Name: standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
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这项工作部分得到了荷兰卫生研究与发展组织（ZonMw）的"Meer Kennis会见明德·迪伦"计划（项目号114022501）和荷兰心脏基金会CVON联合体赠款的研究资助。重新。

1. 设备准备
<ol><li>将微流体 384 孔板转移到无菌层流罩。</li>
	<li>取下盖子，使用多通道或重复移液器将50μL的水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）添加到40个观察井（图1b，井B2）中。 注：可以在此处暂停该协议。在室温 （RT） 下将板盖盖留在无菌培养柜中。</li>
</ol>2. 制备凝胶和涂层
<ol><li>准备 2.5 mL 的 10 μg/mL 纤维化（FN） 涂层溶液。在 Dulbecco 的 PBS（dPBS、不含钙和镁）的 2.5 mL 中稀释 25 μL 的 1 mg/mL 纤维素库存溶液。将溶液置于水浴37°C，直至使用。</li>
	<li>制备100μL的胶原蛋白-1溶液。将 10 μL 的 HEPES （1 M） 添加到 10 μL 的 NaHCO3 （37 g/L），并通过移液混合。将管子放在冰上，加入80 μL的胶原蛋白-1（5毫克/mL），产生4mg/mL的中和胶原蛋白-1浓度。使用移液器小心混合，避免气泡形成。</li>
	<li>在每个微流体单元的凝胶入口中加入1.5 μL的胶原蛋白-1溶液（4mg/mL）（图1b，以及B1）。确保凝胶滴放置在每个井的中间，以便凝胶进入通道（参见图2a）。 注：相位导线可防止填充相邻通道，并实现凝胶图案化。正确的凝胶加载可以在明场显微镜下通过"观察窗口"（井 B2）观察半月板形成或倒置板来确认。如果凝胶没有完全填充通道，可以添加额外的1 μL滴。</li>
	<li>将微流体板放入培养箱（37°C，5%CO2）10分钟，以聚合胶原蛋白-1。 注：聚合的时机至关重要;由于微流体中使用的体积小，在孵育15分钟后已经观察到蒸发，从而导致凝胶崩溃或收缩。</li>
	<li>将板从培养箱中拿出来，转移到无菌层流罩。</li>
	<li>在每个微流体单元的顶部灌注通道的出口井中加入50 μL的10μg/mL FN涂层溶液（图1b，以及A3）。将移液器尖端按在井侧，以正确填充井，而不会捕获气泡（参见图 2b）。通道应加注，液体应固定在出口（井 C1）上，且未加注出口。</li>
	<li>将板放入培养箱（37°C，5% CO2）至少2天。 注：该协议可以在这里暂停，因为胶原蛋白-1凝胶与涂层混合物在培养箱中稳定至少5天。如果涂层混合物被刷新，可能会有更长的周期，但这一点尚未经过测试。关键的是FN涂层的水平，因为这样可以防止胶原蛋白-1凝胶的脱水。</li>
</ol>3. 细胞播种/微容器培养
<ol><li>将5 mL的胎儿小牛血清和2.5 mL的笔/链条添加到500 mL的基底内皮细胞培养培养基，并使用0.22 μm孔径的瓶顶过滤器进行过滤灭菌。这种介质现在称为基础介质。</li>
	<li>准备血管生长介质：将3μL的50μg/mL血管内皮生长因子（VEGF）和2μL的20μg/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）加入5 mL的基础培养基。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中快速解冻冷冻的 iPSC-EC（<1 分钟），并转移到 15 mL 管中，在 10 mL 的基础介质中稀释。</li>
	<li>计算单元格数。 注：单个小瓶在 0.5 mL 中包含 100 万个细胞，可超过 90% 的生存能力。</li>
	<li>在100 x g下离心管5分钟。吸气上清液不干扰细胞颗粒，并在基底培养基中重新悬浮，产生2 x 107细胞/mL的浓度。</li>
	<li>微流体 384 孔板从培养箱转移到无菌层流罩。</li>
	<li>从灌注注入液中吸出 FN 涂层溶液（井 A1）。在进气井中加入25 μL的基底介质（井A1）。</li>
	<li>在每个顶部灌注口孔中加入1μL细胞悬浮液滴（图1b，以及A1）。滴应在几秒钟内平展（参见图3a，b，以说明这种"被动泵送"方法）。 注：在显微镜下检查播种是否均匀。如果没有，在出口中再添加 1 μL，然后等待水滴变平。</li>
	<li>在37°C下孵育微流体井板1小时，CO2为5%。在此之后，细胞应该附着。如果没有，请再等 30 分钟。</li>
	<li>从顶部灌注口井中取出基底介质（图1b，井A3）。在顶部灌注进液和出口中加入暖容器培养基（图1b，井A1和A3）。将板放在摇臂平台上（设定在 7° 角度，8 分钟摇动间隔）的培养箱（37°C，5% CO2）。</li>
	<li>使用在播种后的第 1 天和第 2 天的自动阶段使用明场显微镜对板进行成像，以确认细胞的存活性。2天后，对胶原蛋白-1支架应形成一个汇合单层。 注：如果通道看起来不均匀地汇入，微容器可以再培养24小时。</li>
</ol>4. 研究血管生成发芽，包括尖和茎细胞形成
<ol><li>通过补充基基培养基，补充4.5 μL的VEGF（50μg/mL库存），4.5 μL的phorbol 12-myristate-13-醋酸酯（PMA）（2微克/mL库存），以及2.25μL的磷酸磷酸（S1P）（1mM） ，制备4.5 mL的血管生成发芽介质。</li>
	<li>制备8.5 mL的容器生长介质（基底介质辅以30纳克/mL VEGF和20纳克/mL bFGF）。</li>
	<li>从井中吸气介质，在顶部灌注进液和出口井以及凝胶入口和出口井中加入50μL的新鲜血管培养基（图1b，井A1、A3、B1和B3）。</li>
	<li>将50μL的血管生成芽混合物加入每个底部灌注通道入口和出水口（图1b，水井C1和C3）。</li>
	<li>将设备放回培养箱（37°C，5% CO2）的摇臂平台上，以形成血管生成生长因子的梯度。</li>
	<li>使用具有自动阶段的明场显微镜在添加血管生成因子后 1 天和 2 天的图像。 注：继续培养微血管以研究血管病（转到第 5 节），或在第 2 天和第 6 天修复和染色微血管，以量化发芽长度和形态（转到第 6 节）。</li>
</ol>5. 研究阿纳托莫病和芽稳定
<ol><li>使用具有自动级的明场显微镜进行成像。</li>
	<li>在顶部灌注进液（图1b，井A1）中加入1μL荧光标记白蛋白（0.5mg/mL），并使用50μL移液器混合。</li>
	<li>将板转移到荧光显微镜上，自动级和培养箱设置在37°C。将显微镜设定在10倍物位和正确的暴露设置（例如，四甲基二甲胺[TRITC]通道，20ms曝光）。每分钟获取延时图像 10 分钟。</li>
	<li>从显微镜中取出板，并将板转移到无菌层流罩。</li>
	<li>从井中取出所有介质，并更换相应井中的容器培养基和血管生成发芽介质（参见步骤 4.3 和 4.4）。</li>
	<li>将设备放回培养箱（37°C，5% CO2），以继续血管生成。</li>
	<li>重复步骤 5.1_5.6，以研究第 6 天的渗透性。</li>
</ol>6. 固定、染色和成像
<ol><li>从所有井中吸出所有文化介质。 注：微流体通道中的残余介质或液体由于其1⁄2 μL的低体积，不会影响固定。</li>
	<li>在PBS中向所有灌注（图1b、A1和C1）和出口井（图1b、A3和C3）中加入25μL的4%甲醛（PFA）。在RT处孵育10分钟。将设备置于轻微角度（±5°）下以诱导流量（例如，将板的一侧放在盖子上）。</li>
	<li>从井中吸出PFA。用汉克的平衡盐溶液（HBSS）50μL清洗所有灌注和出口两次。从井中吸出 HBSS。</li>
	<li>在RT处渗透10分钟，在所有灌注液和出口中加入50μL的0.2%非离子表面活性剂。</li>
	<li>从井中吸出非离子表面活性剂。将 50 μL 的 HBSS 添加到所有灌注液槽和出口井中，将灌注通道洗涤两次。从井中吸出 HBSS。</li>
	<li>在哈佛商学院中使用霍赫斯特（1：2，000）和F-actin使用phalloidin（1：200）染色核。为 40 个单位准备 2.2 mL，并在每个灌注进液和出口中加入 25 μL。将板置于轻微角度下，在 RT 下孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>在所有灌注入口和出口中用50μL的HBSS洗涤两次。</li>
	<li>使用具有自动舞台的荧光显微镜直接成像，或将防光板存放在 4°C，以便日后使用。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes.">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).</li><li>Kim, S., Chung, M., Jeon, N. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).</li></ol>

P. Vulto和T.Hankemeier是米米塔斯BV的股东。V. 博格多夫和A.雷耶克尔克是Ncardia BV的雇员。范杜伊宁、W.斯塔姆、V.V.奥尔洛娃和A.J.范宗内维尔德没有披露。

该方法描述了40个可渗透内皮微血管在一个强大且可扩展的微流体细胞培养平台中的培养。与传统 2D 和 3D 细胞培养方法相比，该方法展示了如何将一种生理相关的细胞微环境（包括梯度和连续灌注）与具有足够吞吐量的 3D 细胞培养相结合，以进行筛选目的。
与同类微流体测定相比，该方法的主要优点之一是，该方法不依赖泵进行灌注，而是使用摇臂平台同时诱导所有微流体单元的连续灌注。这可确保测定可靠且可扩展：板可以堆叠在摇臂平台上。重要的是，所有微流体单位都保持可单独寻址，这使得这种方法可以在药物筛选中实现，包括生成剂量-反应曲线。此外，如果没有泵，成像和介质更换要简单得多，而且（交叉）污染的风险更低。
这种方法的另一个优点是使用标准化的预制造平台，而类似的微流体细胞培养平台需要由最终用户制造。这种可用性有助于在其他学术和制药研究集团中采用此测定，从而达到标准化。此外，与微流体原型不同，384 孔板接口可确保与当前实验室设备（例如吸气器、板处理机和多通道移液器）兼容，从而促进当前筛选基础设施中的集成.
执行此测定有几个关键步骤。胶原蛋白-1凝胶应完全填充凝胶通道。在凝胶加载过程中，可以通过观察窗口（图2a）或倒置板检查微流体通道（如图1a）来观察这种填充物（如图1a所示）。填充时，胶原蛋白凝胶应保持在中心通道中，不得流入相邻的灌注通道。我们注意到胶原蛋白-1凝胶的质量对于正确的测定性能至关重要。粘度过高的胶原蛋白-1批次会导致凝胶通道的不完全填充。在37°C下聚合10分钟后，凝胶应均匀且清晰。如果胶原蛋白-1不能正确储存（例如，由于冰箱温度波动），胶原蛋白将在通道内聚合，形成清晰可见的纤维。这可能导致在未添加血管生成因子的情况下侵入凝胶，但没有适当的流明发育。
当细胞播种时，纤维素涂层溶液从井中取出，只留下充满涂层溶液的微流体通道。从微流体通道吸入涂层溶液可能会导致凝胶中断或凝胶吸入。电池悬架需要更换/更换此涂层溶液。当使用被动泵送方法播种细胞悬浮液时，这种方法效果最佳，因为直接将细胞悬浮液移入通道表明可重现的种子密度较低。
由于微血管在凝胶上形成稳定的单层，这些小差异只会导致达到汇合所需的不同时间。因此，测定起始点是由汇合时间而不是区域性时间决定的。如有必要，可以延长培养时间，直到对凝胶形成清晰的单层。
在井内，气泡可能由于油井的填充不正确而卡住（参见图 2b）。这些气泡将限制介质的流动，即使设备放置在摇臂平台上，并导致微容器崩溃和不当的梯度形成。将移液器尖端压在井的侧壁上，将提高完全注满井的成功。如果气泡被困在井内，可以通过轻轻地将无菌移液器尖端插入玻璃底部来将其拆下。微流体通道内也可能出现气泡。从井中取出介质后，介质在 30 分钟后从微流体通道中明显蒸发（由于通道内的微升体积）。因此，最好尽可能快地进行介质变化。当介质在蒸发介质的通道中添加时，气泡将滞留在微流体通道内。通过将 P20 移液器直接放置在入口或出口上，并迫使介质从相反的油井穿过微流体，可以手动去除微流体通道内的这些气泡。成功去除气泡会导致另一口井的体积小幅但明显下降。表 1列出了常见错误以及如何排除这些错误。
当需要连续成像时，缺少泵是一个限制，因为摇臂平台将用户限制按顺序时间间隔进行成像。此外，该平台中的介质灌注包括具有低水平剪切应力的双向流动，而体内的血管暴露于具有较高剪切应力水平的单向流动中。虽然我们不观察到双向流动对血管生成的负面影响，但流量是重要的生物力学刺激，最好是受控的。然而，虽然有市售的泵设置，与384孔板的接口仍然具有挑战性，泵设置严重阻碍了此测定的可扩展性。
使用iPSC-ECs研究血管生成的可能性为疾病建模和药物研究开辟了新的机会。与初级EC相比，这些细胞可以产生几乎无限的数量与稳定的基因型，通过使用基因组编辑技术，细胞可以生成，包括基因敲除和敲撞。然而，由于将 EC 与 iPSC 区分的协议相对较新，因此仍不清楚是什么导致 iPSC-EC 最能反映主要 EC，以及正在或可以生成哪些子类型的 EC。此外，关于它们的相关性仍然存在问题。例如，iPSC-EC 是否仍然表现出内皮细胞的典型可塑性？iPSC衍生细胞对细胞微环境的反应和相互作用的程度如何？此处提供的标准化平台可用于回答其中一些问题，以进一步验证 iPSC 衍生的 E 在体外的使用。
这种测定最直接的未来方向是整合在血管生成过程中发挥重要作用的其他细胞类型，如围细胞和巨噬细胞。这将有助于研究巨噬细胞在芽间麻醉或毛细管形成后围虫的依依性中的作用的能力。此外，还可以培养细胞外基质内部或针对细胞外基质的各种其他细胞类型（例如，我们已经显示了神经元和各种上皮结构（如近端小管和小肠）的培养，这些结构可与血管结合使用此方法生成的床。最后，研究合成水凝胶中的血管生成发芽将很有趣，因为其定义的成分进一步增加了测定的标准化，并允许调整影响细胞-基质相互作用的刚度和结合动机。
总之，该方法显示了iPSC衍生的EC在标准化和可扩展的3D血管生成测定中的可行性，该检测将生理相关培养条件结合在具有集成于其中所需的鲁棒性和可扩展性的平台上药物筛查基础设施。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 &#181;L of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 &#181;L of basal medium in the outlet well (well A3).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

体外模型在血管疾病新药靶点的发现和验证中起着至关重要的作用。然而，目前具有足够通量的体外筛选模型只有有限的生理相关性1，这阻碍了从体外到体内的发现翻译。因此，为了推进临床前血管药物研究，必须改进血管体外模型，将高通量筛查与生理相关的3D细胞微环境相结合。
在过去十年中，在提高血管体外模型的生理相关性方面取得了重大进展。内皮细胞可以嵌入3D支架，如纤维蛋白和胶原胶2，而不是培养在平坦表面（如组织培养塑料）上的内皮细胞。在这些基质中，内皮细胞表现出与基质降解和流明形成相关的更生理相关的表型。然而，这些模型只演示了血管生成过程中发生的许多过程的子集，因为细胞微环境的重要线索仍然缺乏。
微流体细胞培养平台特别适合进一步提高血管体外模型的生理相关性。例如，内皮细胞可以暴露于剪切应力，这是血管的重要生物力学刺激。此外，在微流体中空间控制流体的可能性允许形成生物分子梯度3，4，5，6。这种梯度在血管生成过程中的形成和模式形成过程中在体内起重要作用。然而，尽管微流体细胞培养平台在传统的2D和3D细胞培养方法中表现出无与伦比的生理相关性，但它们往往缺乏药物筛选所需的必要吞吐量、可扩展性和标准化7.此外，其中许多平台没有商业上，并要求最终用户在使用8之前对其设备进行微结构。这不仅需要制造设备和技术知识，而且限制了质量控制水平，对可重复性有负面影响9。
迄今为止，人类原发性内皮细胞仍然是在体外10中模拟血管生成的最广泛使用的细胞源。然而，原发性人类细胞有一些限制，阻碍其在筛选方法中的日常应用。首先，扩大和扩大初级细胞衍生培养物的可能性有限。因此，对于大规模实验，需要使用来自不同捐赠者的批次，从而导致基因组差异和批次到批次的变化。第二，经过几段后，原发内皮细胞在体外培养时一般会失去相关特性。
来自人类诱导多能干细胞（iPSC）的内皮细胞是一种有前途的替代细胞：它们类似于原发细胞，但基因型更稳定，也适合精确的基因组编辑。此外，iPSC能够自我更新，因此可以无限量地扩展，这使得iPSC衍生细胞成为原体细胞的有吸引力的替代品，用于体外筛选模型13。
在这里，我们将一种在标准化、高通量微流体细胞培养平台中将内皮细胞培养为可渗透的3D微容器的方法。通过将设备放置在摇臂平台上来应用灌注，确保稳健的操作并提高测定的可扩展性。由于微血管不断注入并暴露于血管原性因子的梯度，血管生成在更生理相关的细胞微环境中进行了研究。虽然该协议与许多不同的（初级）内皮细胞14、15源兼容，但我们专注于使用人类iPSC衍生的ECs，以提高这种测定的标准化，并促进其集成在血管药物研究。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-10 &#956;L Electronic repeater pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z654566-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-lane OrganoPlate</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td>4003-400B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal culture medium</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-1</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Biopur 2.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Repeater M4 pieptte</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4759-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3569</td>
			<td>10 mg/mL solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-derived endothelial cells</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>37 g/L in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td></td>
			<td>Rocker platform used to provide flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Focus-Biomolecules</td>
			<td>10-2165</td>
			<td>2 &#956;g/mL in PBS containing 0.1% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1P</td>
			<td>Ecehelon Biosciences</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>1 mM in methanol containing 1% acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32-10</td>
			<td>50 &#956;g/mL in water containing 0.1% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro

血管疾病的临床前药物研究需要血管体外模型，可以修改为高通量筛查。然而，目前具有足够通量的体外筛选模型只有有限的生理相关性，这阻碍了从体外到体内的发现翻译。另一方面，微流体细胞培养平台在体外表现出无与伦比的生理相关性，但往往缺乏所需的吞吐量、可扩展性和标准化。我们展示了一个强大的平台，用于研究从人类诱导多能干细胞（iPSC-ECs）中提取的内皮细胞在生理相关细胞微环境中的血管生成，包括灌注和梯度。iPSC-EC 被培养为 40 个注入 3D 微容器，用于对图案胶原蛋白-1 支架。在应用血管生成因子梯度后，可以研究血管生成的重要特征，包括分化为尖端和茎细胞以及可渗透流明的形成。用荧光示踪染料灌注，有助于研究血管生成芽的抗氧化期间和之后的渗透性。总之，该方法显示了iPSC衍生的EC在标准化和可扩展的3D血管生成测定中的可行性，该检测将生理相关培养条件结合在具有集成于其中所需的鲁棒性和可扩展性的平台上药物筛查基础设施。

微流体3D细胞培养平台由40个渗透微流体单位（图1a，b）组成，用于研究灌注微血管在图案胶原蛋白-1凝胶上的血管生成（图1c）。这些微血管不断注入，并暴露于血管生成生长因子的梯度（图3a-d）。血管生成芽可以在梯度暴露后2天研究，或在梯度暴露后培养超过5天，以研究抗虫病和芽稳定（见时间线，图1d）。
使用被动泵送方法播种 iPSC-EC 应会导致均匀的种子密度（图 4a，b）。连续灌注下培养在2天内形成融合微血管，细胞完全衬砌微流体通道的周长，形成对图案胶原蛋白-1凝胶的汇合单层。
暴露于血管生成因子的梯度导致图案胶原蛋白-1凝胶内的微血管定向血管发芽（图5a-g）。在加入血管生成梯度后24小时，透明尖端细胞的形成和侵入胶原蛋白-1凝胶是可见的，而包括流明形成在内的茎细胞在48小时后可见（图5a）。
固定和染色后，毛细管网络可以使用phalloidin来染色F-actin，并使用Hoechst 33342染色细胞核（图5b，c）。这些芽可以量化（例如，形状和长度14）。如果不添加生长因子，不应观察到侵入胶原蛋白-1凝胶（图5d）。共聚焦成像用于确定发芽直径和确认流明形成（图5e-g）。
芽继续向梯度方向生长，并在添加血管生成因子后3~4天内到达相反的灌注通道。这导致血管网络的重塑，血管生成芽的数量明显减少（图6a）。流明的形成是通过灌注血管网络与荧光标记大分子（例如，白蛋白或德克斯特兰）评估。在抗虫病前后用0.5mg/mL标记的白蛋白对微血管进行渗透，发现10分钟后发芽渗透性有明显差异（图6b-e），这表明毛细血管在抗虫病后稳定并成熟。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig1.jpg"> 图1：iPSC衍生微容器的微流体细胞培养方案。（a） 微流体细胞培养装置的底部显示 384 孔板下集成的 40 微流体单元。较大的视图显示 40 微流体单元之一。（b） 每个微流体单元位于 9 口井下方，有 3 口井和 3 口井。微流体通道由山脊（"相导"）分隔，使水凝胶在中央通道（"凝胶通道"）中的图案，同时仍然与相邻的通道（"灌注通道"）接触。（c） 在微流体装置内培养注入微容器的方法，用于研究梯度驱动血管生成通过图案胶原蛋白-1基质发芽的方法。（d） 研究血管生成和/或血管化的时间轴。这个数字已由范杜伊宁等人14日修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig2.jpg"> 图2：凝胶和介质的加载程序。（a） 正确和不正确的凝胶沉积示例。正确的归档导致中间通道中有图案的胶原蛋白-1凝胶，随后进行聚合。（b） 井口正确和不正确的填充示例。井被填充1⁄4的顺序，以防止在微流体通道内出现气泡陷印。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig3.jpg"> 图3：连续静液压驱动流量和梯度稳定。（a） 井之间的静液压压力差异导致微流体通道内的被动水平和流动。（b） 将器件放置在设置为 7° 和 8 分钟循环时间的摇臂平台上，可在微流体通道内连续、双向灌注。（c） 梯度通过在井内引入两种不同的浓度而形成，通过被动水平来持续刷新。（d） 使用氟素等子素 （FITC） -dextran 的梯度可视化。双向流动将梯度稳定到3天。刻度条 = 200 μm。这个数字已由范杜伊宁等人14日修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig4.jpg"> 图4：细胞播种的被动泵送方法.（a）被动泵送是由表面张力差异引起的压力差异驱动的.这将导致液滴（高内部压力）流向储液罐（低内部压力）的流量。（b） 放置在微流体通道入口（白色轮廓）顶部的液滴（灰色轮廓）的时移（蓝色轮廓）。加法后（图4b，i），入口顶部的滴缩小（图4b，ii：1s后加;iv：加后2s），导致流向出口。这一直持续到液滴半月板被入口固定（图4b，iv）。比例尺 = 400 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig5.jpg"> 图5：iPSC-EC微容器的强健3D发芽。（a） 随着时间的推移，iPSC-EC 的发芽。微血管生长48小时（右），然后用含有50纳克/mL VEGF、500 nM S1P和2纳克/mL PMA的血管生成鸡尾酒刺激。侵入胶原蛋白1支架（中间）的第一个尖端细胞在暴露后24小时可见。第一个流明在曝光后 48 小时可见（箭头），而尖端细胞在渐变方向上进一步迁移。（b） 用VEGF、S1P和PMA刺激的15个微容器的阵列，2天，并染色为F-actin（黄色）和核（蓝色）。刻度杆 = 200 μm. （c） 刺激微容器 （正控制）。（d） 未刺激微容器（负控制）。（e） 凝胶内单毛细管的最大投影。（f） 与 （g） 相同， 但集中在中间.虚线表示正交视图在面板 g 中的位置。 比例尺（a-d：200 μm;e-g：20 μm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig6.jpg"> 图6：血管生成芽渗透前后的可视化。（a） 具有基源通道的Anastomosis可触发血管生成芽的修剪和成熟。毛细管床在刺激后2、4、6和7天与血管生成生长因子的特写。（b） 血管生成芽在加入血管生成因子2天后出现。血管生成芽在凝胶内形成，但尚未连接到底部灌注通道。（c） 用0.5mg/mL白蛋白-Alexa555溶液灌注微容器。荧光图像在0和10分钟（d，e）获得，与小组b和c相同，但经过7天的刺激。喷出物连接到另一侧，在基底灌注通道中形成一个融合微容器。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>问题</td>
			<td>原因</td>
			<td>解决 方案</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">胶原蛋白-1未完全进入或填充通道</td>
			<td>胶原蛋白-1 滴滴未放置在入口顶部</td>
			<td>小心地将水滴放在凝胶通道入口的顶部</td>
		</tr>
<tr>
<td>胶原蛋白-1体积过低</td>
			<td>使用 1.5 μL 的凝胶完全填充通道</td>
		</tr>
<tr>
<td>胶原蛋白-1太粘稠</td>
			<td>使用另一批胶原蛋白-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>胶原蛋白-1流入灌注通道</td>
			<td>胶原蛋白-1直接移入凝胶通道入口</td>
			<td>小心地将水滴放在凝胶通道入口的顶部</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">胶原蛋白-1不清晰/纤维形成</td>
			<td>胶原蛋白-1储存不当</td>
			<td>将胶原蛋白-1储存在4°C，不要冷冻</td>
		</tr>
<tr>
<td>在添加胶原蛋白-1之前，NaHCO3和 HEPES 没有很好地混合</td>
			<td>在添加胶原蛋白-1 之前，通过移液仔细混合 NaHCO3和 HEPES</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">使用被动泵送方法不会收缩滴</td>
			<td>滴附在井的一侧</td>
			<td>吸气滴，并在入口顶部添加新的滴</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>确保出口井中至少装有 20 μL 的介质</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">未观察到发芽</td>
			<td>未添加生长因子或未正确存储等分</td>
			<td>准备新鲜的血管生成培养基</td>
		</tr>
<tr>
<td>气泡块灌注/梯度形成</td>
			<td>使用 P20 或 P200 移液器清除气泡</td>
		</tr>
<tr>
<td>井间的体积差异</td>
			<td>所有井中的体积需要相等才能形成线性梯度</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">细胞不可行</td>
			<td>未放置在摇臂平台/摇臂平台上的板已关闭</td>
			<td>确保摇臂平台已打开，并且具有正确的循环时间/角度（8 分钟/7°）</td>
		</tr>
<tr>
<td>由于存在气泡，无法灌注</td>
			<td>使用 P20 或 P200 移液器清除气泡</td>
		</tr>
<tr>
<td>没有流明形成，细胞作为单个细胞迁移</td>
			<td>在形成单层之前加入血管生成发芽混合物</td>
			<td>再等24小时，再加入血管生成生长因子</td>
		</tr>
<tr>
<td>发芽密度的主要变化</td>
			<td>播种后细胞密度的差异</td>
			<td>检查细胞密度是否均匀，并在微流体单位之间比较。如有必要，再添加一滴细胞悬浮液</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1：排除常见错误。

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Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

该方法将iPSC衍生内皮细胞的培养描述为标准化微流体平台中的40个注入3D微容器。该平台支持在3D中研究梯度驱动的血管生成，包括以可扩展的高通量方式血管生成芽的血管生成和稳定。

标准化和可扩展的测定，以研究iPSC衍生内皮细胞在Vitro的渗透3D血管生成发芽

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

这种体外测定在高通量和可扩展的平台上演示了血管生成发芽。这可以用来在血管生成中寻找新的靶点。此血管生成测定结合了复杂的细胞微环境，包括梯度和灌注与与高通量筛选兼容的平台。血管生成在健康和疾病中都起着重要作用。了解血管生成过程中发生的机制可以帮助我们了解癌症是如何生长的以及组织如何修复的。该方法可以深入了解心血管疾病和组织再生过程中的机制。在这两个中，血管生成起着重要的作用。对于首次使用这种微流体平台，您需要了解体积定律以及如何移液。您可以通过在显微镜下观察或倒置盘子来确认步骤。当只阅读方法时，有些步骤很难得到感觉，例如微流体通道有多小，或者如何握住盘子。演示这些程序的将是温迪·斯塔姆，一个来自我们实验室的技术人员。首先，将微流体 384 井板转移到无菌层流罩中。使用多通道移液器，取下盖子，将 50 微升水或磷酸盐缓冲盐水添加到 40 个观察井中。然后向每个微流体单元的凝胶入口添加 1.5 微升，每毫升胶原蛋白 4 毫克。确保凝胶液滴放置在每一个井的中间，以便凝胶进入通道。填充五个微流体单元后，将板倒置，以目视检查凝胶通道的正确填充。将微氟板放在37摄氏度的培养箱中，将5%的二氧化碳放置10分钟，以聚合胶原蛋白。然后将板从培养箱中取出，转移到无菌层流罩中。在每个微流体单元顶部灌注通道的出水口井中加入 50 微升，每毫升纤维素编码溶液为 10 微克。将移液器尖端压在井的一侧，以正确填充井，而不会捕获气泡。通道充满，出口上的液体盘没有填充出口。然后将盘子放在孵化器中至少两天。现在，在37摄氏度的水浴中快速解冻冷冻的IPSC-DC不到一分钟。然后将细胞转移到15毫升管中，然后慢慢加入10毫升的基础介质以稀释。绘制溶液的 10 微升，并计算单元格计数器上的单元格。将管子以100倍g离心5分钟。吸升液而不干扰细胞颗粒，并在基底介质中重新暂停，每毫升产生2倍10至第七细胞的浓度。接下来，将微流体384井板从培养箱转移到无菌层流罩。从灌注口吸出纤维素编码溶液，并在出水口中加入25微升基底介质。在每个顶部灌注进气口中加入一个微升的细胞悬浮液滴。液滴在几秒钟内变平。在显微镜下检查播种是否在单个通道内和通道之间是均匀的。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育微流体井板1至1.5小时。之后，检查细胞，以确认它们已粘附。从顶部灌注出口井中拆下基底介质。在顶部灌注入口和出口中加入温暖的容器培养介质。将板放在摇杆平台上，该平台设定在 7 度角和 8 分钟摇点间隔内。在第一天和播种后的第二天，使用 Brightfield 显微镜与自动阶段成像板，以确认细胞的生存能力。两天后，一个汇合单层对胶原蛋白形成了一个脚手架。首先，用4.5微升VEGF库存、4.5微升PMA库存和2.25微升S1P库存补充4.5毫升基础介质，准备4.5毫升的血管生成发芽介质。用5.1微升VEGF和3.4微升的BFGF补充基底介质，准备8.5毫升的容器生长介质。从井中吸出培养剂，在顶部灌注进气口和出口井以及凝胶进气井和出口井中加入50微升新鲜容器培养介质。然后将50微升的血管发芽混合物添加到每个底部灌注通道入口和出口孔中。将板放回摇杆平台上的培养箱中，形成血管生长因子的梯度。在添加血管生成因子的一天和两天后，使用 Brightfield 显微镜在自动舞台上对油井进行成像。为了研究阿托莫病和芽稳定，在顶部灌注入口中加入每毫升0.5毫克的微升荧光标记白蛋白。然后将溶液与 50 微升移液器混合。将板转移到荧光显微镜上，自动舞台和培养箱设定在摄氏37度。将显微镜设置为 10 倍目标，并纠正曝光设置。每分钟获取延时图像 10 分钟。从显微镜上取下板，将板转移到无菌层流罩中。从井中去除所有介质，并更换相应井中的容器培养介质和血管发芽介质。将微流体板放回培养箱中，继续血管生成发芽。第六天，重复成像以研究渗透性。要修复细胞培养，请从井中吸出所有培养媒体。在 PBS 中加入 25 微升 4%PFA，加入所有灌注进气口和出口井。然后将微流体板的一侧以五度的轻微角度放在盖子上，以诱导流动。在室温下孵育10分钟。之后，从井中吸入PFA。用 50 微升 HBSS 洗涤所有灌注液和插座两次。然后从井中吸出HBSS。甲醛是一种危险化学品，应戴手套处理，且仅在烟罩中打开。接下来，在所有灌注输液和出口中加入50微升0.2%非离子表面活性剂，在室温下渗透10分钟，并将微流体板以5度的轻微角度放在盖子上。从油井中吸出非离子表面活性剂，通过在所有灌注进气孔和出口井中加入 50 微升 HBSS 来清洗灌注通道两次。从井中吸出 HBSS。准备 Hoechst 1，000 到 2，000 染色核，并准备 Phs 中的 Phaloidin 100 到 200 染色 F-actin。将六毫升的哈佛商学院、30微升的F-actin和3微升的霍赫斯特混合在猎鹰管中。然后在每个灌注进气口和出口井中加入25微升。将板放在一个轻微的角度下，在室温下孵育至少30分钟。在所有灌注输液口和插座中用 50 微升 HBSS 洗涤两次。然后直接成像使用荧光显微镜与自动阶段或存储板保护免受光在四摄氏度以后使用。在此协议中，微血管不断被注入并暴露在血管生长因子的梯度中。使用无源泵送方法播种 IPSC-DC 可产生均匀播种密度。放置在微流体通道入口顶部的液滴的延时显示加法后的水滴，加法后在进气管上滴，直到液滴半月板被入口固定，导致流向出口。暴露于血管生成因子的梯度导致一种凝胶内的微血管定向性血管发芽。清除尖端细胞形成和入侵胶原蛋白一凝胶在添加血管生成梯度后24小时可见，而包括流明形成在内的库存细胞在48小时后可见。固定和染色后，这些芽的形状和长度被识别。然而，如果没有增加生长因子，没有进入胶原蛋白一凝胶被观察到。通过共声成像，确定了芽直径，确定了流明的形成。这种方法可用于筛选新的血管生成抑制剂。这可能有助于找到治疗糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎和癌症的新疗法。我们目前正在探索如何创造共同文化，包括血脑屏障和血管化器官的模型。

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