזולוציית תא יחיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל להפריד תאים סרטניים במחזור בודדים, או CTCs, מתאים בדם עבור מגוון של ניתוח הדורשים טוהר גבוה. התחל בהפעלת תוכנת המיקרומניפולטור והפעלת המיקרומניפולטור.חבר את המיקרומניפולטור למחשב ולחץ על חבר ואתחל התקן כדי לאתחל את הזרוע הרובוטית בשלב המיקרוסקופ. נקה את המשטחים החיצוניים והפנימים של ארון ההגנה עם אתנול וסגור את ארון ההגנה לאחר כל מניפולציה של המכונה כדי להיות מסוגל לתמרן את המכשיר דרך המחשב. התקן נימי זכוכית 20 עד 30 מיקרומטר חדש על הזרוע הרובוטית ושטף שמן מערכת דרך המערכת כדי להסיר את כל הבועות בצנרת.מלאו את מיכל הסטריליזציה אחד עם 70% אתנול, מיכל עיקור שני עם מים סטריליים נטולי גרעין, ואת מיכל החיץ עם PBS סטרילי של Dulbecco. מעקרים את נימי פעמיים עם 70% אתנול ומחליפים את מיכל הסטריליזציה אחד במיכל עיקור שני כדי להשתמש בפונקציית הסטריליזציה כדי לשטוף את נימי במים לפחות שלוש פעמים. בתוכנת micromanipulator, להתחיל ניסוי חדש ולבחור את סוג ניסוי קטיף מן אוטומטי ואת מצבי הבחירה הידנית.הגדר את מגש הסיפון כדי לציין את המיקומים של מיכל הסטריליזציה, מיכל החיץ ומגש ההפקדה, והגדר את הטמפרטורה של מיכלי הנוזל במגש ההפקדה שנבחר לארבע מעלות צלזיוס. מקם לוחית התקשרות אולטרה-נמוכה המכילה את פתרון CTC המשוחרר מתחת למיקרוסקופ בתוך ארון המיקרו-ניהול. מוציאים את המכסה מהצלחת וסגרו את הארון.צנטריפוגה צלחת 384 באר המכיל 20 microliters של תרבות CTC בינוני ל הבאר כדי להבטיח כי המדיום הוא sequestered בחלק התחתון של כל באר ולמקם את הצלחת לתוך המיקום היעד אחד של ארבעת מעלות צלזיוס נבחר מגש הפקדה. בחר ידנית את מטרת המיקרוסקופ לקטוף ואת זמן החשיפה של כל הערוצים הדרושים. בחר הצג נווט הבאר כדי להציג באופן חזותי ולבחור את סוג לוחית האיסוף.לאחר מכן כייל עמדת איסוף באמצע הבאר המכילה את פתרון CTC ללא תאים במרכז שדה המבט. השתמש בחיישן כדי לגעת בעדינות בחלק התחתון של הצלחת עם נימי ולהגדיר את מיקום הטנדר ל 0.05 מילימטרים מעל החלק התחתון של הצלחת. בזהירות להוריד את הזרוע הרובוטית על ידי 10 מיקרומטר בכל פעם, כדי למנוע נזק נימי.בחר את פרמטרי סוג התא והאיסוף. עבור איסוף תא בודד, בחר את המצב הידני. השתמשו בהיגוי כדי לנווט את נימי הזכוכית בתוך הבאר ולה מניחים את נימי על גבי תא אחד של עניין לפחות מילימטר אחד מגבול הבאר.לאחר מכן הוסף חלקיקים באופן ידני ובחר בחר חלקיקים פעילים כדי להתחיל את הקטיף. כאשר כל התאים כבר הרים, צנטריפוגה הצלחת כדי להזרים את התאים בתחתית כל באר. כתמי ביו-אמינו עם נוגדן מולקולת הידבקות בתא אנטי-אפיתל מאפשרים הדמיה של תאים סרטניים בהשעיה עם הבחנה מדויקת מאירועים חיוביים CD45.בידוד CTC מדויק מאופיין בשאיפה של המטרה הרצויה בלבד ללא התאים מזהמים שמסביב. כפי שנחשד, אשכולות CTC להפגין עלייה בהישרדות לעומת CTCs יחיד, מעורר מושבות תאים בתוך 56 ימים של תרבות במבחנה. יש לציין, אשכולות CTC גם להפגין שיעור התפשטות גבוה יותר ובכך להגיע למספרי תאים סופיים גבוהים יותר, המציין כי מגע ישיר עם תאים סרטניים אחרים יש השפעה על הכדאיות של תאים סרטניים וקצב התפשטות.רצף RNA חד-תאי של CTCs מבודד ישירות לחולי סרטן השד חושף שכן סטוכסטי מבוזר T הטבעה של תאים בודדים נגזר CTCs יחיד, אשכולות CTC, או אשכולות תאי דם לבנים CTC. זכור להתקין את נימי הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר בתוך המערכת הנוזלית של המיקרומניפולטור ולכייל את תנוחת האיסוף כדי להבטיח קטיף חד-תאי יעיל. ניתן לזרוע או לעבד את התאים הבודדים עבור רצף הדור הבא כדי לאפשר ניתוח לשעבר vivo ואפיון CTC ברזולוציה של תא יחיד כדי לחקור את התהליך גרורתי.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood (Video) | JoVE

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies (Video) | JoVE

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer (Video) | JoVE

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization (Video) | JoVE

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues (Video) | JoVE

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH (Video) | JoVE

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer (Video) | JoVE

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment (Video) | JoVE

חיסון intramucosal של תאי קרצינומה של תאים קשקשיים עכברים עבור פרופיל החיסונית הגידול והערכת התגובה לטיפול

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids (Video) | JoVE

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research (Video) | JoVE

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...