Name: standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Dit werk wordt deels ondersteund door een onderzoeksbeurs uit het programma ' meer kennis met minder dieren ' (projectnummer 114022501) van de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en-ontwikkeling (ZonMw) en de Nederlandse Hartstichting CVON consortium Grant Sluit.

1. voorbereiding van het apparaat
<ol><li>Breng de microfluïdische 384-put plaat over naar een steriele laminaire stroming.</li>
	<li>Verwijder het deksel en voeg 50 μL water of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan elk van de 40 observatie putten (Figuur 1b, goed B2) met behulp van een meerkanaals of repeterende pipet. Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Laat de plaat met het deksel in de steriele cultuur kast bij kamertemperatuur (RT).</li>
</ol>2. gel en coating klaarmaken
<ol><li>Bereid 2,5 mL van 10 μg/mL fibronectin (FN) coating oplossing. Verdun 25 μL van 1 mg/mL fibronectin stockoplossing in 2,5 mL van de PBS van Dulbecco (dPBS, calcium en magnesium vrij). Plaats de oplossing in het waterbad bij 37 °C tot het gebruik.</li>
	<li>Bereid 100 μL collageen-1 oplossing voor. Voeg 10 μL HEPES (1 M) toe aan 10 μL NaHCO3 (37 g/L) en meng door Pipetting. Plaats de buis op ijs en voeg 80 μL collageen-1 (5 mg/mL) toe om een neutraliseerde collageen-1 concentratie van 4 mg/mL te leveren. Gebruik een pipet om voorzichtig te mengen en Vermijd de vorming van bubbels.</li>
	<li>Voeg 1,5 μL collageen-1-oplossing (4 mg/mL) toe aan de gelinlaat van elke microfluïdische eenheid (Figuur 1b, goed B1). Zorg ervoor dat de druppel gel in het midden van elk goed wordt geplaatst, zodat de gel het kanaal binnenkomt (Zie Figuur 2a). Opmerking: Phaseguides voorkomen het vullen van de aangrenzende kanalen en maakt gel-patronen mogelijk. Correcte gel-belasting kan worden bevestigd onder een brightfield-Microscoop door de meniscus-formatie te observeren via het ' observatie venster ' (goed B2) of door de plaat ondersteboven te spiegelen. Als de gel het kanaal niet volledig vult, kan een extra druppeltje van 1 μL worden toegevoegd.</li>
	<li>Plaats de microfluïdische plaat in een incubator (37 °c, 5% Co2) gedurende 10 min tot een collageen-1. Opmerking: Timing van de polymerisatie is cruciaal; vanwege de lage volumes die worden gebruikt in microfluïdica, kan de verdamping al worden waargenomen na 15 minuten incubatie, wat resulteert in gel ineenstorting of krimp.</li>
	<li>Haal de plaat uit de incubator en breng deze over in een steriele laminaire stroming.</li>
	<li>Voeg 50 μL van 10 μg/mL FN-coating oplossing toe aan de uitlaatklep van het bovenste perfusie kanaal van elke microfluïdische eenheid (Figuur 1b, goed a3). Druk de pipetpunt tegen de zijkant van de put voor de juiste vulling van de put zonder luchtbellen te vangen (Zie Figuur 2b). Het kanaal moet vullen, en de vloeistof moet pinnen op het stopcontact (goed C1) zonder de uitlaat goed te vullen.</li>
	<li>Plaats de plaat gedurende ten minste 2 dagen in de incubator (37 °C, 5% CO2). Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken, omdat de collageen-1-gel samen met het coating mengsel gedurende ten minste 5 dagen in de incubator stabiel is. Als het coating mengsel wordt ververst, kunnen langere perioden mogelijk zijn, maar dit is niet getest. Cruciaal is het niveau van FN-coating, omdat dit de uitdroging van de collageen-1-gel voorkomt.</li>
</ol>3. Celseeding/Microvat cultuur
<ol><li>Voeg 5 mL foetaal kalf serum en 2,5 mL pen/STREP toe aan 500 mL basale endotheliale celkweekmedium en filter steriliseren met behulp van een fles topfilter met een poriegrootte van 0,22 μm. Dit medium wordt nu aangeduid als basale medium.</li>
	<li>Bereid vasculaire groeimedium: Voeg 3 μL van 50 μg/mL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en 2 μL van 20 μg/mL basis fibroblast groeifactoren (bFGF) toe aan 5 mL Basaal medium.</li>
	<li>Dooi de bevroren iPSC-ECs snel (< 1 min) in een 37 ° Cwaterbad en breng over in een buis van 15 mL en Verdun in 10 mL Basaal medium.</li>
	<li>Tel de cellen. Opmerking: Een enkele injectieflacon bevat 1.000.000 cellen in 0,5 mL met > 90% levensvatbaarheid.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 5 min. aspirate supernatant zonder verstoring van de celpellet en respenderen in Basaal medium om een concentratie van 2 x 107 cellen/ml te geven.</li>
	<li>Breng de microfluïdische 384-put plaat van de incubator over in een steriele laminaire stroming.</li>
	<li>Aspirate FN-coating oplossing van de perfusie inlaat (goed a1). Voeg 25 μL Basaal medium toe aan de inlaat putjes (goed a1).</li>
	<li>Voeg een druppel van 1 μL celsuspensie toe aan elke top perfusie ingang goed (Figuur 1b, goed a1). De druppel moet in een paar seconden afvlakken (Zie Figuur 3a, b voor een illustratie van deze ' passieve pomp methode '). Opmerking: Controleer onder een microscoop of de zaaien homogeen is. Als dat niet zo is, voeg dan nog eens 1 μL in het stopcontact en wacht tot de druppel afvlakt.</li>
	<li>Incuberen de microfluïdische goed plaat gedurende 1 uur bij 37 °C, 5% CO2. Hierna moeten de cellen zijn vastgehouden. Zo niet, wacht dan nog eens 30 min.</li>
	<li>Verwijder het basale medium uit de bovenste perfusie uitlaat putjes (Figuur 1b, goed a3). Voeg warm vat kweekmedium in de bovenste perfusie inlaat en uitlaat (Figuur 1b, Wells a1 en a3). Plaats de plaat op het rocker platform (ingesteld op 7 ° hoek, 8 min schommel interval) in de incubator (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Beeld de plaat met behulp van een brightfield-Microscoop met geautomatiseerde fase op dag 1 en 2 na seeding om de levensvatbaarheid van de cel te bevestigen. Na 2 dagen had een confluente monolaag moeten zijn gevormd tegen de collageen-1-Scaffold. Opmerking: Als de kanalen niet even Confluent lijken te zijn, kunnen de micro vaten worden gekweekt voor een extra 24 h.</li>
</ol>4. onderzoek naar angio geen kiemen, waaronder de vorming van punt-en Stalk-cellen
<ol><li>Bereid 4,5 ml angiogene kiem medium voor door het basale medium aan te vullen met 4,5 μl VEGF (50 μg/ml voorraad), 4,5 μL forbol 12-Myristate-13-acetaat (PMA) (2 μg/ml voorraad) en 2,25 μl Sphingosine-1-fosfaat (S1P) (1 mm voorraad).</li>
	<li>Bereid 8,5 mL van het groeimedium voor het vat (Basaal medium aangevuld met 30 ng/mL VEGF en 20 ng/mL bFGF).</li>
	<li>Aspirate medium uit de putten en voeg 50 μL vers vat kweekmedium in de bovenste perfusie inlaat-en uitlaat putten en gel inlaat-en uitlaat putten (Figuur 1b, Wells a1, a3, B1 en B3).</li>
	<li>Voeg 50 μL angiogene kiem mengsel toe aan elk van de onderste perfusie kanaal inlaat-en uitlaat putten (Figuur 1b, Wells C1 en C3).</li>
	<li>Plaats het apparaat terug in de incubator (37 °C, 5% CO2) op het rocker platform om een gradiënt van angiogene groeifactoren te vormen.</li>
	<li>Afbeelding 1 dag en 2 dagen na toevoeging van de angiogene groeifactoren met behulp van een brightfield-Microscoop met geautomatiseerde fase. Opmerking: Ga door met het kweken van de micro vaten om anastomose te bestuderen (Ga naar rubriek 5) of fixeer en beits de micro vaten om de kiem lengte en morfologie te kwantificeren op dag 2 en dag 6 (Ga naar sectie 6).</li>
</ol>5. studie anastomose en Sprout stabilisatie
<ol><li>Afbeelding met behulp van een brightfield-Microscoop met geautomatiseerd podium.</li>
	<li>Voeg 1 μL fluorescendig gelabeld albumine (0,5 mg/mL) toe aan de bovenste perfusie inlaat (Figuur 1b, goed a1) en meng met een pipet van 50 μL.</li>
	<li>Breng de plaat over naar een fluorescerende Microscoop met automatische podium-en incubator set bij 37 °C. Stel Microscoop in op 10x objectieve en correcte blootstellings instellingen (bijv. tetramethylrhodamine [TRITC]-kanaal, 20 MS blootstelling). Verkrijg time-lapse-beelden elke minuut gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder de plaat van de Microscoop en breng de plaat over naar een steriele laminaire stroming.</li>
	<li>Verwijder alle medium uit de putjes en vervang zowel het vat kweekmedium als het angiogene kiem medium in de overeenkomstige putjes (Zie de stappen 4,3 en 4,4).</li>
	<li>Plaats het apparaat terug in de incubator (37 °C, 5% CO2) om het angiogene spruiten voort te zetten.</li>
	<li>Herhaal stap 5.1 − 5.6 om de permeabiliteit op dag 6 te bestuderen.</li>
</ol>6. fixatie, kleuring en beeldvorming
<ol><li>Aspireren alle cultuur media uit alle putten. Opmerking: Rest medium of vloeistoffen in de microfluïdische kanalen hebben geen invloed op de fixatie door het geringe volume van 1 − 2 μL.</li>
	<li>Voeg 25 μL 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS toe aan alle perfusie inlaat (Figuur 1b, a1 en C1) en uitlaat putten (Figuur 1b, a3 en C3). Incureren gedurende 10 min bij RT. plaats het apparaat onder een lichte hoek (± 5 °) om de stroming te induceren (bijvoorbeeld door een zijde van de plaat op een deksel te plaatsen).</li>
	<li>Aspirate PFA uit de putten. Was alle perfusie-inlaten en uitgangen tweemaal met 50 μL van de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Hank. Aspirate HBSS van Wells.</li>
	<li>Permeabilize bij RT gedurende 10 minuten door toevoeging van 50 μL 0,2% nietionogene oppervlakteactieve stof aan alle perfusie-inlaten en-uitgangen.</li>
	<li>Aspireren de nonionische oppervlakteactieve stof uit putten. Was de perfusie kanalen tweemaal door 50 μL HBSS toe te voegen aan alle perfusie inlaat-en uitlaat putten. Aspirate HBSS van Wells.</li>
	<li>Vlek de kernen met behulp van Hoechst (1:2000) en F-actin met behulp van phalloidin (1:200) in HBSS. Bereid 2,2 mL voor 40 eenheden en voeg 25 μL toe aan elke perfusie inlaat en uitlaat goed. Plaats de plaat onder een lichte hoek en inincuberen bij RT gedurende ten minste 30 minuten.</li>
	<li>Was tweemaal met 50 μL HBSS in alle perfusie-inlaten en-uitgangen.</li>
	<li>Direct beeld met behulp van een fluorescerende Microscoop met geautomatiseerd podium of bewaar de plaat beschermd tegen licht bij 4 °C voor later gebruik.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes.">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).</li><li>Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+model+to+reconstitute+sprouting+lymphangiogenesis+in+vitro.">Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 78, 115-128 (2016).</li><li>Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+microfluidic+angiogenesis+screen+for+studying+anti-angiogenic+therapeutic+drugs.">A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs.</a> Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+Biomimetic+Pericyte-Covered+3D+Microvascular+Network.">Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network.</a> PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).</li><li>Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+microenvironment+systems+for+modeling+human+vasculature.">Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature.</a> Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).</li><li>Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+end-user+perspective+on+Organ-on-a-Chip:+Assays+and+usability+aspects.">An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).</li><li>Pagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+design+and+fabrication+of+microfluidic+devices+for+cell+cultures:+An+effective+approach+to+control+cell+microenvironment+in+three+dimensions.">Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions.</a> Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).</li><li>Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineers+are+from+PDMS-land,+Biologists+are+from+Polystyrenia.">Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia.</a> Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8, 14361 (2017).</li><li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research.">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li><li>Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Tissue+and+Disease+Modeling+using+hiPSCs.">Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).</li></ol>

P. vulto en T. Hankemeier zijn aandeelhouders van Mimetas BV. V. Borgdorff en A. Reijerkerk zijn medewerkers van Ncardia BV. V. van duinen, W. stam, V. V. Orlova en A.J. van Zonneveld hebben geen informatie.

Deze methode beschrijft de cultuur van 40 perfbruikbare endotheliale micro vaten binnen een robuust en schaalbaar microfluïdisch celcultuurplatform. Vergeleken met traditionele 2D-en 3D-celkweek methoden, laat deze methode zien hoe een fysiologische relevante cellulaire micro omgeving met verlopen en continue perfusie kan worden gecombineerd met 3D-celcultuur met adequate doorvoer voor screening Doeleinden.
Een van de grote voordelen ten opzichte van vergelijkbare microfluïdische assays is dat deze methode niet afhankelijk is van pompen voor perfusie, maar een rocker platform gebruikt om continue perfusie in alle microfluïdische eenheden tegelijk te induceren. Dit zorgt ervoor dat de assay robuust en schaalbaar is: platen kunnen op een rocker platform worden gestapeld. Belangrijk is dat alle microfluïdische eenheden individueel adresseerbaar blijven, waardoor deze methode kan worden geïmplementeerd binnen de geneesmiddelen screening, inclusief het genereren van een dosis-responscurve. Bovendien, zonder een pomp, is beeldvorming en medium vervanging veel eenvoudiger met minder risico op (kruis) verontreiniging.
Een ander voordeel van deze methode is het gebruik van een gestandaardiseerd, pre-gefabriceerd platform, terwijl vergelijkbare microfluïdische celculturen door de eindgebruikers moeten worden vervaardigd. Deze beschikbaarheid vergemakkelijkt de aanneming van deze test onder andere academische en farmaceutische onderzoeksgroepen, wat leidt tot standaardisatie. Ook, in tegenstelling tot microfluïdische prototypes, zorgt de 384-well plate-interface voor compatibiliteit met de huidige labapparatuur (bijv. aspiratoren, plaat handlers en multikanaalspipetten), waardoor de integratie binnen de huidige screening-infrastructuur wordt vergemakkelijkt .
Er zijn verschillende kritische stappen in het uitvoeren van deze test. De collageen-1 gel moet het gelkanaal volledig vullen. Tijdens het laden van de gel kan deze vulling worden waargenomen door de microfluïdische kanalen te inspecteren via het observatie venster (Figuur 2a) of door de plaat ondersteboven te spiegelen (zoals weergegeven in Figuur 1a). Tijdens het vullen moet de collageen gel in het middelste kanaal blijven, zonder in aangrenzende perfusie kanalen te vloeien. We merkten dat de kwaliteit van de collageen-1 gel cruciaal is voor de juiste assay prestaties. Collageen-1 batches met een te hoge viscositeit zullen leiden tot onvolledige vulling van het gelkanaal. Na 10 minuten polymerisatie bij 37 °C moet de gel homogeen en helder zijn. Als collageen-1 niet goed wordt opgeslagen (bijv. als gevolg van fluctuerende temperaturen in de koelkast), zal collageen in de kanalen polymeriseren met duidelijk zichtbare vezel vorming. Dit kan resulteren in de invasie van de ECs in de gel zonder toevoeging van angiogene factoren, maar zonder de juiste lumen ontwikkeling.
Wanneer de cellen worden gesest, wordt de fibronectin coating oplossing uit de putjes verwijderd, waardoor alleen de microfluïdische kanalen gevuld met coating oplossing. Aspiratie van de coating oplossing van microfluïdische kanalen kan leiden tot een verstoring van de gel of gel aspiratie. De celsuspensie moet deze coating oplossing vervangen/verplaatsen. Dit werkt het beste wanneer de celsuspensie wordt verdeeld met behulp van de passieve pomp methode, omdat het rechtstreeks pipetteren van de celsuspensie in de kanalen minder reproduceerbare zaaien dichtheden vertonen.
Omdat de micro vaten een stabiele monolaag vormen tegen de gel, resulteren deze kleine verschillen alleen in verschillende tijden die nodig zijn om confluentie te bereiken. Zo wordt het beginpunt van de test bepaald door confluentie in plaats van cultuur tijd. Indien nodig kan de kweektijd worden verlengd totdat er een duidelijke monolaag is gevormd tegen de gel.
In de putten kunnen luchtbellen worden gevangen door een onjuiste vulling van de putjes (Zie Figuur 2b). Deze luchtbellen zullen de stroom van het medium beperken, zelfs wanneer het apparaat op een rocker-platform wordt geplaatst, en resulteren in instorting van het microvat en onjuiste gradiënt vorming. Het indrukken van de pipetpunt tegen de zijwand van de putjes zal het succes van het volledig vullen van de put vergroten. Als er een luchtbel in de putjes zit, kan deze worden verwijderd door zachtjes een steriele pipetpunt in de glazen bodem te plaatsen. Luchtbellen kunnen ook voorkomen in de microfluïdische kanalen. Wanneer medium is verwijderd uit de putten, is de verdamping van het medium merkbaar van de microfluïdische kanalen na 30 min (vanwege de microliter volumes binnen de kanalen). Zo worden middelgrote veranderingen bij voorkeur zo snel mogelijk uitgevoerd. Wanneer medium wordt toegevoegd in een kanaal met verdampte medium, zullen luchtbellen worden gevangen in de microfluïdische kanalen. Deze luchtbellen binnen de microfluïdische kanalen kunnen handmatig worden verwijderd door een P20-pipet direct op de inlaat of uitlaat te plaatsen en het medium via de microfluïdica van de tegenovergestelde put te forceren. Succesvolle verwijdering van de luchtbellen resulteert in een kleine maar merkbare afname van het volume in de andere put. Tabel 1 geeft een overzicht van veelvoorkomende fouten en het oplossen ervan.
Het ontbreken van een pomp is een beperking wanneer continue beeldvorming vereist is, omdat het rocker platform de gebruiker beperkt tot het beeld met opeenvolgende tijdsintervallen. Bovendien, de perfusie van medium in dit platform bestaat uit bi-directionele stroom met lage niveaus van shear stress, terwijl de vasculatuur in vivo wordt blootgesteld aan unidirectionele stroom met hogere niveaus van shear stress. Hoewel we geen negatieve effecten waarnemen van de bi-directionele stroming met betrekking tot het angiogene spruitstuk, is stroming een belangrijke biomechanische stimulans en bij voorkeur gecontroleerd. Hoewel er in de handel verkrijgbare pomp opstellingen zijn, blijft de interfacing met de 384-well plate uitdagend en pomp opstellingen de schaalbaarheid van deze test ernstig belemmeren.
De mogelijkheid om iPSC-ECs te gebruiken om angiogene spruiten te bestuderen, opent nieuwe kansen in ziekte modellering en drugs onderzoek. In tegenstelling tot de primaire ECs, deze cellen kunnen worden gegenereerd in bijna onbeperkte hoeveelheden met een stabiel genotype en met behulp van genoom Editing technieken, cellen kunnen worden gegenereerd die met inbegrip van genen Knockouts en knock-ins. Echter, als de protocollen om ECs te onderscheiden van iPSC zijn relatief nieuw, het is nog onduidelijk wat leidt tot iPSC-ECs dat beste weerspiegelen primaire ECs en welke subtypen van EG zijn of kunnen worden gegenereerd. Ook zijn er nog resterende vragen over hun relevantie. Bijvoorbeeld, doen iPSC-ECs nog steeds vertonen de plasticiteit die typisch is voor endotheliale cellen? En in welke mate reageren iPSC-afgeleide cellen op en communiceren met hun cellulaire micro omgeving? Het gestandaardiseerde platform gepresenteerd hier kan worden gebruikt om een aantal van deze vragen te beantwoorden om verder te valideren het gebruik van iPSC-afgeleide ECs in vitro.
De meest ongecompliceerd toekomstige richting voor deze test is de integratie van andere celtypen die een belangrijke rol spelen tijdens angiogenese, zoals pericytes en macrofagen. Dit vergemakkelijkt het vermogen om de rol van macrofagen te bestuderen tijdens anastomose tussen kiemgroenten of de hechting van pericytes na capillaire vorming. Ook is het mogelijk om verschillende andere celtypen binnen of tegen een extracellulaire matrix te kweken (bijvoorbeeld, we hebben de cultuur van neuronen en verschillende epitheliale structuren zoals proximale tubuli en dunne darmen aangetoond), die kunnen worden gecombineerd met de vasculaire met deze methode gegenereerde bedden. Ten slotte zal het interessant zijn om angio geen kiemen in synthetische hydrogels te bestuderen, omdat hun gedefinieerde samenstelling de standaardisatie van de assay verder verhoogt en het afstemmen van stijfheid en bindende motieven mogelijk maakt die de interacties van de celmatrix beïnvloeden.
Concluderend toont deze methode de haalbaarheid van de iPSC-afgeleide ECs in een gestandaardiseerde en schaalbare 3D-angiogene test die fysiologische relevante cultuuromstandigheden combineert in een platform dat de vereiste robuustheid en schaalbaarheid heeft om te worden geïntegreerd in de infrastructuur voor geneesmiddelen screening.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 &#181;L of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 &#181;L of basal medium in the outlet well (well A3).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

In vitro-modellen spelen een fundamentele rol bij de ontdekking en validering van nieuwe geneesmiddelen doelstellingen van vasculaire ziekten. De huidige in-vitro screenings modellen met voldoende doorvoer hebben echter slechts een beperkte fysiologische relevantie1, wat de vertaling van de bevindingen van in vitro naar in vivo belemmert. Dus, om pre-klinisch vasculaire geneesmiddelenonderzoek te verbeteren, zijn verbeterde in vitro-modellen van vasculatuur nodig die een screening met hoge doorvoer combineren met een fysiologisch relevante 3D-cellulaire micro-omgeving.
In de afgelopen tien jaar is aanzienlijke vooruitgang geboekt om de fysiologische relevantie van in vitro-modellen van vasculatuur te vergroten. In plaats van het kweken van endotheel cellen op vlakke oppervlakken zoals weefsel-cultuur plastics, kunnen endotheel cellen worden ingebed in 3D-steigers, zoals fibrine en collageen gels2. Binnen deze matrices vertonen de endotheelcellen een fysiologisch relevant fenotype dat is geassocieerd met matrix degradatie en lumen vorming. Echter, deze modellen tonen alleen een subset van de vele processen die optreden tijdens angiogene kiemen als belangrijke aanwijzingen uit de cellulaire micro-omgeving zijn nog steeds ontbreekt.
Microfluïdische celkweek platforms zijn uniek geschikt om de fysiologische relevantie van in vitro-modellen van vasculatuur verder te verhogen. Bijvoorbeeld, endotheel cellen kunnen worden blootgesteld aan shear stress, dat is een belangrijke biomechanische stimulans voor vasculatuur. Ook kan de mogelijkheid om vocht te beheersen in microfluïdica de vorming van biomoleculaire gradiënten3,4,5,6. Dergelijke hellingen spelen een belangrijke rol in vivo tijdens de vorming en patronen tijdens de angiogenese. Terwijl microfluïdische celculturen echter een ongeëvenaarde fysiologische relevantie hebben getoond ten opzichte van traditionele 2D-en 3D-celkweek methoden, missen ze vaak de benodigde doorvoer, schaalbaarheid en standaardisatie die nodig is voor de screening van geneesmiddelen 7. ook zijn veel van deze platformen niet commercieel beschikbaar en vereisen de eindgebruikers om hun apparaten te microfabriceren vóór gebruik8. Dit vereist niet alleen productieapparatuur en technische kennis, maar beperkt ook het niveau van kwaliteitscontrole en heeft een negatieve invloed op de reproduceerbaarheid9.
Tot op heden blijven primaire menselijke endotheel cellen de meest gebruikte celbron voor het modelleren van angiogenese in vitro10. Echter, primaire menselijke cellen hebben een aantal beperkingen die hun routine toepassing in screening benaderingen belemmeren. Ten eerste is er een beperkte mogelijkheid om te schalen en uit te breiden primaire cel afgeleide culturen. Zo moeten voor grootschalige experimenten batches van verschillende donoren worden gebruikt, wat resulteert in genomische verschillen en batch-naar-batch variaties. Ten tweede verliezen primaire endotheel cellen na enkele passages over het algemeen relevante eigenschappen wanneer ze in vitro11,12worden gekweekt.
Endotheliale cellen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn een veelbelovend alternatief: ze lijken op primaire cellen, maar met een stabieler genotype dat ook vatbaar is voor precieze genoom bewerking. Bovendien kunnen iPSCs zichzelf verlengen en dus in bijna onbeperkte hoeveelheden worden uitgebreid, waardoor iPSC-afgeleide cellen een aantrekkelijk alternatief zijn voor primaire cellen voor gebruik binnen in vitro screenings modellen13.
Hier beschrijven we een methode om endotheliale cellen te kweken als perfbruikbare 3D-Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch celcultuurplatform met hoge doorvoer. Perfusie wordt toegepast door het apparaat op een rocker platform te plaatsen, wat een robuuste werking verzekert en de schaalbaarheid van de test verhoogt. Aangezien de micro vaten continu worden geperfectiongebruikt en worden blootgesteld aan een gradiënt van angiogene factoren, wordt angio geen kiemen bestudeerd in een meer fysiologische relevante cellulaire micro omgeving. Hoewel het protocol compatibel is met veel verschillende bronnen van (primaire) Endotheliale cellen14,15, hebben we ons geconcentreerd op het gebruik van ECs van menselijke IPSC-derivaten om de standaardisatie van deze test te verhogen en de integratie ervan te vergemakkelijken binnen vasculaire drugs onderzoek.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-10 &#956;L Electronic repeater pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z654566-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-lane OrganoPlate</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td>4003-400B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal culture medium</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-1</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Biopur 2.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Repeater M4 pieptte</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4759-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3569</td>
			<td>10 mg/mL solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-derived endothelial cells</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>37 g/L in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td></td>
			<td>Rocker platform used to provide flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Focus-Biomolecules</td>
			<td>10-2165</td>
			<td>2 &#956;g/mL in PBS containing 0.1% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1P</td>
			<td>Ecehelon Biosciences</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>1 mM in methanol containing 1% acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32-10</td>
			<td>50 &#956;g/mL in water containing 0.1% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro

Pre-klinisch geneesmiddelenonderzoek van vasculaire ziekten vereist in vitro modellen van vasculatuur die zijn geamendeerbaar voor screening met hoge doorvoer. De huidige in-vitro screening modellen met voldoende doorvoer hebben echter slechts een beperkte fysiologische relevantie, wat de vertaling van de bevindingen van in vitro naar in vivo belemmert. Aan de andere kant hebben microfluïdische celculturen in vitro een ongeëvenaarde fysiologische relevantie getoond, maar hebben vaak niet de vereiste doorvoer, schaalbaarheid en standaardisatie. We demonstreren een robuust platform om angiogenese te bestuderen van endotheelcellen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-ECs) in een fysiologische relevante cellulaire micro omgeving, waaronder perfusie en gradiënten. De iPSC-ECs worden gekweekt als 40 geperfused 3D Micro vaten tegen een gedessineerde collageen-1 Scaffold. Bij de toepassing van een gradiënt van angiogene factoren, kunnen belangrijke kenmerken van angiogenese worden bestudeerd, waaronder de differentiatie in punt-en stalken-cel en de vorming van perfbruikbaar lumen. Perfusie met fluorescerende Tracer kleurstoffen maakt de studie van permeabiliteit tijdens en na anastomose van de angiogene spruiten mogelijk. Concluderend toont deze methode de haalbaarheid van de iPSC-afgeleide ECs in een gestandaardiseerde en schaalbare 3D-angiogene test die fysiologische relevante cultuuromstandigheden combineert in een platform dat de vereiste robuustheid en schaalbaarheid heeft om te worden geïntegreerd in de infrastructuur voor geneesmiddelen screening.

Het microfluïdische 3D-celkweek platform bestaat uit 40 geperfundeerd microfluïdische eenheden (Figuur 1a, b), die wordt gebruikt om angiogene kiemen van geperfundeerd micro vaten te bestuderen tegen een gedessineerde collageen-1 gel (figuur 1c). Deze micro vaten worden continu geperfectiongebruikt en blootgesteld aan een gradiënt van angiogene groeifactoren (Figuur 3a-d). De angiogene spruiten kunnen worden onderzocht 2 dagen na gradiënt blootstelling of gekweekt gedurende meer dan 5 dagen na gradiënt blootstelling aan studie anastomose en Sprout stabilisatie (Zie tijdlijn, figuur 1d).
Het seeden van de IPSC-ECs met behulp van de passieve pomp methode moet resulteren in homogene zaaien dichtheden (figuur 4a, b). De cultuur onder voortdurende perfusie resulteerde in een confluente micro vaten in 2-dagen, waarbij de cellen volledig de omtrek van het microfluïdische kanaal en de vorming van een confluente monolaag tegen de gedessineerde collageen-1-gel hebben gevoerd.
Blootstelling aan een gradiënt van angiogene factoren resulteerde in directionele angiogene kiemen van de micro vaten in de gedessineerde collageen-1 gel (figuur 5a-g). Clear Tip celvorming en invasie in de collageen-1 gel was zichtbaar 24 h na toevoeging van de angiogene gradiënt, terwijl stalken cellen inclusief lumen vorming zichtbaar waren na 48 h (figuur 5a).
Na fixatie en kleuring kan het capillaire netwerk worden gevisualiseerd met behulp van phalloidin om F-actin te beits en Hoechst 33342 te gebruiken om de Nucleus te vlekken (Figuur 5b, c). Deze spruiten kunnen worden gekwantificeerd (bijv. vorm en lengte14). Zonder toevoeging van groeifactoren, mag geen invasie in de collageen-1 gel worden waargenomen (figuur 5d). Confocale beeldvorming werd gebruikt om de kiem diameter te bepalen en om de lumen vorming te bevestigen (figuur 5e-g).
De spruiten groeien verder naar de richting van de gradiënt en bereiken het tegenovergestelde perfusie kanaal binnen 3 − 4 dagen na toevoeging van angiogene groeifactoren. Dit resulteert in de verbouwing van het vasculaire netwerk, met een duidelijke afname van het aantal angiogene spruiten (Figuur 6a). Lumen vorming werd beoordeeld door perfusie van het vasculaire netwerk met fluorescently gelabelde macromoleculen (bijv. albumine of dextrans). Perfusing de micro vaten met 0,5 mg/mL gelabelde albumine vóór en na anastomose onthulde een duidelijk verschil in ontkiemen permeabiliteit na 10 min (Figuur 6b-e), wat suggereert dat de capillairen stabiliseren en rijpen na anastomose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig1.jpg"> Figuur 1: Microfluïdisch celcultuurprotocol voor door iPSC afgeleide micro vaartuigen. a) de bodem van het microfluïdische celkweek apparaat wordt weergegeven met de 40 microfluïdische eenheden die onder de 384-goed plaat zijn geïntegreerd. Grotere weergave toont een van de 40 microfluïdische eenheden. b) elke microfluïdische eenheid wordt onder 9 putjes met 3 inlaat putten en 3 uitlaat putten geplaatst. De microfluïdische kanalen worden gescheiden door ribbels (' phaseguides '), die het patroon van hydrogels in het centrale kanaal (' gelkanaal ') mogelijk maken, terwijl er nog steeds contact is met de aangrenzende kanalen (' perfusie kanalen '). c) methode voor het kweken van een geperfundeerd micro-vat binnen het microfluïdische apparaat, dat wordt gebruikt om gradiënt aangedreven angiogene kiemen te bestuderen door middel van een gedessineerde collageen-1 matrix. d) tijdlijn voor de studie van angiogene kiemen en/of anastomose. Dit cijfer is gewijzigd van van duinen et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig2.jpg"> Figuur 2: laadprocedures voor gel en medium. a) voorbeelden van correcte en onjuiste geldepositie. Correcte archivering resulteert in een gedessineerde collageen-1 gel in het middelste kanaal, dat vervolgens gepolymeriseerd wordt. b) voorbeelden van correcte en onjuiste vulling van de putten. Putten worden gevuld in de volgorde van 1 − 4 om luchtbellen te voorkomen binnen de microfluïdische kanalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig3.jpg"> Figuur 3: continue hydrostatische druk aangedreven stroming en gradiënt stabilisatie. a) de hydrostatische drukverschillen tussen putten resulteren in passieve nivellering en debiet binnen de microfluïdische kanalen. b) het plaatsen van het apparaat op een rocker platform ingesteld op 7 ° en 8 min cyclustijd resulteert in continue bi-directionele perfusie binnen de microfluïdische kanalen. c) gradiënten worden gevormd door de invoering van twee verschillende concentraties binnen de putten, die voortdurend worden vernieuwd door passieve nivellering. d) verlopende visualisatie met behulp van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran. Bi-directionele stroming stabiliseert de gradiënt tot 3 dagen. Schaalbalk = 200 μm. Dit cijfer is gewijzigd van van duinen et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig4.jpg"> Figuur 4: passieve pomp methode voor het zaaien van cellen. a) passief pompen wordt gedreven door drukverschillen die worden veroorzaakt door verschillen in oppervlaktespanning. Dit resulteert in een stroom van de druppel (hoge inwendige druk) naar het reservoir (lage inwendige druk). b) tijdsverloop van een druppel (grijze omtrek) die bovenop de inlaat (witte omtrek) van het microfluïdische kanaal (blauwe omtrek) wordt geplaatst. Vlak na de optelling (figuur 4b, i) krimpt de druppel bovenop de inlaat (figuur 4b, II: 1 s na optelling; IV: 2 s na optelling), wat resulteert in een stroom naar de uitlaat. Dit gaat door totdat de druppel meniscus wordt vastgemaakt door de inlaat (figuur 4b, IV). Schaalbalk = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig5.jpg"> Figuur 5: robuuste 3D-spruiten van iPSC-EC-micro vaten. a) in de loop der tijd uit te spruiten van IPSC-EC. Micro vaten werden geteeld voor 48 h (rechts) en vervolgens gestimuleerd met een angiogene cocktail met 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P en 2 ng/mL PMA. De eerste tip-cellen die de collageen-1-steiger (midden) binnendringen zijn zichtbaar 24 h na blootstelling. De eerste lumen zijn zichtbaar (pijlen) 48 h na belichting (rechts) terwijl de punt-cellen verder zijn gemigreerd in de richting van het verloop. (b) array van 15 micro vaten die gedurende 2 dagen met VEGF, S1P en PMA werden gestimuleerd en gekleurd voor F-actin (geel) en kernen (blauw). Schaal staaf = 200 μm. (c) gestimuleerd microvat (positieve controle). d) ongestimuleerd microvat (negatieve controle). e) de maximale projectie van één enkel capillair in de gel. (f) zelfde als (g) maar gericht op het midden. Gestippelde lijn geeft de positie aan van de orthogonale weergave in paneel g. schaal staven (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig6.jpg"> Figuur 6: visualisatie van angiogene Sprout permeabiliteit voor en na anastomose. a) anastomose met een basaalkanaal activeert het snoeien en rijping van angiogene spruiten. Close-up van capillair bed op 2, 4, 6 en 7 dagen na stimulatie met angiogene groeifactoren. b) angiogene spruiten na 2 dagen na toevoeging van angiogene groeifactoren. Angiogene spruiten worden gevormd binnen gel, maar zijn nog niet aangesloten op het onderste perfusie kanaal. (c) perfusie van het micro-vat met 0,5 mg/ml albumine-Alexa 555 oplossing. Fluorescerende afbeeldingen verkregen bij 0 en 10 min. (d, e) hetzelfde als in panelen b en c, maar na 7 dagen van stimulatie. Spruiten zijn verbonden met de andere kant en vormden een Confluent Health micro vat in het basale perfusie kanaal. Schaal staven = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Probleem</td>
			<td>Oorzaak</td>
			<td>Oplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Collageen-1 Betreed of vult het kanaal niet volledig</td>
			<td>Collageen-1 druppel wordt niet bovenop de inlaat geplaatst</td>
			<td>Plaats de druppel voorzichtig boven op de inlaat van het gelkanaal</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume collageen-1 is te laag</td>
			<td>Gebruik 1,5 μL van de gel om het kanaal volledig te vullen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collageen-1 is te visceus</td>
			<td>Gebruik een andere batch van collageen-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collageen-1 stroomt in perfusie kanalen</td>
			<td>Collageen-1 wordt direct in de inlaat van het gelkanaal gepipetcoat</td>
			<td>Plaats de druppel voorzichtig boven op de inlaat van het gelkanaal</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Collageen-1 is niet helder/vezel vorming</td>
			<td>Collageen-1 wordt niet goed opgeslagen</td>
			<td>Bewaar collageen-1 bij 4 °C, niet bevriezen</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 en Hepes zijn niet goed gemengd voor het toevoegen van collageen-1</td>
			<td>Meng de NaHCO3 en Hepes zorgvuldig door pipetteren voordat u het collageen-1 toevoegt</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Druppel niet krimpen met behulp van passieve pomp methode</td>
			<td>Druppel aan de zijkant van de put</td>
			<td>Aspirate druppel en voeg nieuwe druppeltjes bovenop de inlaat</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Zorg ervoor dat de uitlaat goed is gevuld met ten minste 20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Er wordt geen ontspruiten waargenomen</td>
			<td>Groeifactoren worden niet toegevoegd of aliquots worden niet goed opgeslagen</td>
			<td>Bereid het verse angiogene kiem medium voor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luchtbellen blokkeert perfusie/gradiënt vorming</td>
			<td>Verwijder luchtbellen met een P20 of P200 pipet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume verschillen tussen Wells</td>
			<td>Volumes in alle putjes moeten gelijk zijn om een lineair verloop te vormen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Cellen niet levensvatbaar</td>
			<td>Plaat niet geplaatst op Rocker platform/Rocker platform uitgeschakeld</td>
			<td>Zorg ervoor dat het rocker platform is ingeschakeld en de juiste cyclustijd/hoek heeft (8 min/7 °)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geen perfusie mogelijk door aanwezigheid van luchtbellen</td>
			<td>Verwijder luchtbellen met een P20 of P200 pipet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Er worden geen lumen gevormd, cellen migreren als afzonderlijke cellen</td>
			<td>Angiogene kiem mengsel werd toegevoegd voordat een monolaag werd gevormd</td>
			<td>Wacht nog eens 24 uur voordat u de angiogene groeifactoren toevoegt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grote variatie in kiem dichtheid</td>
			<td>Verschillen in celdichtheden na zaaien</td>
			<td>Controleer of de celdichtheid homogeen is en vergelijkbaar is tussen microfluïdische eenheden. Voeg indien nodig nog een druppel celsuspensie toe</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: veelvoorkomende fouten oplossen.

Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Deze in vitro test toont angiogeen ontkiemen in een hoge doorvoer en schaalbaar platform. Dit kan worden gebruikt om nieuwe doelen in angiogenese te vinden. Deze angiogenese test combineert complexe cellulaire micro-omgevingen met gradiënten en perfusie met een platform dat compatibel is met hoge doorvoer screening.Angiogenese speelt een belangrijke rol in zowel de gezondheid als de ziekte. Inzicht in de mechanismen die optreden tijdens angiogenese kan ons helpen om te begrijpen hoe kankers groeien en hoe weefsels herstellen. Deze methode kan inzicht geven in de mechanismen tijdens hart- en vaatziekten en weefselregeneratie.In beide speelt angiogenese een belangrijke rol. Voor het eerste gebruik van dit microfluïde platform, moet u zich bewust zijn van de wet van volumes en hoe pipette. U de stappen bevestigen door onder een microscoop te kijken of de plaat ondersteboven te draaien.Sommige stappen zijn moeilijk om een gevoel te krijgen voor bij het lezen van de methode, bijvoorbeeld hoe klein de microfluïde kanalen zijn of hoe de plaat te houden. Het aantonen van deze procedures zal Wendy Stam, een technicus van ons laboratorium. Om te beginnen, breng de microfludische 384-put plaat naar een steriele laminaire stroomkap.Verwijder het deksel en voeg 50 microliter water of fosfaat gebufferde zoutoplossing toe aan elk van de 40 observatieputten met behulp van een meerkanaals pipet. Voeg vervolgens 1,5 microliter van vier milligram per milliliter collageen een oplossing aan de gel inlaat van elke microfluïde eenheid. Zorg ervoor dat de druppel gel is geplaatst in het midden van elke put om voor de gel om het kanaal in te voeren.Na het vullen van vijf microfluïde eenheden, draai de plaat ondersteboven om visueel te inspecteren juiste vulling van de gel kanalen. Plaats de microfludische plaat in een couveuse op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 10 minuten om collageen een polymeriseren. Haal vervolgens de plaat uit de couveuse en breng over op een steriele laminaire stroomkap.Voeg 50 microliter van 10 microgram per milliliter fibronectine coderingsoplossing toe aan de uitlaatput van het bovenste perfusiekanaal van elke microfluïde eenheid. Druk de pipetpunt tegen de zijkant van de put voor een correcte vulling van de put zonder luchtbellen te vangen. Het kanaal vult en de vloeibare pannen op de uitlaat zonder de uitlaat goed te vullen.Plaats de plaat vervolgens minstens twee dagen in de couveuse. Ontdooi nu snel de bevroren IPSC-VC's voor minder dan een minuut in een 37 graden Celsius waterbad. Breng vervolgens de cellen over naar een buis van 15 milliliter en voeg langzaam 10 milliliter basaal medium toe om te verdunnen.Teken 10 microliter van de oplossing en tel de cellen op een cel teller. Centrifugeren de buis op 100 keer g gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant zonder verstoring van de cel pellet en resuspend in basale medium om een concentratie van twee keer 10 tot de zevende cellen per milliliter opleveren.Breng vervolgens de microfluïde 384-putplaat van de couveuse over naar een steriele laminaire stroomkap. Aspirate de fibronectin coderingsoplossing uit de perfusie uitlaat en voeg 25 microliter basale medium in de uitlaatputten. Voeg een een microliter druppel van cel suspensie aan elke top perfusie inlaat goed.De druppel vlakt af in een paar seconden. Controleer onder een microscoop of het zaaien homogeen is binnen een enkel kanaal en tussen kanalen. Incubeer de microfluïde put plaat voor een tot 1,5 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Controleer daarna de cellen om te bevestigen dat ze zich hebben gehecht. Verwijder het basale medium uit de bovenste perfusieuitlaatputten. Voeg warm vat cultuur medium in de top perfusie inlaat en uitlaat.Plaats de plaat op een rocker platform dat is ingesteld op een zeven graden hoek en acht minuten schommelen interval in de incubator. Op dag een en twee na het zaaien, beeld de plaat met behulp van een Brightfield microscoop met geautomatiseerde fase om de levensvatbaarheid van de cel te bevestigen. Na twee dagen, een confluent monolayer heeft gevormd tegen het collageen een steiger.Bereid eerst 4,5 milliliter angiogeen ontkiemend medium door 4,5 milliliter basaal medium aan te vullen met 4,5 microliter VEGF-voorraad, 4,5 microliter PMA-voorraad en 2,25 microliter S1P-voorraad. Bereid 8,5 milliliter vatgroeimedium voor door het basale medium aan te vullen met 5,1 microliter VEGF en 3,4 microliter BFGF. Aspirate medium uit de putten en voeg 50 microliter van verse vat cultuur medium in de top perfusie inlaat en uitlaat putten en gel inlaat en uitlaat putten.Voeg vervolgens 50 microliter angiogeen spruitmengsel toe aan elk van de inlaat- en uitlaatputten van de bodemperfusiekanaal. Plaats de plaat terug in de couveuse op het rockerplatform om een gradiënt van angiogene groeifactoren te vormen. Één dag en twee dagen na toevoeging van de angiogene groeifactoren, gebruik een microscoop Brightfield om de putten op een geautomatiseerd stadium te beelden.Om anastomose en spruitstabilisatie te bestuderen, voeg een microliter van 0,5 milligram per milliliter fluorescerend gelabeld albumine toe aan de bovenste perfusie inlaat. Meng vervolgens de oplossing met een pipet van 50 microliter. Breng de plaat naar een fluorescerende microscoop met geautomatiseerde fase en incubator ingesteld op 37 graden Celsius.Stel de microscoop in op de 10X-doelstelling en corrigeer de belichtingsinstellingen. Verwerf timelapse-beelden elke minuut gedurende 10 minuten. Haal de plaat uit de microscoop en breng de plaat over op een steriele laminaire stroomkap.Verwijder alle medium uit de putten en vervang zowel het medium van de vaatkweek als het angiogene ontkiemende medium in de overeenkomstige putten. Plaats de microfluïde plaat terug in de couveuse om angiogeen te blijven ontkiemen. Herhaal op dag zes de beeldvorming om de doorlaatbaarheid te bestuderen.Om de celcultuur op te lossen, aspirate alle cultuurmedia uit de putten. Voeg 25 microliter van 4% PFA in PBS toe aan alle perfusieinlaat- en uitlaatputten. Plaats vervolgens een kant van de microfluïde plaat op het deksel in een lichte hoek van vijf graden om de stroom te induceren.Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna, aspirate de PFA uit de putten. Was alle perfusieinlaten en -uitgangen twee maal met 50 microliter HBSS.Dan aspirate de HBSS uit de putten. Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof die moet worden behandeld het dragen van handschoenen en alleen geopend in een rookkap. Voeg vervolgens 50 microliter van 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stoffen toe aan alle perfusieinlaten en uitlaten om 10 minuten op kamertemperatuur te doordringen en plaats de microfluïde plaat op het deksel onder een lichte hoek van vijf graden.Aspirate de niet-ionische oppervlakteactieve uit de putten en was de perfusiekanalen tweemaal door 50 microliters hbss toe te voegen aan alle perfusie-inlaat- en uitlaatputten. Aspirate de HBSS uit de putten. Bereid Hoechst 1, 000 tot 2.000 voor op het bevlekken van de kernen en bereid Phalloidin 100 tot 200 in HBSS voor het bevlekken van F-actin.Combineer zes milliliter HBSS, 30 microliter F-actin en drie microliters van Hoechst in een Falcon buis. Voeg vervolgens 25 microliter aan elke perfusieinlaat en uitlaatput goed toe. Plaats de plaat onder een lichte hoek en incubbateren op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten.Was twee maal met 50 microliter HBSS in alle perfusieinlaten en -uitgangen. Dan direct beeld met behulp van een fluorescerende microscoop met geautomatiseerde fase of bewaar de plaat beschermd tegen licht op vier graden Celsius voor later gebruik. In dit protocol werden de microvaten continu geperfuseerd en blootgesteld aan een gradiënt van angiogene groeifactoren.Het zaaien van de IPSC-IC's met behulp van de passieve pompmethode resulteerde in homogene zaaddichtheden. De timelapse van een druppel die bovenop de inlaat van het microfluïde kanaal wordt geplaatst toont de druppel direct na toevoeging, de druppel bovenop de inlaatstam na toevoeging, tot de druppel meniscus door de inham werd vastgemaakt die in een stroom naar de uitgang resulteerde. Blootstelling aan een gradiënt van angiogene factoren resulteerde in directionele angiogene ontkiemen van de microvaten binnen het patroon collageen een gel.Duidelijke tipcelvorming en invasie in het collageen één gel was zichtbaar 24 uur na toevoeging van de angiogene gradiënt, terwijl voorraadcellen inclusief lumenvorming na 48 uur zichtbaar waren. Na fixatie en kleuring werden de vorm en lengte van deze spruiten geïdentificeerd. Echter, zonder toevoeging van groeifactoren, geen invasie in het collageen een gel werd waargenomen.Met confocale beeldvorming werd de spruitdiameter bepaald en werd de lumenvorming bevestigd. Deze methode kan worden gebruikt om te screenen op nieuwe angiogene remmers. Dit kan helpen om nieuwe behandelingen te vinden tegen diabetische retinopathie, reumatoïde artritis en kanker.We onderzoeken momenteel hoe we co-culturen kunnen creëren, waaronder een model van de bloed-hersenbarrière en gevasculariseerde organoïden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Een open source technologieplatform om op Hydrogel gebaseerde 3D-cultuurmodellen op een geautomatiseerde en gestandaardiseerde manier te produceren

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...