Name: standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

העבודה הזאת היא חלק נתמך על ידי מענק מחקר של התוכנית של מאגר מצליח של "Meer Kennis" (פרויקט מספר 114022501) של ארגון הולנד לחקר ופיתוח בריאות (ZonMw) וקרן הלב ההולנדית הקונסורציום CVON חבר.

1. הכנת המכשיר
<ol><li>העבר את המיקרופלואידיג 384-צלחת היטב למכסה זרימה סטרילית.</li>
	<li>הסר את המכסה ולהוסיף 50 μL של מים או פוספט באגירה מלוחים (PBS) לכל אחד מתוך 40 בארות התצפית (איור 1b, היטב B2) באמצעות צינורות רב-ערוצי או חוזרת. הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. השאר את הצלחת עם המכסה בארון התרבות הסטרילי בטמפרטורת החדר (RT).</li>
</ol>2. הכנת ג'ל וציפוי
<ol><li>הכינו 2.5 mL של 10 μg/mL fibronectin (FN) פתרון ציפוי. לדלל 25 μL של 1 mg/mL fibronectin פתרון מניות 2.5 mL של הPBS של דולבקה (dPBS, סידן ומגנזיום חינם). מניחים את התמיסה במקווה המים ב-37 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
	<li>הכינו 100 μL של פתרון קולגן -1. הוסף 10 μL של HEPES (1 מ ') כדי 10 μL של נחקו3 (37 g/L) ולערבב על ידי ליטוף. מניחים את הצינור על הקרח ולהוסיף 80 μL של קולגן -1 (5 מ"ג/mL) כדי להניב ריכוז קולגן מנוטרל 1 של 4 מ"ג/mL. השתמש בפיפטה כדי לערבב בזהירות ולהימנע מהיווצרות בועות.</li>
	<li>הוסף 1.5 μL של הפתרון קולגן -1 (4 מ"ג/mL) לתוך השקע ג'ל של כל יחידת microfluidic (איור 1b, גם B1). ודא כי ה-droplet של ג'ל ממוקם באמצע כל באר כדי שהג ייכנס לערוץ (ראה איור 2a). הערה: מדריכים מונעים מילוי הערוצים הסמוכים ומאפשרים הפנינג ג'ל. טעינת ג'ל נכון יכול להיות מאושר תחת מיקרוסקופ ברייטפילד על ידי התבוננות על היווצרות מניסקוס דרך חלון התצפית (גם B2) או על ידי היפוך הצלחת הפוך. אם ג'ל לא לחלוטין למלא את הערוץ, droplet נוסף של 1 μL ניתן להוסיף.</li>
	<li>מניחים את הצלחת microfluidic בחממה (37 ° c, 5% CO2) עבור 10 דקות כדי פולימוניזציה קולגן -1. הערה: עיתוי הפילמור הינו קריטי; בשל הכרכים הנמוכים המשמשים microfluidics התאיידות יכול כבר להיות נצפתה לאחר 15 דקות של דגירה, אשר תוצאות התמוטטות ג'ל או הצטמקות.</li>
	<li>קח את הצלחת מהאינקובטור והעבר. למכסה של זרימה סטרילית</li>
	<li>הוסף 50 μl של 10 μg/mL מטפל בפתרון כיסוי לשקע היטב של הערוץ זלוף העליון של כל יחידת microfluidic (איור 1b, היטב A3). הקישו על הפיפטה כנגד הצד של הבאר למילוי נכון של הבאר מבלי ללכוד בועות אוויר (ראו איור 2b). הערוץ צריך למלא, ואת הנוזל צריך להצמיד על השקע (גם C1) ללא מילוי היטב לשקע.</li>
	<li>מניחים את הצלחת בחממה (37 ° c, 5% CO2) לפחות 2 ימים. הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן, כמו קולגן-1 ג'ל יחד עם תערובת ציפוי יציב לפחות 5 ימים בחממה. אם תערובת הציפוי מרועננת, ייתכן שתקופות ארוכות יותר יהיו אפשריות, אך פעולה זו לא נבדקה. קריטי הוא הרמה של כיסוי FN, כי זה מונע התייבשות של ג'ל קולגן-1.</li>
</ol>3. שירעי תאים/מיקרוכלי
<ol><li>הוסף 5 מ ל של סרום עגל עוברי ו 2.5 mL של עט/דלקת ל 500 מ ל של השוק הבסיס הטבעי בינונית התרבות ומסנן לעקר באמצעות מסנן העליון בקבוק עם 0.22 יקרומטר גודל הנקבוביות. מדיום זה מכונה כעת בינונית בסיס.</li>
	<li>הכנת בינוני גדילה כלי הדם: להוסיף 3 μL של 50 μg/mL כלי הדם מקדם הצמיחה (בתוספת) ו-2 μL של 20 μg/mL בסיסי הצמיחה פיברומגרם (bFGF) כדי 5 מ ל של המדיום הבסיסי.</li>
	<li>הפשרת iPSC הקפואים-ECs במהירות (< 1 דקות) ב 37 מעלות Cwater ולהעביר לצינור 15 מ ל ולדלל ב 10 מ ל של המדיום הבזליים.</li>
	<li>. תספור את התאים הערה: בקבוקון אחד מכיל 1,000,000 תאים ב 0.5 mL עם > 90% כדאיות.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור ב 100 x g עבור 5 דקות. מבלי להפריע את הגלולה התא ולהשעות מחדש בינונית בסיס כדי להניב ריכוז של 2 x 107 תאים/mL.</li>
	<li>העבר את המיקרופלואידיג 384-צלחת מהאינקובטור ועד למכסה המנוע הסטרילי.</li>
	<li>מזף את התמיסה FN-ציפוי מתוך כניסת הפרזיה (גם A1). הוסף 25 μL של מדיום בסיס בבארות מפרץ (גם A1).</li>
	<li>הוסף droplet 1 μL של השעיית תא לכל הפרזיה העליון היטב (איור 1b, גם A1). ה-droplet צריך לשטח תוך כמה שניות (ראה איור 3a, b להמחשה של שיטת ' שאיבה פסיבית זו '). הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ אם הזריעה היא הומוגנית. אם לא, הוסף עוד 1 μL בשקע והמתן עד שהdroplet משטחת.</li>
	<li>מודקת בצלחת המיקרופלואידיג עבור 1 h ב 37 ° צ', 5% CO2. לאחר מכן, התאים היו צריכים להיות מדבק. . אם לא, חכו עוד 30 דקות</li>
	<li>הסר את המדיום הבזאלי מתוך בארות לשקע העליון (איור 1b, היטב A3). הוסף מדיום תרבות הספינה חם באוויר העליון ולשקע (איור 1b, בארות A1 ו-A3). מניחים את הצלחת על פלטפורמת נדנדה (להגדיר על זווית 7 °, 8 דקות מרווח נדנדה) בחממה (37 ° c, 5% CO2).</li>
	<li>תמונה צלחת באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם שלב אוטומטי ביום 1 ו 2 לאחר זריעה כדי לאשר את הכדאיות של התא. לאחר יומיים, מונאולייר. היה צריך להיווצר כנגד הפיגום הקולגן הערה: אם הערוצים אינם מופיעים באופן שווה, המיקרוכלים יכולים להיות מתורבתים לתוספת של 24 שעות.</li>
</ol>4. לבלוב המחקר הכולל טיפ-ומבנה תא הקנה
<ol><li>להכין 4.5 mL של לבלוב אנגיוגנטית בינוני על ידי להשלים בינונית בסיס עם 4.5 μL של ווארג (50 μg/mL מניות), 4.5 μL של פורבול 12-myristate-13-אצטט (PMA) (2 μg/mL מניות), ו-2.25 μL של ספיגוסינוס-1-פוספט (</li>
	<li>הכינו 8.5 mL של הצמיחה כלי בינונית (בסיס הבסיס שיושלם עם 30 ng/mL ו 20 ng/mL bFGF).</li>
	<li>שאוב מדיום מן הבארות ולהוסיף 50 μL של מדיום תרבות הספינה טרי בקצה העליון ובארות לשקע ובורות ג'ל ובארות לשקע (איור 1b, בארות A1, A3, B1 ו-B3).</li>
	<li>הוסף 50 μl של התערובת הנבט של אנגיוגנטי לכל אחד התחתון בערוץ זלוף ובארות שקע (איור 1b, בארות C1 ו-C3).</li>
	<li>מניחים את המכשיר חזרה בחממה (37 ° c, 5% CO2) על פלטפורמת הנדנדה על מנת ליצור הדרגתי של גורמי גדילה אנגיוגנטית.</li>
	<li>תמונה 1 יום ו 2 ימים לאחר הוספת גורמי הצמיחה אנגיוגנטית באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם שלב אוטומטי. הערה: המשיכו להכין את המיקרוכלים כדי ללמוד השקה (לעבור לסעיף 5) או לתקן ולהכתים את המיקרוכלים כדי לכמת את אורך ומורפולוגיה ביום 2 וביום 6 (עבור לסעיף 6).</li>
</ol>5. מחקר השקה וייצוב נבט
<ol><li>תמונה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם שלב אוטומטי.</li>
	<li>הוסף 1 μL של אלבומין בתווית (0.5 mg/mL) לקצה העליון של הפרזיה (איור 1b, גם A1) ולערבב באמצעות מעבד 50 μl.</li>
	<li>העבר את הצלחת למיקרוסקופ פלורסנט עם הבמה האוטומטית והחממה להגדיר ב 37 ° c. הגדר מיקרוסקופ בקביעות חשיפה נכונה של 10x ונכונות (לדוגמה, טטרמתילרודדין [TRITC]-ערוץ, 20 ms חשיפה). לרכוש תמונות מעידה בזמן בכל דקה עבור 10 דקות.</li>
	<li>הסירו את הצלחת מהמיקרוסקופ והעבירו את הצלחת למכסה זרימה סטרילית.</li>
	<li>להסיר את כל המדיום מן הבארות ולהחליף הן בינונית תרבות הספינה בינוני ולבלוב אנגיוגנטי בבארות המתאימות (ראה שלבים 4.3 ו 4.4).</li>
	<li>מניחים את המכשיר בחזרה לתוך החממה (37 ° c, 5% CO2) כדי להמשיך לבלוב אנגיוגנטית.</li>
	<li>חזור על הצעדים 5.1-5.6 כדי ללמוד את החדירות ביום 6.</li>
</ol>6. קיבעון, כתמים, והדמיה
<ol><li>ומכה את כל מדיית התרבות. מכל הבארות הערה: שיורית מדיום או נוזלים בערוצים microflu, אינו משפיע על הקיבעון בגלל הנפח הנמוך של 1-2 ליטר μL.</li>
	<li>הוסף 25 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS לכל הפרזיה (איור 1b, A1 ו C1) ובארות לשקע (איור 1b, A3 ו-C3). דגירה עבור 10 דקות ב RT. מניחים את המכשיר תחת זווית קלה (± 5 °) כדי לגרום לזרימה (למשל, על ידי הצבת צד אחד של הצלחת על מכסה).</li>
	<li>. מרוב הבארות לשטוף את כל האישופטים ושקעים פעמיים עם 50 μL של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS). . מביס את HBSS מבארות</li>
	<li>החדירות ב-RT עבור 10 דקות על-ידי הוספת 50 μl של 0.2% nonionic החומרים לכל האינלטס ושקעים.</li>
	<li>. מרוב החומרים מבארות לשטוף את ערוצי זלוף פעמיים על ידי הוספת 50 μl של hbss כדי כל מפרץ היתוך ובארות לשקע. . מביס את HBSS מבארות</li>
	<li>הכתם את הגרעינים באמצעות Hoechst (1:2000) ו-F-actin באמצעות phalloidin (1:200) ב HBSS. להכין 2.2 mL עבור 40 יחידות, ולהוסיף 25 μl לכל משקע זלוף ולפורקן היטב. מניחים את הצלחת תחת זווית קלה הדגירה ב RT עבור לפחות 30 דקות.</li>
	<li>שטוף פעמיים עם 50 μl של hbss בכל האינטזיטים והשקעים של זלוף.</li>
	<li>תמונה ישירה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עם שלב אוטומטי או לאחסן את הצלחת מוגן מפני אור ב 4 ° c לשימוש מאוחר יותר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes.">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).</li><li>Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+model+to+reconstitute+sprouting+lymphangiogenesis+in+vitro.">Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 78, 115-128 (2016).</li><li>Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+microfluidic+angiogenesis+screen+for+studying+anti-angiogenic+therapeutic+drugs.">A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs.</a> Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+Biomimetic+Pericyte-Covered+3D+Microvascular+Network.">Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network.</a> PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).</li><li>Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+microenvironment+systems+for+modeling+human+vasculature.">Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature.</a> Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).</li><li>Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+end-user+perspective+on+Organ-on-a-Chip:+Assays+and+usability+aspects.">An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).</li><li>Pagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+design+and+fabrication+of+microfluidic+devices+for+cell+cultures:+An+effective+approach+to+control+cell+microenvironment+in+three+dimensions.">Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions.</a> Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).</li><li>Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineers+are+from+PDMS-land,+Biologists+are+from+Polystyrenia.">Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia.</a> Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8, 14361 (2017).</li><li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research.">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li><li>Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Tissue+and+Disease+Modeling+using+hiPSCs.">Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).</li></ol>

פ. Vulto ו-T. Hankemeier הם בעלי המניות של Mimetas BV. V. בורדורף ו-A. Reijerkerk הם עובדים של Ncardia BV. ו. ואן דוהן, מ. ו. אורלובה ו-איי. אן. או. ואן Zonneveld אין כל גילוי.

שיטה זו מתארת את התרבות של 40 מיקרוסייבל המיקרו-כלי בתוך פלטפורמת תרבות תא מיקרופלואידיסי חזקה ומדרגית. לעומת שיטות התרבות 2D ו-3D המסורתית, שיטה זו מראה כיצד הסביבה הפיזיולוגית הרלוונטית הסלולר הכוללת מעברי צבע ופרזיה רציפה ניתן לשלב עם תרבות תא תלת-ממד עם תפוקה נאותה להקרנה מטרות.
אחד היתרונות העיקריים על פני מיקרופלואידיג המקבילה הוא כי שיטה זו אינה מסתמכת על משאבות עבור זלוף אבל משתמש פלטפורמת נדנדה כדי לגרום זלוף רציפה בכל יחידות microfluidic בו. הדבר מבטיח כי השיטת הפעולה איתנה ומדרגית: לוחיות הרישוי יכולות להיות מוערמות בפלטפורמת נדנדה. חשוב לעשות זאת, כל יחידות microflu, להישאר בנפרד למיעון, אשר מאפשר שיטה זו להיות מיושם בתוך הקרנת סמים כולל הדור של עקומת תגובה מינון. יתר על כן, ללא משאבה, הדמיה החלפת בינונית הוא הרבה יותר פשוט עם פחות סיכון (cross)-זיהום.
יתרון נוסף של שיטה זו הוא שימוש של פלטפורמה סטנדרטית, מיוצר מראש, בעוד מיקרופלואידיג תאים המקבילה פלטפורמות התרבות צריך להיות מפוברק על ידי משתמשי הקצה. זמינות זו מקלה על אימוץ העניין בקרב קבוצות המחקר האקדמיות והפרמצבטיות האחרות, המובילות לסטנדרטיזציה. כמו כן, בניגוד מיקרו-טיפוס מיקרופלואידים, ממשק הצלחת 384-באר מבטיח תאימות עם ציוד המעבדה הנוכחי (למשל, משמרים, מטפלים בצלחות ו פיפטות רב-ערוצי), הקלה על האינטגרציה בתוך תשתית ההקרנה הנוכחית .
קיימים מספר שלבים קריטיים בביצוע הפעולה. ג'ל קולגן-1 צריך למלא לחלוטין את ערוץ ג'ל. במהלך טעינת ג'ל, ניתן לצפות במילוי זה על-ידי בדיקת הערוצים המיקרופלואידים דרך חלון התצפית (איור 2a) או על-ידי היפוך הצלחת הפוך (כפי שמוצג באיור 1a). בזמן המילוי, ג'ל הקולגן צריך להישאר במרכז הערוץ, מבלי לזרום לתוך ערוצי זלוף סמוכים. שמנו לב כי איכות ה-קולגן-1 ג'ל היא חיונית לביצוע הביצועים הנכונים. קולגן-1 אצוות עם צמיגות גבוהה מדי יוביל למילוי לא שלם של הערוץ ג'ל. לאחר 10 דקות של פולימוניזציה ב-37 ° c, הג צריך להיות הומוגנית וברור. אם קולגן -1 לא מאוחסן כראוי (למשל, עקב הטמפרטורות לתנודות במקרר), קולגן יהיה לפולימו בתוך הערוצים עם היווצרות סיבים גלויים בבירור. זה יכול לגרום לפלישה של ECs לתוך הג ללא תוספת של גורמים אנגיוגנטיים, אך ללא התפתחות נאותה לומן.
כאשר התאים הם נזרע, הפתרון ציפוי fibronectin מוסר מן הבארות, משאיר רק את ערוצי microflu, מלאים בפתרון ציפוי. שאיפה של פתרון ציפוי מצינורות microflu, יכול לגרום הפרעה ג'ל או שאיפה ג'ל. ההשעיה התא צריך להחליף/להחליפו זה פתרון ציפוי. זה עובד בצורה הטובה ביותר כאשר ההשעיה התא הוא נזרע באמצעות שיטת שאיבה פסיבית, כמו באופן ישיר ללטף את ההשעיה התא לתוך הערוצים להראות צפיפות הזריעה פחות.
כאשר המיקרוכלים יוצרים מונאולייר יציב כנגד הג, הבדלים קטנים אלה מהווים בזמנים שונים הדרושים לצורך הגעה לשטף. לפיכך, נקודת ההתחלה של הקביעה נקבעת בשטף ולא בזמן התרבות. במידת הצורך, ניתן להאריך את זמן התפירה עד שמונאולייר ברור נוצר כנגד הג.
בתוך הבארות, בועות אוויר יכול להיות לכוד על ידי מילוי שגוי של הבארות (ראה איור 2b). אלה בועות אוויר יהיה להגביל את זרימת המדיום, גם כאשר המכשיר ממוקם על פלטפורמת נדנדה, וכתוצאה מכך קריסה של מיקרוכלי מעבר הדרגתי היווצרות המעבר. לחיצה על עצת הפיפטה כנגד הקיר הצדדי של הבארות תגדיל את ההצלחה של מילוי מלא של הבאר. אם בועת אוויר לכודה בתוך הבארות, זה יכול להיות מוסר על ידי החדרת בעדינות קצה הצנרת סטרילי לתחתית הזכוכית. בועות אוויר יכולות להתרחש גם בתוך הערוצים microfluidic. כאשר המדיום הוסר מן הבארות, אידוי של בינוני מורגש מתוך הערוצים microflu, לאחר 30 דקות (עקב כרכים מיקרוליטר בתוך הערוצים). לפיכך, שינויים בינוניים רצוי לבצע במהירות האפשרית. כאשר המדיום מתווסף בערוץ עם בינוני התאדה, בועות האוויר יהיה לכוד בתוך ערוצי microfluidic. אלה בועות אוויר בתוך הערוצים microflu, ניתן להסיר באופן ידני על ידי הצבת מP20 הצינורות ישירות על מפרץ או לשקע ולאלץ בינוני דרך microfluidic מתוך הבאר הפוכה. הסרה מוצלחת של בועות האוויר מביא לירידה קטנה אך ניכרת בנפח הטוב האחר. טבלה 1 מפרטת שגיאות נפוצות וכיצד לפתור אותן.
חוסר משאבה היא מגבלה כאשר הדמיה רציפה נדרשת, כמו פלטפורמת הנדנדה מגביל את המשתמש לתמונה במרווחי זמן רציפים. יתרה מזאת, הפרזיה של המדיום בפלטפורמה זו מורכבת מזרימה דו-כיוונית עם רמות נמוכות של מתח הטיה, ואילו יום נחשף לזרימה חד כיוונית עם רמות גבוהות יותר של מתח הטיה. בעוד אנו לא מתבוננים בהשפעות שליליות של הזרימה הדו-כיוונית ביחס לליבלוב האנגיוגנטית, הזרימה היא גירוי ביומכאני חשוב ורצוי לשליטה. עם זאת, בעוד יש כיוונוני משאבה זמינים מסחרית, ממשק עם צלחת 384-באר נשאר מאתגרת והגדרות המשאבה לעכב באופן חמור את המדרגיות של שיטת הפעולה.
האפשרות להשתמש iPSC-ECs ללמוד לבלוב אנגיוגנטית פותח הזדמנויות חדשות במידול מחלות ומחקר הסמים. בניגוד ECs הראשי, תאים אלה יכולים להיווצר כמויות כמעט ללא גבולות עם גנוטיפ יציבה, על ידי שימוש בטכניקות עריכת הגנום, התאים ניתן ליצור כי כולל הסתרה גן ו טוק-ins. עם זאת, כמו הפרוטוקולים להבדיל ECs מ-iPSC הם חדשים יחסית, זה עדיין לא ברור מה מוביל iPSC-ECs כי הטוב ביותר לשקף ECs הראשי ואילו תתי-משנה של EC או ניתן ליצור. בנוסף, עדיין נותרו שאלות לגבי הרלוונטיות שלהם. לדוגמה, האם ה-iPSC-ECs עדיין מפגין את הפלסטיות האופייני לתאי האנדותל? ולאיזו מידה התאים הנגזרים מגיבים ופועלים עם המיקרו-סביבה הסלולרית שלהם? הפלטפורמה הסטנדרטית המוצגת כאן יכולה לשמש כדי לענות על כמה מהשאלות הללו כדי לאמת עוד יותר את השימוש של ECs-הנגזרים מתוך מבחנה.
הכיוון העתידי הישיר ביותר לצורך מעשה זה יהיה שילוב של סוגי תאים אחרים המשחקים תפקיד חשוב במהלך אנגיוגנזה, כגון קרום הלב ומקרופאגים. זה יקל על היכולת ללמוד את התפקיד של מקרופאגים בזמן ההשקה בין נבטים או הדבקות של קרום הלב לאחר היווצרות נימי. כמו כן, ניתן לתרבות סוגים שונים של תאים אחרים בתוך או נגד מטריצה המומנת (למשל, הראינו את התרבות של הנוירונים ומבנים אפיתל שונים כגון tubules האבוליים ומעיים קטנים), אשר ניתן לשלב עם כלי הדם מיטות שנוצרות באמצעות שיטה זו. לבסוף, יהיה זה מעניין ללמוד לבלוב אנגיוגנטי בהידרוגים סינתטיים, כיוון שהרכב המוגדר שלהם מגדיל עוד יותר את התקינה של המבנה ומאפשר כוונון נוקשות ומניעים מחייבים המשפיעים על אינטראקציות מטריצות של תאים.
לסיכום, שיטה זו מציגה את הכדאיות של ECs-הנגזרים מתוך מתקן מתוקננת ומדרגי תלת-ממדי, המשלב את תנאי התרבות הרלוונטיים הפיסיולוגיים בפלטפורמה בעלת החוסן והמדרגיות הנדרשים שישולבו בתוך תשתית סינון הסמים.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 &#181;L of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 &#181;L of basal medium in the outlet well (well A3).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

במודלים של חוץ גופית ממלאים תפקיד בסיסי בגילוי ובתיקוף של מטרות סמים חדשות של מחלות כלי דם. עם זאת, במודלים מסוימים של הקרנת מבחנה שלהם יש תפוקה מספקת יש רלוונטיות פיזיולוגית מוגבלת1, המעכבת את תרגום הממצאים מחוץ לvivo. כך, כדי לקדם קליני מראש מחקר התרופות כלי דם, שיפור במודלים החוץ-גופית של יום יש צורך לשלב הקרנת תפוקה גבוהה עם מיקרו-הסביבה הרלוונטית הסלולר 3d.
במהלך העשור האחרון, נעשה התקדמות משמעותית כדי להגביר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים מתחום החוץ של הvasקולטורה. במקום תאים אנדותל שטוח על משטחים שטוחים כגון פלסטיק רקמות הרקמה, תאים אנדותל יכול להיות מוטבע בתוך מקפלים תלת-ממד, כגון פיברוב ו ג'ל קולגן2. בתוך מטריצות אלה, התאים האנדותל להראות פנוטיפ רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית הקשורים השפלה מטריקס היווצרות לומן. עם זאת, מודלים אלה מדגימים רק קבוצת משנה של התהליכים הרבים המתרחשים במהלך לבלוב האנגיוגנטי כמו רמזים חשובים מהסביבה הסלולרית עדיין חסרים.
פלטפורמות התרבות התא מיקרופלואידיג מתאימים באופן ייחודי כדי להגדיל עוד יותר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים של מבחנה של ואסילטטורה. לדוגמה, ניתן לחשוף את תאי האנדותל למתח הטיה, שהוא גירוי ביומכאני חשוב עבור ואסילטורה. גם, את האפשרות מרחב שליטה נוזלים בתוך מיקרופלואידיקה מאפשר היווצרות של מעברי צבע ביוקולריות3,4,5,6. מעברי צבע כאלה ממלאים תפקיד חשוב בvivo במהלך היווצרות והתהוות במהלך האנגיוגנזה. עם זאת, בעוד מיקרופלואידיג תא התרבות פלטפורמות הראו רלוונטיות פיזיולוגית ללא תחרות על המסורתי 2D ו-3D שיטות תרבות התא, הם לעתים קרובות חסר התפוקה הנדרשת, המדרגיות והתקינה הנדרשת עבור הקרנת סמים 7. גם, רבים של פלטפורמות אלה אינם זמינים מסחרית ודורשים את הקצה משתמשי למיקרו המכשירים שלהם לפני השימוש8. זה לא רק דורש מכשיר הייצור והידע הטכני, אלא גם מגביל את רמת בקרת איכות לרעה משפיע על התוכסות9.
עד היום, התאים הראשוניים של האדם הראשי נשארים מקור התאים הנפוץ ביותר למודל אנגיוגנזה בתוך מבחנה10. עם זאת, לתאים אנושיים ראשוניים יש מספר מגבלות המעכבו את היישום השגרתי בגישות ההקרנה. ראשית, קיימת אפשרות מוגבלת להגדיל ולהרחיב את התרבויות הראשיות הנגזרות תאים. כך, עבור ניסוי בקנה מידה גדול, קבוצות של תורמים שונים צריך להיות בשימוש, מה שגורם הבדלים גנומית ו אצווה-to-אצווה וריאציות. שנית, לאחר כמה קטעים, תאי האנדותל הראשוניים מאבדים בדרך כלל נכסים רלוונטיים כאשר הם מתורבתים בתוך מבחנה11,12.
תאים אנדותל שמקורם בתאי גזע המושרה על ידי האדם (iPSC) הם חלופה מבטיחה: הם דומים התאים הראשוניים, אבל עם גנוטיפ יציבה יותר כי הוא גם נוטה לעריכת הגנום מדויק. יתר על כן, iPSCs מסוגלים לחדש את עצמי ולכן ניתן להרחיב כמויות כמעט בלתי מוגבל, אשר להפוך את התאים הנגזרים iPSC חלופה אטרקטיבית תאים ראשוניים לשימוש בתוך מודלים מחוץ לתחום הסינון13.
כאן, אנו מתארים שיטה לתאי התרבות האנדותל ככלי תלת-ממד תלת-ממדי בפלטפורמת מיקרופלואידיc מתוקננת עם תפוקה גבוהה של תאים. Perfusion מוחל על ידי הצבת המכשיר על פלטפורמת נדנדה, אשר מבטיח פעולה חזקה ומגדיל את המדרגיות של התהליך. כאשר המיקרוכלים מנוצלים באופן רציף וחשופים למעבר של גורמי אנגיוגנטיים, לבלוב אנגיוגנטי מחקר בסביבה פיזיולוגית יותר של מיקרואקולוגיה סלולרית. בעוד הפרוטוקול תואם מקורות שונים של (הראשי) בתאי האנדותל14,15, התמקדנו בשימוש ב-ipsc האנושי-ecs הנגזר על מנת להגביר את הסטנדרטיזציה של השיטה ולהקל על שילובם בתוך מחקר של תרופות כלי דם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-10 &#956;L Electronic repeater pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z654566-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-lane OrganoPlate</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td>4003-400B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal culture medium</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-1</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Biopur 2.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Repeater M4 pieptte</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4759-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3569</td>
			<td>10 mg/mL solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-derived endothelial cells</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>37 g/L in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td></td>
			<td>Rocker platform used to provide flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Focus-Biomolecules</td>
			<td>10-2165</td>
			<td>2 &#956;g/mL in PBS containing 0.1% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1P</td>
			<td>Ecehelon Biosciences</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>1 mM in methanol containing 1% acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32-10</td>
			<td>50 &#956;g/mL in water containing 0.1% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro

מחקר התרופות הפרה-קליני של מחלות כלי הדם דורש במודלים של ואצלב שamendable להקרנה בתפוקה גבוהה. עם זאת, במודלים מסוימים של הקרנת מבחנה שאין להם תפוקה מספיקה יש להם רלוונטיות פיזיולוגית מוגבלת, המעכבת את תרגום הממצאים מחוץ לvivo. מצד שני, פלטפורמות תרבות התאים המיקרופלואידיc הראו רלוונטיות פיזיולוגית שאין כמוה במבחנה, אך לעתים קרובות חסרה התפוקה, המדרגיות והסטנדרטיזציה הנדרשים. אנו מדגימים פלטפורמה איתנה לחקר אנגיוגנזה של תאי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה על ידי האדם (ipsc-ecs) בסביבה פיסיולוגית תאית רלוונטית, כולל זלוף ומעברי צבע. IPSC-ECs הם מתורבתים כמו 40 המכונה 3D מיקרוכלי מיקרו נגד הגרדום קולגן-1. עם יישום של הדרגתי של גורמים אנגיוגנטיים, הסימנים החשובים של אנגיוגנזה ניתן ללמוד, כולל הבידול לתוך תא קצה וקנה והיווצרות של לומן מבשם. Perfusion עם צבע מעקב פלורסנט מאפשר ללמוד חדירות במהלך ואחרי ההשקה של נבטי אנגיוגנטית. לסיכום, שיטה זו מציגה את הכדאיות של ECs-הנגזרים מתוך מתקן מתוקננת ומדרגי תלת-ממדי, המשלב את תנאי התרבות הרלוונטיים הפיסיולוגיים בפלטפורמה בעלת החוסן והמדרגיות הנדרשים שישולבו בתוך תשתית סינון הסמים.

הפלטפורמה התלת-ממדית של מיקרופלואידיג מורכבת מ40 מיקרופלואידים (איור 1a, b), המשמשת לחקר לבלוב אנגיוגנטית של מיקרואוניות מיקרו נגד ג'ל קולגן-1 (איור 1a). המיקרוכלים הללו מנוצלים באופן רציף וחשופים למעבר של גורמי גדילה באמצעות אנגיוגנטיים (איור 3a-d). נבטי אנגיוגנטית ניתן ללמוד 2 ימים לאחר חשיפה הדרגתי או תרבותי במשך יותר מ 5 ימים לאחר חשיפה הדרגתי כדי ללמוד ההשקה וייצוב נבט (ראה ציר הזמן, איור 1d).
זריעת iPSC-ECs באמצעות שיטת שאיבה פסיבית צריך לגרום לצפיפויות זריעה הומוגנית (איור 4a, b). התרבות תחת הפרזיה רציפה הביאה לידי מיקרואוניות בתוך יומיים, כאשר התאים מצוידים לגמרי בהיקף של הערוץ המיקרו-פלואידיסי והיווצרות מונאולייר שוטפת נגד הג הקולגן-1.
חשיפה למעבר של גורמים אנגיוגנטיים הביא לבלוב אנגיוגנטית כיוונית של המיקרוכלים בתוך הקולגן בדוגמת-1 ג'ל (איור 5a-g). ברור היווצרות תא עצה והפלישה לתוך הג'ל קולגן-1 היה גלוי 24 שעות לאחר הוספת מעבר הצבע אנגיוגנטי, בעוד תאי גבעול כולל היווצרות לומן נראו לאחר 48 h (איור 5a).
לאחר קיבעון וכתמים, רשת קפילר ניתן לדמיין באמצעות phalloidin לכתם F-actin ובאמצעות Hoechst 33342 להכתים את הגרעין (איור 5b, c). ניצנים אלה ניתן לכמת (למשל, צורה ואורך14). ללא תוספת של גורמי גדילה, אין חדירה לתוך ג'ל קולגן-1 צריך להיות נצפתה (איור 5d). הדמיה confocal וקד שימש כדי לקבוע את קוטר נבט כדי לאשר היווצרות לומן (איור 5e-g).
הנבטים ממשיכים לצמוח לכיוון מעבר הצבע ולהגיע לתעלת הפרזיה הנגדית בתוך 3-4 ימים לאחר הוספת גורמי גדילה באמצעות אנגיוגנטית. התוצאה היא שיפוץ של רשת כלי הדם, עם ירידה ברורה במספר נבטי אנגיוגנטי (איור 6a). היווצרות לומן הוערך על ידי זלוף של הרשת כלי דם עם תווית fluorescently (למשל, אלבומין או דקטרנס). מבשם שירה המיקרוכלים עם 0.5 mg/mL המסומנים אלבומין לפני ואחרי ההשקה חשפה הבדל ברור חדירות נבט לאחר 10 דקות (איור 6b-e), אשר מרמז כי נימים לייצב ובוגרת לאחר ההשקה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig1.jpg"> איור 1: פרוטוקול תרבות התאים המיקרופלואידיסי לכלי מיקרו של iPSC. (א) החלק התחתון של המכשיר התרבות התא microflu, מוצג הצגת היחידות מיקרופלואידיג 40 משולבים מתחת לצלחת 384-באר. תצוגה גדולה יותר מציגה את אחת היחידות של מיקרופלואידיג 40. (ב) כל יחידת microflu, ממוקמת מתחת 9 בארות עם 3 בארות כניסת ו 3 בארות שקע. הערוצים המיקרופלואידים מופרדים על-ידי רכסים (' מדריכים '), המאפשרים את הפגל של הידרוג בערוץ המרכזי (' ג'ל ערוץ '), בעוד שעדיין יש קשר עם הערוצים הסמוכים (' ערוצי perfusion '). (ג) שיטה לתרבות מיקרוכלי מיקרו בתוך המכשיר המיקרופלואידיג, המשמש לחקר לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי דרך מטריצה קולגן-1 מתבנית. (ד) ציר זמן ללימוד לבלוב אנגיוגנטי ו/או השקה. דמות זו שונתה מוואן דונן ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig2.jpg"> איור 2: טעינת הליכי ג'ל ובינוני. (א) דוגמאות לתצהיר נכון ושגוי של ג'ל. הגשת התוצאות הנכונות ב קולגן-1 ג'ל בתוך הערוץ האמצעי, אשר לאחר מכן הפילמור. (ב) דוגמאות למילוי נכון ושגוי של הבארות. הבארות מולאו בסדר של 1-4 כדי למנוע השמנה של בועות אוויר בתוך הערוצים המיקרופלואידים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig3.jpg"> איור 3: לחץ הידרוסטטי רציפה זרימה מונחה הדרגתי ייצוב. (א) שינוייםבלחץ הידרוסטטי בין הבארות הנובעים מזרימה פסיבית וזורמת בתוך הערוצים המיקרופלואידים. (ב) הצבת המכשיר על פלטפורמת נדנדה להגדיר ב 7 ° ו 8 דקות מחזור הזמן התוצאות ברציפות, דו-כיווני בתוך הערוצים מיקרופלואידיc. (ג) מעברי צבע נוצרות על ידי החדרת שני ריכוזים שונים בתוך הבארות, אשר מרעננים ברציפות על ידי איזון פסיבי. (ד) הדמיית הדרגתי באמצעות fluorescein isothiocyanate (fitc)-dextran. זרימה דו-כיוונית מייצבת את מעבר הצבע עד 3 ימים. סרגל קנה מידה = 200 μm. דמות זו שונתה מוואן דונן ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig4.jpg"> איור 4: שיטת שאיבה פסיבית לזריעת תאים. (א) שאיבה פסיבית מונעת על ידי הבדלים בלחץ הנגרמים על ידי הבדלים מתח פני השטח. התוצאה היא זרימה מ-droplet (לחץ פנימי גבוה) לעבר המאגר (לחץ פנימי נמוך). (ב) מעידה על הזמן של droplet (מיתאר אפור) הממוקם על גבי החלק העליון (קו מיתאר לבן) של ערוץ microfluidic (מיתאר כחול). מיד לאחר הוספה (איור 4b, i), את ה-droplet על גבי כניסת האוויר מכווץ (איור 4b, ii: 1 לאחר הוספה; iv: 2 s לאחר התוספת), אשר גורמת לזרימה לכיוון השקע. זה נמשך עד ה-droplet מניסקוס מוצמד על ידי מפרץ (איור 4b, iv). סרגל בקנה מידה = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig4large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig5.jpg"> איור 5: לבלוב חזק תלת-ממדי של מיקרוכלים iPSC-EC. (א) לבלוב של ipsc-EC לאורך זמן. מיקרואוניות גדלו עבור 48 h (מימין) ולאחר מכן מגורה עם קוקטייל אנגיוגנטי המכיל 50 ng/mL, 500 nM S1P, ו-2 ng/mL PMA. הקצה הראשון-תאים הפולשים קולגן-1 פיגום (באמצע) הם גלויים 24 h לאחר החשיפה. לומן הראשון גלויים (חיצים) 48 h לאחר החשיפה (מימין) בזמן שתאי הקצה היגרו עוד יותר לכיוון מעבר הצבע. (ב) מערך של 15 מיקרואוניות שהיו מוסטימולציה ב-S1P ו-pma במשך יומיים ומוכתם ב-F-actin (צהוב) ובגרעינים (כחול). סרגל בקנה מידה = 200 μm. (ג) מגורה מיקרוכלי (שליטה חיובית). (ד) מיקרו-כלי לא מגורה (שליטה שלילית). (ה) ההטלה המקסימלית של נימי אחד בתוך הג. (ו) כמו (ז) אבל מרוכז באמצע. קו מנוקד מציין את מיקומו של התצוגה האורתוגונלית בלוח g. סרגלי קנה מידה (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig6.jpg"> איור 6: הדמיה של חדירות נבט-אנגיוגנטי לפני ואחרי ההשקה. (א) השקה עם ערוץ בסיס מעורר גיזום והתבגרות של נבטי אנגיוגנטי. Closeup של מיטה קפילר ב 2, 4, 6 ו -7 ימים לאחר גירוי עם גורמי צמיחה אנגיוגנטית. (ב) אנגיוגנטי נבטי לאחר יומיים לאחר הוספת גורמי צמיחה אנגיוגנטיים. נבטי אנגיוגנטיים נוצרים בתוך ג'ל, אך עדיין אינם מחוברים לערוץ הפרפיוז התחתון. (ג) perfusion של מיקרוכלי עם 0.5 Mg/mL אלבומין 555 פתרון. תמונות פלורסנט שהתקבלו ב -0 ו -10 דקות (d, e) זהה לחלוניות b ו-c, אך לאחר 7 ימים של גירוי. נבטים מחוברים לצד השני ויצרו מיקרוכלי מיקרו בערוץ הפרפיוז הבזלי. קנה מידה ברים = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>עיה</td>
			<td>כי</td>
			<td>פתרון</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">קולגן -1 לא להיכנס או למלא את הערוץ לחלוטין</td>
			<td>הקולגן-1 droplet אינו ממוקם על גבי כניסת</td>
			<td>בזהירות למקם את ה-droplet על גבי השקע מערוץ ג'ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>נפח של קולגן-1 נמוך מדי</td>
			<td>השתמש 1.5 μL של ג'ל כדי למלא את הערוץ לחלוטין</td>
		</tr>
<tr>
<td>קולגן-1 הוא יותר מדי צמיגי</td>
			<td>השתמש באצווה אחרת של קולגן -1</td>
		</tr>
<tr>
<td>קולגן -1 זורם לתוך ערוצי זלוף</td>
			<td>קולגן-1 הוא מצינורות ישירות לתוך הערוץ של ג'ל</td>
			<td>בזהירות למקם את ה-droplet על גבי השקע מערוץ ג'ל</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">קולגן -1 הוא לא ברור/סיבים היווצרות</td>
			<td>קולגן -1 לא מאוחסן כראוי</td>
			<td>חנות קולגן -1 ב 4 ° c, לא להקפיא</td>
		</tr>
<tr>
<td>נחקו3 ו-hepes אינם מעורבים היטב לפני הוספת קולגן -1</td>
			<td>בזהירות לערבב את נחקו3 ו hepes ידי ליטוף לפני הוספת קולגן -1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Droplet אינה מכווץ באמצעות שיטת שאיבה פסיבית</td>
			<td>Droplet דבקה לצד הבאר</td>
			<td>מנושף את droplet ומוסיפים droplet חדש על גבי כניסת האוויר</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ודא היטב לשקע מתמלא לפחות 20 μL של בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">לבלוב לא נצפתה</td>
			<td>גורמי גדילה אינם נוספים או שאינם מאוחסנים כראוי</td>
			<td>הכנת מבנה לבלוב אנגיוגנטי טרי</td>
		</tr>
<tr>
<td>בועת אוויר בלוקים perfusion/מעבר הדרגתי היווצרות</td>
			<td>הסרת בועות אוויר באמצעות P20 או P200 פיפטה</td>
		</tr>
<tr>
<td>הבדלי נפח בין בארות</td>
			<td>כרכים בכל הבארות צריכים להיות שווים כדי ליצור מעבר צבע ליניארי</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">תאים שאינם ניתנים לקיימא</td>
			<td>הצלחת לא מונחת על פלטפורמת נדנדה/פלטפורמת נדנדה כבוי</td>
			<td>ודא פלטפורמת נדנדה הוא על ויש לו את הזמן/זווית מחזור הנכון (8 דקות/7 °)</td>
		</tr>
<tr>
<td>לא ניתן לפרזיה בשל נוכחות של בועות אוויר</td>
			<td>הסרת בועות אוויר באמצעות P20 או P200 פיפטה</td>
		</tr>
<tr>
<td>אין לומן נוצרות, תאים העוברים כתאים בודדים</td>
			<td>לבלוב של אנגיוגנטית התווסף לפני שמונאולייר הוקם</td>
			<td>המתן 24 שעות נוספות לפני הוספת גורמי הגדילה האנגיוגנטיים</td>
		</tr>
<tr>
<td>וריאציה מרכזית בדחיסות הנביטה</td>
			<td>הבדלים בין צפיפויות תאים לאחר זריעת</td>
			<td>בדוק אם צפיפות התא היא הומוגנית ומקבילה בין יחידות microfluidic. הוסף עוד droplet של השעיית תא במקרה הצורך</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פתרון בעיות של שגיאות נפוצות.

Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.

שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

זה assay במבחנה מדגים ניצנים אנגיוגניים בתפוקה גבוהה פלטפורמה מדרגית. זה יכול לשמש כדי למצוא מטרות חדשות באנגיוגנזה. בדיקה זו של אנגיוגנזה משלבת סביבות מיקרו תאיות מורכבות הכוללות מעברי צבע וזלוק עם פלטפורמה התואמת להקרנת תפוקה גבוהה.אנגיוגנזה ממלאת תפקיד חשוב הן בבריאות והן במחלות. הבנת המנגנונים המתרחשים במהלך אנגיוגנזה יכולה לעזור לנו להבין כיצד סרטן לגדול וכיצד רקמות לתקן. שיטה זו יכולה לתת תובנה במנגנונים במהלך מחלות לב וכלי דם והתחדשות רקמות.בשניהם, אנגיוגנזה ממלאת תפקיד חשוב. לשימוש הראשון של פלטפורמה microfluidic זה, אתה צריך להיות מודע לחוק של כרכים וכיצד pipette. אתה יכול לאשר את השלבים על ידי הסתכלות תחת מיקרוסקופ או היפוך הלוח במהופך.כמה צעדים קשה לקבל תחושה כאשר רק לקרוא את השיטה, למשל כמה קטנים הערוצים microfluidic או איך להחזיק את הצלחת. מדגימה את ההליכים האלה תהיה וונדי סתאם, טכנאית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, להעביר את צלחת microfludic 384 היטב למכסה המנוע לזרום למינאר סטרילי.הסר את המכסה והוסף 50 מיקרוליטרים של מים או פוספט אגף מלוחים לכל אחת מ -40 בארות התצפית באמצעות פיפטה רב ערוצית. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של ארבעה מיליגרם למיליליטר קולגן פתרון אחד להיכנס לג'ל של כל יחידה מיקרופלואידית. ודא טיפת ג'ל ממוקם באמצע כל באר על מנת ג'ל להיכנס לערוץ.לאחר מילוי חמש יחידות microfluidic, להפוך את הצלחת במהופך כדי לבדוק חזותית מילוי נכון של תעלות ג'ל. מניחים את הצלחת המיקרופלודית באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 דקות כדי להפוך קולגן אחד לפולימרי. לאחר מכן מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומעבירים למכסה המנוע של לזרימה סטרילית.הוסף 50 microliters של 10 מיקרוגרם לכל פתרון קידוד fibronectin מיליליטר לשקע היטב של ערוץ מושלם העליון של כל יחידה microfluidic. לחץ על קצה פיפטה בצד של באר למילוי נכון של באר מבלי ללכוד בועות אוויר. הערוץ מתמלא והמחבתות הנוזליות בשקע מבלי למלא היטב את השקע.לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור לפחות יומיים. עכשיו, במהירות להפשיר את IPSC-ECs הקפואים במשך פחות מדקה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר לאט להוסיף 10 מיליליטר של מדיום בסיסי לדלל.צייר 10 מיקרוליטרים של הפתרון וספיר את התאים על מונה תאים. צנטריפוגה הצינור ב 100 פעמים g במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא ולחץ מחדש במדיום הבסיסי כדי להניב ריכוז של פי 2 10 לתאים השביעיים למיליליטר.לאחר מכן, מעבירים את צלחת ה-384 באר המיקרופלואידית מהאינקובטור למכסה המנוע הסטרילי של זרימת למינאר. שאפו את תספורת הקידוד פיברונאטין משקע הזליף והוסיפו 25 מיקרוליטרים של מדיום בסיס בארות השקע. הוסף טיפת מיקרוליטר אחת של השעיית תא לכל מפרץ תפוקה עליון היטב.טיפה משתטחת בכמה שניות. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הזריעה הומוגנית בערוץ אחד ובין ערוצים. הדגירה את צלחת באר microfluidic במשך שעה עד 1.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, בדוק את התאים כדי לוודא שהם דבקו. מוציאים את המדיום הבסיסי מ הבאר העליונה של שקע הזלבול. הוסף מדיום תרבות כלי חם בתוך תדלוק העליון ושקע.מניחים את הצלחת על פלטפורמת נדנדה אשר מוגדר על זווית שבע מעלות ושמונה דקות מרווח נדנדה באינקובטור. ביום הראשון ושניים לאחר הזריעה, תדמיין את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ של ברייטפילד עם שלב אוטומטי כדי לאשר את כדאיות התא. לאחר יומיים, מונוליאר קונפלנטי נוצר נגד פיגום קולגן אחד.ראשית, להכין 4.5 מיליליטר של מדיום נבט אנגיוגניים על ידי השלמת 4.5 מיליליטר של מדיום בסיס עם 4.5 microliters של מלאי VEGF, 4.5 microliters של מלאי PMA, ו 2.25 microliters של מלאי S1P. הכן 8.5 מיליליטר של מדיום צמיחת כלי על ידי השלמת מדיום בסיס עם 5.1 microliters של VEGF ו 3.4 microliters של BFGF. שאפו מדיום מה בארות והוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום תרבות כלי טרי ב מפריצת התדלוק העליונה וב בארות שקע ושקע ג'ל אינלט בארות שקע.לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת נבטים אנגיוגנית לכל אחד מפריצת ערוץ הזייה התחתונה ובירות שקע. מניחים את הצלחת בחזרה לתוך החממה על פלטפורמת הנדנדה על מנת ליצור שיפוע של גורמי גדילה אנגיוגניים. יום ויומיים לאחר הוספת גורמי הגדילה האגיוגניים, השתמש במיקרוסקופ של Brightfield כדי לדמיין את הבארות על במה אוטומטית.כדי ללמוד anastomosis וייצוב נבטים, להוסיף מיקרוליטר אחד של 0.5 מיליגרם למיליליטר פלואורסצנטי שכותרתו אלבומין לתוך החיסון העליון. ואז לערבב את הפתרון עם פיפיטר 50 מיקרוליטר. מעבירים את הצלחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי עם במה אוטומטית וחממה ב-37 מעלות צלזיוס.הגדר את המיקרוסקופ למטרה 10X ותקן את הגדרות החשיפה. להשיג תמונות timelapse כל דקה במשך 10 דקות. מוציאים את הצלחת מהמיקרוסקופ ומעבירים את הצלחת למכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית.מוציאים את כל המדיום מה בארות ומחליפים הן את מדיום תרבות כלי הדם והן את מדיום ההבטה האנגיוגני בארות המתאימות. מניחים את הצלחת המיקרופלואידית בחזרה לתוך החממה כדי להמשיך נבטים אנגיוגניים. ביום השישי, חזור על ההדמיה כדי לחקור את ההתחלחלות.כדי לתקן את תרבות התאים, שאף את כל המדיה התרבותית מה בארות. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של 4%PFA ב-PBS לכל מפרצות התדלוק והשקעים. לאחר מכן מניחים צד אחד של הצלחת המיקרופלואידית על המכסה בזווית קלה של חמש מעלות כדי לגרום לזרימה.דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאף את PFA מה בארות. לשטוף את כל מפרצות נזיפה ושקעים פעמיים עם 50 microliters של HBSS.ואז לספירה HBSS מה בארות. Paraformaldehyde הוא כימיקל מסוכן אשר צריך להיות מטופל לובש כפפות רק נפתח ברדס אדים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 0.2% חומרים פעילי שטח לא יוניים לכל מפרצי החלחלה והשקעים כדי לחלחל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולה מניחים את הלוחית המיקרופלואידית על המכסה בזווית קלה של חמש מעלות.שאפו את חומר הגלישה הלא יוני מה בארות ושטפו פעמיים את תעלות התדלוק על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של HBSS לכל מפרצות התדלוק ובירות השקע. שאף את HBSS מה בארות. הכן Hoechst 1, 000 כדי 2, 000 עבור הכתמת הגרעינים ולהכין פאלודין 100 כדי 200 ב HBSS עבור הכתמת F-actin.שלב שישה מיליליטר של HBSS, 30 מיקרוליטרים של F-actin, ושלושה microliters של Hoechst בצינור פלקון. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים לכל מפריצת נזיפה ושקע היטב. מניחים את הצלחת תחת זווית קלה ודגירה בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.יש לשטוף פעמיים עם 50 מיקרוליטרים של HBSS בכל מפרצות התדלוק והשקעים. ואז ישירות תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם שלב אוטומטי או לאחסן את הצלחת מוגנת מפני אור בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. בפרוטוקול זה, כלי המיקרו היו מנוורים ברציפות ונחשפו לשיפוע של גורמי גדילה אנגיוגניים.זריעת IPSC-ECs באמצעות שיטת שאיבה פסיבית הביאה צפיפות זריעה הומוגנית. timelapse של טיפה כי הוא ממוקם על גבי הכניסה של הערוץ microfluidic מראה את טיפה מיד לאחר תוספת, טיפה על גבי תא המטען של הכניסה לאחר תוספת, עד מניסקוס טיפה הוצמד על ידי הכניסה אשר הביא זרימה לכיוון השקע. חשיפה לשיפוע של גורמים אנגיוגניים הביאה להפקעת אנגיוגנית כיוונית של כלי המיקרו בתוך ג'ל קולגן אחד בדוגמת.היווצרות תאי קצה ברורים וחדירה לתוך הקולגן ג'ל אחד נראה 24 שעות לאחר הוספת שיפוע אנגיוגניים בעוד תאי מלאי כולל היווצרות לומן היו גלויים לאחר 48 שעות. לאחר קיבעון וכתמים זוהו הצורה והאורך של נבטים אלה. עם זאת, ללא תוספת של גורמי גדילה, לא נצפתה פלישה לתוך הקולגן ג'ל אחד.עם הדמיה קונפוקל, קוטר הנבט נקבע ואת היווצרות לומן אושרה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לסנן מעכבי אנגיוגניים חדשים. זה יכול לעזור למצוא טיפולים חדשים נגד רטינופתיה סוכרתית, דלקת מפרקים שגרונית וסרטן.אנו בוחנים כעת כיצד אנו יכולים ליצור תרבויות שיתוף כולל מודל של מחסום הדם - מוח ואברנואידים וסקולריים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...