Name: standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Questo lavoro è in parte sostenuto da una sovvenzione di ricerca del programma "Meer Kennis met Minder Dieren" (progetto numero 114022501) dell'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario e della sovvenzione del consorzio CVON della Dutch Heart Foundation Ricollegare.

1. Preparazione del dispositivo
<ol><li>Trasferire la piastra microfluidica 384-well in un cappuccio sterile a flusso laminare.</li>
	<li>Togliere il coperchio e aggiungere 50 l of water o phosphate-buffered salina (PBS) a ciascuno dei 40 pozzi di osservazione(Figura 1b, po 'B2) utilizzando una pipetta multicanale o ripetuta. NOT:</</c1> Il protocollo può essere messo in pausa qui. Lasciare la piastra con il coperchio nell'armadietto della coltura sterile a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. Preparare Gel e Rivestimento
<ol><li>Preparare una soluzione di rivestimento per fibronectina (FN) da 2,5 mL di 10 g/mL. Diluire 25 - L di 1 mg/mL di cartoncino in 2,5 mL di PBS di Dulbecco (dPBS, calcio e magnesio libero). Collocare la soluzione nel bagno d'acqua a 37 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	<li>Preparare 100 l di collagene-1 soluzione. Aggiungete 10 di HEPES (1 M) a 10 di NaHCO3 (37 g/L) e mescolate con il pipettaggio. Mettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 80 l of collagene-1 (5 mg/mL) per produrre una concentrazione di collagene-1 neutralizzato di 4 mg/mL. Utilizzare una pipetta per mescolare con attenzione ed evitare la formazione di bolle.</li>
	<li>Aggiungete 1,5 l di collagene-1 (4 mg/mL) all'insediazione gel di ogni unità microfluidica(Figura 1b, po' B1). Assicurarsi che la goccia di gel sia posta al centro di ogni pozzo in modo che il gel entri nel canale (vedere Figura 2a). NOT:</</c3> Le guide di fase impediscono il riempimento dei canali adiacenti e consentono la codifica in gel. Il corretto carico del gel può essere confermato al microscopio di un campo luminoso osservando la formazione del menisco attraverso la "finestra di osservazione" (beh B2) o capovolgendo la piastra a testa in giù. Se il gel non ha riempito completamente il canale, è possibile aggiungere una goccia aggiuntiva di 1 oL.</li>
	<li>Collocare la piastra microfluidica in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2)per 10 min per polimerizzare il collagene-1. NOT:</</c5> La tempistica della polimerizzazione è cruciale; a causa dei bassi volumi utilizzati in microfluidica, l'evaporazione può già essere osservata dopo 15 min di incubazione, che si traduce in collasso o restringimento del gel.</li>
	<li>Estrarre la piastra dall'incubatrice e trasferirla in un cappuccio sterile a flusso laminare.</li>
	<li>Aggiungete 50 l l di 10 g/mL al pozzo di uscita del canale di perfusione superiore di ogni unità microfluidica (Figura 1b, beh A3). Premere la punta della pipetta contro il lato del pozzo per il corretto riempimento del pozzo senza intrappolare le bolle d'aria (vedere La figura 2b). Il canale dovrebbe riempirsi e il liquido dovrebbe bloccare sulla presa (ben C1) senza riempire bene l'uscita.</li>
	<li>Collocare la piastra nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2) per almeno 2 giorni. NOT:</</c9> Il protocollo può essere messo in pausa qui, come il gel di collagene-1 insieme con la miscela di rivestimento è stabile per almeno 5 giorni in incubatrice. Se la miscela di rivestimento viene aggiornata, potrebbero essere possibili periodi più lunghi, ma questo non è stato testato. Fondamentale è il livello di rivestimento FN, in quanto impedisce la disidratazione del gel collagene-1.</li>
</ol>3. Semina cellulare / Microvessel Culture
<ol><li>Aggiungere 5 mL di siero di vitello fetale e 2,5 mL di penna/streptop a 500 mL di mezzo di coltura delle cellule endoteliali basali e filtrare sterilizzare utilizzando un filtro superiore di bottiglia con dimensione dei pori di 0,22 m. Questo mezzo è ora indicato come mezzo basale.</li>
	<li>Preparare il mezzo di crescita vascolare: Aggiungere 3 l-l di 50 g/mL del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e di 2 -g/ml di fattori di crescita del fibroblasto di base (bFGF) a 5 mL di mezzo basale.</li>
	<li>Scongelare rapidamente gli iPSC-EC congelati (<1 min) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e trasferirli in un tubo da 15 mL e diluire in 10 mL di mezzo basale.</li>
	<li>Conta le celle. NOT:</</c0> Una singola fiala contiene 1 milione di cellule in 0,5 mL con >90% di vitalità.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 100 x g per 5 min. Aspirate supernatant senza disturbare il pellet cellulare e respendere in mezzo basale per produrre una concentrazione di 2 x 107 cellule / mL.</li>
	<li>Trasferire la piastra microfluidica 384 po' dall'incubatrice a una sterile cappa a flusso laminare.</li>
	<li>Aspirare FN-coating soluzione dall'inserito perfusione (ben A1). Aggiungete 25 l di mezzo basale nei pozze di montaggio (bene A1).</li>
	<li>Aggiungete una goccia di sospensione cellulare di 1 ll a ogni insedio superiore perfusione(Figura 1b, ben A1). La goccia dovrebbe appiattirsi in pochi secondi (vedere la figura 3a,b per un'illustrazione di questo metodo di pompaggio passivo). NOTA: Controllare al microscopio se la semina è omogenea. In caso contrario, aggiungere un altro 1 - L nella presa e attendere che la goccia si appiattisca.</li>
	<li>Incubare il pozzo microfluidico per 1 h a 37 , 5% CO2. Dopo questo, le cellule avrebbero dovuto aderire. In caso contrario, attendere altri 30 min.</li>
	<li>Rimuovere il supporto basale dai pozzi di uscita perfusione superiore (Figura 1b, ben A3). Aggiungere il mezzo caldo di coltura del vaso nell'imletenza e nell'uscita di perfusione superiore (Figura 1b, pozzi A1 e A3). Posizionare la piastra sulla piattaforma del rocker (impostata su un angolo di 7 gradi, intervallo a dondolo di 8 min) nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).</li>
	<li>Immagine della piastra utilizzando un microscopio a campo luminoso con fase automatizzata al giorno 1 e 2 post-seeding per confermare la vitalità cellulare. Dopo 2 giorni, un mostrato confluente dovrebbe essersi formato contro l'impalcatura di collagene-1. NOT:</</c9> Se i canali non sembrano essere ugualmente confluenti, i micronavi possono essere coltivati per ulteriori 24 ore.</li>
</ol>4. Studio Germoglio angiogenico compresa la formazione delle cellule di punta e di stalk
<ol><li>Preparare 4,5 mL di mezzo di germogliazione angiogenica completando il mezzo basale con 4,5 litri di VEGF (50 g/mL di stock), 4,5 l di phorbol 12-myristate-13-aceto (PMA) (2 g/mL di stock) e 2,25 - L di sphingosina-1-fosfato (S1P) (1 m).</li>
	<li>Preparare 8,5 mL di mezzo di crescita della nave (mezzo basale integrato con 30 ng/mL VEGF e 20 ng/mL bFGF).</li>
	<li>Mezzo aspirato dai pozzi e aggiungere 50 l di mezzo di coltura di vasi freschi nella parte superiore di perfusione inserimento e pozzi di uscita e gel inserito e outlet pozzetto(Figura 1b, pozzi A1, A3, B1 e B3).</li>
	<li>Aggiungete 50 l di miscela di germogli angiogenici a ciascuno dei pozzetti e pozzi di uscita del canale perfusione inferiore (Figura 1b, pozzi C1 e C3).</li>
	<li>Collocare il dispositivo nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2)sulla piattaforma rocker per formare un gradiente di fattori di crescita angiogenici.</li>
	<li>Immagine 1 giorno e 2 giorni dopo l'aggiunta dei fattori di crescita angiogenici utilizzando un microscopio a campo luminoso con stadio automatizzato. NOT:</</c3> Continuare a coltivare i micronavi per studiare l'anastomosi (andare alla sezione 5) o fissare e macchiare i microvasi per quantificare la lunghezza e la morfologia del giorno 2 e del giorno 6 (andare alla sezione 6).</li>
</ol>5. Studio Anastomosis e Stabilizzazione germoglio
<ol><li>Immagine con un microscopio a campo luminoso con fase automatizzata.</li>
	<li>Aggiungete 1 -L di albumina fluorescente (0,5 mg/mL) all'inserito di perfusione superiore(Figura 1b, beh A1) e mescolate utilizzando una pipetta da 50 luna.</li>
	<li>Trasferire la piastra in un microscopio fluorescente con stacco automatizzato e incubatrice posta a 37 gradi centigradi. Impostare il microscopio a impostazioni di esposizione obiettive e corrette 10x (ad esempio, tetramethylrhodamine [TRITC]-canale, 20 ms di esposizione). Acquisire immagini time-lapse ogni minuto per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere la piastra dal microscopio e trasferire la piastra in un cappuccio sterile a flusso laminare.</li>
	<li>Rimuovere tutto il mezzo dai pozzetto e sostituire sia il mezzo di coltura del vaso che il mezzo di germoglio angiogenico nei pozzi corrispondenti (vedere i passaggi 4.3 e 4.4).</li>
	<li>Rimettere il dispositivo nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2)per continuare la germogliazione angiogenica.</li>
	<li>Ripetete i passaggi da 5,1 a 5,6 per studiare la permeabilità al giorno 6.</li>
</ol>6. Fissaggio, colorazione e imaging
<ol><li>Aspira tutti i media culturali da tutti i pozzi. NOT:</</c0> Il mezzo residuo o i liquidi nei canali microfluidici non influenzano la fissazione a causa del suo basso volume di 1/2 L.</li>
	<li>Aggiungere 25 - L del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS a tutta l'imbottitura di perfusione (Figura 1b, A1 e C1) e pozzi di uscita (Figura 1b, A3 e C3). Incubare per 10 min a RT. Posizionare il dispositivo sotto un leggero angolo (5 ) per indurre il flusso (ad esempio, posizionando un lato della piastra su un coperchio).</li>
	<li>Aspirare PFA dai pozzi. Lavare due volte tutte le prese e le prese di perfusione con 50-L della soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS). Aspirare HBSS da pozzi.</li>
	<li>Permeabilizzare a RT per 10 min aggiungendo 50 luna di 0,2% di surfactant nonionico a tutte le prese e le prese di perfusione.</li>
	<li>Aspirare il surfactant nonionico da pozzi. Lavare i canali di perfusione due volte aggiungendo 50 L di HBSS a tutte le luci di perfusione e ai pozzi di uscita. Aspirare HBSS da pozzi.</li>
	<li>Macchiare i nuclei utilizzando Hoechst (1:2,000) e F-actin utilizzando phalloidin (1:200) in HBSS. Preparare 2,2 mL per 40 unità, e aggiungere 25 L ad ogni inserimento e presa bene. Posizionare la piastra sotto una leggera angolazione e incubare rt per almeno 30 min.</li>
	<li>Lavare due volte con 50 - L di HBSS in tutte le prese di perfusione e prese.</li>
	<li>Immagine diretta utilizzando un microscopio fluorescente con stadio automatizzato o conservare la piastra protetta dalla luce a 4 gradi centigradi per un uso successivo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes.">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).</li><li>Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+model+to+reconstitute+sprouting+lymphangiogenesis+in+vitro.">Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 78, 115-128 (2016).</li><li>Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+microfluidic+angiogenesis+screen+for+studying+anti-angiogenic+therapeutic+drugs.">A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs.</a> Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+Biomimetic+Pericyte-Covered+3D+Microvascular+Network.">Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network.</a> PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).</li><li>Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+microenvironment+systems+for+modeling+human+vasculature.">Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature.</a> Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).</li><li>Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+end-user+perspective+on+Organ-on-a-Chip:+Assays+and+usability+aspects.">An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).</li><li>Pagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+design+and+fabrication+of+microfluidic+devices+for+cell+cultures:+An+effective+approach+to+control+cell+microenvironment+in+three+dimensions.">Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions.</a> Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).</li><li>Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineers+are+from+PDMS-land,+Biologists+are+from+Polystyrenia.">Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia.</a> Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8, 14361 (2017).</li><li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research.">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li><li>Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Tissue+and+Disease+Modeling+using+hiPSCs.">Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).</li></ol>

P. Vulto e T. Hankemeier sono azionisti di Mimetas BV. V. Borgdorff e A. Reijerkerk sono dipendenti di Ncardia BV. V. van Duinen, W. Stam, V. V. Orlova e A.J. van

Questo metodo descrive la coltura di 40 microvessels endoteliali perfutilizzabili all'interno di una piattaforma di coltura cellulare microfluidica robusta e scalabile. Rispetto ai tradizionali metodi di coltura cellulare 2D e 3D, questo metodo mostra come un microambiente cellulare fisiologico rilevante che include gradienti e perfusione continua può essere combinato con la coltura cellulare 3D con una velocità effettiva adeguata per lo screening Scopi.
Uno dei principali vantaggi rispetto ai saggi microfluidici comparabili è che questo metodo non si basa sulle pompe per la perfusione, ma utilizza una piattaforma rocker per indurre simultaneamente una perfusione continua in tutte le unità microfluidiche. Questo assicura che il saggio sia robusto e scalabile: le piastre possono essere impilate su una piattaforma rocker. È importante sottolineare che tutte le unità microfluidiche rimangono indirizzabili individualmente, il che consente di implementare questo metodo all'interno dello screening farmacologico, compresa la generazione di una curva dose-risposta. Inoltre, senza una pompa, l'imaging e la sostituzione media sono molto più semplici con meno rischio di contaminazione (incrociata).
Un altro vantaggio di questo metodo è l'uso di una piattaforma standardizzata pre-fabbricata, mentre piattaforme di coltura cellulare microfluidica comparabili devono essere fabbricate dagli utenti finali. Questa disponibilità facilita l'adozione di questo saggio tra gli altri gruppi di ricerca accademica e farmaceutica, portando alla standardizzazione. Inoltre, a differenza dei prototipi microfluidici, l'interfaccia a piastre 384 assicura la compatibilità con le attuali apparecchiature di laboratorio (ad esempio, aspiratori, gestori di lastre e pipette multicanale), facilitando l'integrazione all'interno dell'attuale infrastruttura di screening .
Ci sono diversi passaggi critici nell'esecuzione di questo saggio. Il gel di collagene 1 dovrebbe riempire completamente il canale gel. Durante il caricamento del gel, questo riempimento può essere osservato ispezionando i canali microfluidici attraverso la finestra di osservazione (Figura 2a) o capovolgendo la piastra a testa in giù (come mostrato nella Figura 1a). Durante il riempimento, il gel di collagene deve rimanere nel canale centrale, senza scorrere nei canali di perfusione adiacenti. Abbiamo notato che la qualità del gel di collagene-1 è fondamentale per una corretta performance di analisi. I lotti di collagene-1 con viscosità troppo elevata porteranno a un riempimento incompleto del canale di gel. Dopo 10 min di polimerizzazione a 37 gradi centigradi, il gel deve essere omogeneo e limpido. Se il collagene-1 non viene conservato correttamente (ad esempio, a causa delle temperature fluttuanti in frigorifero), il collagene polimerizzerà all'interno dei canali con una formazione di fibre chiaramente visibili. Ciò può comportare l'invasione dei EC nel gel senza l'aggiunta di fattori angiogenici, ma senza un adeguato sviluppo del lume.
Quando le cellule sono semiate, la soluzione di rivestimento della fibronectina viene rimossa dai pozzi, lasciando solo i canali microfluidici pieni di soluzione di rivestimento. L'aspirazione della soluzione di rivestimento da canali microfluidici potrebbe causare interruzioni del gel o aspirazione al gel. La sospensione cellulare deve sostituire / sostituire questa soluzione di rivestimento. Questo funziona meglio quando la sospensione cellulare viene semidata utilizzando il metodo di pompaggio passivo, in quanto direttamente il pipetting della sospensione cellulare nei canali mostrano densità di semina meno riproducibili.
Poiché i microvasi formano un monoteman stabile contro il gel, queste piccole differenze si traducono solo in tempi diversi necessari per raggiungere la confluenza. Così, il punto di inizio del saggio è determinato dalla confluenza piuttosto che dal tempo della cultura. Se necessario, il tempo di coltura può essere esteso fino a quando non si è formato un chiaro monostrato contro il gel.
All'interno dei pozzi, bolle d'aria possono essere intrappolati da riempimento errato dei pozzi (vedi figura 2b). Queste bolle d'aria limiteranno il flusso di mezzo, anche quando il dispositivo è posizionato su una piattaforma rocker, e si tradurrà in collasso del microrecipient e formazione di gradiente improprio. Premendo la punta della pipetta contro la parete laterale dei pozzeri aumenterà il successo di riempire completamente il pozzo. Se una bolla d'aria è intrappolata all'interno dei pozzi, può essere rimossa inserendo delicatamente una punta sterile pipetta nel fondo di vetro. Le bolle d'aria possono verificarsi anche all'interno dei canali microfluidici. Quando il mezzo è stato rimosso dai pozzetti, l'evaporazione del mezzo è evidente dai canali microfluidici dopo 30 min (a causa dei volumi di microlilitri all'interno dei canali). Pertanto, le modifiche medie vengono preferibilmente eseguite il più velocemente possibile. Quando il mezzo viene aggiunto in un canale con mezzo evaporato, le bolle d'aria saranno intrappolate all'interno dei canali microfluidici. Queste bolle d'aria all'interno dei canali microfluidici possono essere rimosse manualmente posizionando una pipetta P20 direttamente sull'inserile o sulla presa e forzando il mezzo attraverso la microfluidica dal pozzo opposto. La rimozione di successo delle bolle d'aria si traduce in una piccola ma evidente diminuzione del volume nell'altro pozzo. Nella tabella 1 sono elencati gli errori comuni e le modalità di risoluzione dei problemi.
La mancanza di una pompa è una limitazione quando è necessaria l'imaging continuo, in quanto la piattaforma rocker limita l'utente all'immagine a intervalli di tempo sequenziali. Inoltre, la perfusione di mezzo in questa piattaforma consiste in un flusso bidirezionale con bassi livelli di sollecitazione di taglio, mentre la vascolatura in vivo è esposta a un flusso unidirezionale con livelli più elevati di stress da taglio. Anche se non osserviamo gli effetti negativi del flusso bidirezionale per quanto riguarda la germogliazione angiogenica, il flusso è un importante stimolo biomeccanico e preferibilmente controllato. Tuttavia, mentre ci sono configurazioni di pompa disponibili in commercio, interfacciandosi con la piastra 384-well rimane impegnativo e configurazioni di pompa grave ostacolano la scalabilità di questo saggio.
La possibilità di utilizzare iPSC-EC per studiare la germogliazione angiogenica apre nuove opportunità nella modellazione delle malattie e nella ricerca sui farmaci. A differenza degli EC primari, queste cellule possono essere generate in quantità quasi illimitate con un genotipo stabile e utilizzando tecniche di editing del genoma, possono essere generate cellule che includono knockout genici e knock-in. Tuttavia, poiché i protocolli per differenziare le EC da iPSC sono relativamente nuovi, non è ancora chiaro cosa porti agli iPSC-EC che riflettono meglio le EC primarie e quali sottotipi di EC sono o possono essere generati. Inoltre, ci sono ancora domande riguardanti la loro rilevanza. Ad esempio, gli iPSC-EC presentano ancora la plasticità tipica delle cellule endoteliali? E in che misura le cellule derivate da iPSC rispondono e interagiscono con il loro microambiente cellulare? La piattaforma standardizzata qui presentata potrebbe essere utilizzata per rispondere ad alcune di queste domande al fine di convalidare ulteriormente l'utilizzo di EC derivati da iPSC in vitro.
La direzione futura più diretta per questo saggio sarà l'integrazione di altri tipi di cellule che svolgono un ruolo importante durante l'angiogenesi, come periciti e macrofagi. Questo faciliterà la capacità di studiare il ruolo dei macrofagi durante l'anastomosi tra germogli o l'aderenza dei periciti dopo la formazione capillare. Inoltre, è possibile coltura vari altri tipi di cellule all'interno o contro una matrice extracellulare (ad esempio, abbiamo mostrato la coltura di neuroni e varie strutture epiteliali come tubuli prossimali e intestini piccoli), che possono essere combinati con il vascolare letti generati con questo metodo. Infine, sarà interessante studiare la germogliazione angiogenica negli idrogel sintetici, poiché la loro composizione definita aumenta ulteriormente la standardizzazione del saggio e consente di accordarsi di rigidità e motivi di legame che influenzano le interazioni cella-matrice.
In conclusione, questo metodo mostra la fattibilità delle EC derivate da iPSC in un saggio angiogenico 3D standardizzato e scalabile che combina condizioni di coltura fisiologiche rilevanti in una piattaforma che ha la robustezza e la scalabilità necessarie da integrare all'interno l'infrastruttura di screening dei farmaci.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 &#181;L of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 &#181;L of basal medium in the outlet well (well A3).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

I modelli in vitro svolgono un ruolo fondamentale nella scoperta e nella convalida di nuovi bersagli farmacologici di malattie vascolari. Tuttavia, gli attuali modelli di screening in vitro che hanno una produttività sufficiente hanno solo una rilevanza fisiologica limitata1, il che ostacola la traduzione dei risultati dall'invitro all'in vivo. Così, per far progredire la ricerca pre-clinica sui farmaci vascolari, sono necessari modelli di vascolarizzazione migliorati che combinano lo screening ad alta produttività con un micro-ambiente cellulare 3D fisiologicamente rilevante.
Nell'ultimo decennio sono stati compiuti progressi significativi per aumentare la rilevanza fisiologica dei modelli in vitro di vascolatura. Invece di coltivare cellule endoteliali su superfici piatte come la plastica a coltura dei tessuti, le cellule endoteliali possono essere incorporate in scaffold 3D, come fibrina e gel di collagene2. All'interno di queste matrici, le cellule endoteliali mostrano un fenotipo più fisiologicamente rilevante associato alla degradazione della matrice e alla formazione del lume. Tuttavia, questi modelli dimostrano solo un sottoinsieme dei molti processi che si verificano durante la germogliazione angiogenica, poiché mancano ancora segnali importanti del microambiente cellulare.
Le piattaforme di coltura cellulare microfluidica sono particolarmente adatte ad aumentare ulteriormente la rilevanza fisiologica dei modelli in vitro di vascolatura. Ad esempio, le cellule endoteliali possono essere esposte allo stress da taglio, che è un importante stimolo biomeccanico per la vascolatura. Inoltre, la possibilità di controllare spazialmente i fluidi all'interno della microfluidica permette la formazione di gradienti biomolecolari3,4,5,6. Tali gradienti svolgono un ruolo importante in vivo durante la formazione e il patterning durante l'angiogenesi. Tuttavia, mentre le piattaforme di coltura cellulare microfluidica hanno dimostrato una rilevanza fisiologica senza precedenti rispetto ai tradizionali metodi di coltura delle cellule 2D e 3D, spesso mancano della produttività, della scalabilità e della standardizzazione necessarie per lo screening farmacologico 7. Inoltre, molte di queste piattaforme non sono disponibili in commercio e richiedono agli utenti finali di microfabbricare i loro dispositivi prima dell'uso8. Ciò richiede non solo l'apparato di produzione e le conoscenze tecniche, ma limita anche il livello di controllo della qualità e influisce negativamente sulla riproducibilità9.
Ad oggi, le cellule endoteliali primarie rimangono la fonte cellulare più utilizzata per modellare l'angiogenesi in vitro10. Tuttavia, le cellule umane primarie hanno una serie di limitazioni che ostacolano la loro applicazione di routine negli approcci di screening. In primo luogo, esiste una possibilità limitata di aumentare ed espandere le colture derivate da cellule primarie. Pertanto, per l'esperimento su larga scala, devono essere utilizzati lotti di diversi donatori, il che si traducono in differenze genomiche e variazioni batch-to-batch. In secondo luogo, dopo alcuni passaggi, le cellule endoteliali primarie generalmente perdono proprietà rilevanti quando coltivate in vitro11,12.
Le cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) sono un'alternativa promettente: assomigliano alle cellule primarie, ma con un genotipo più stabile che è anche suscettibile all'editing preciso del genoma. Inoltre, gli iPSC sono in grado di rinnovarsi e quindi possono essere ampliati in quantità quasi illimitate, che rendono le cellule derivate da iPSC un'alternativa interessante alle cellule primarie per l'utilizzo all'interno di modelli di screening in vitro13.
Qui, descriviamo un metodo per colture di cellule endoteliali come microvessels 3D perfutilizzabili in una piattaforma standardizzata di coltura microfluidica ad alto contenuto di velocità. La perfusione viene applicata posizionando il dispositivo su una piattaforma rocker, che garantisce un funzionamento robusto e aumenta la scalabilità del saggio. Poiché i micronavi sono continuamente perfusi ed esposti a un gradiente di fattori angiogenici, la germogliazione angiogenica viene studiata in un microambiente cellulare più fisiologico rilevante. Mentre il protocollo è compatibile con molte fonti diverse di cellule endoteliali (primarie)14,15, ci siamo concentrati sull'utilizzo di EC derivati da iPSC umani al fine di aumentare la standardizzazione di questo saggio e per facilitare la sua integrazione nell'ambito della ricerca sui farmaci vascolari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-10 &#956;L Electronic repeater pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z654566-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-lane OrganoPlate</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td>4003-400B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal culture medium</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-1</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Biopur 2.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Repeater M4 pieptte</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4759-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3569</td>
			<td>10 mg/mL solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-derived endothelial cells</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>37 g/L in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td></td>
			<td>Rocker platform used to provide flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Focus-Biomolecules</td>
			<td>10-2165</td>
			<td>2 &#956;g/mL in PBS containing 0.1% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1P</td>
			<td>Ecehelon Biosciences</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>1 mM in methanol containing 1% acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32-10</td>
			<td>50 &#956;g/mL in water containing 0.1% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro

La ricerca pre-clinica sui farmaci delle malattie vascolari richiede modelli in vitro di vascolatura che siano modificabili per lo screening ad alto consumo. Tuttavia, gli attuali modelli di screening in vitro che hanno una produttività sufficiente hanno solo una rilevanza fisiologica limitata, il che ostacola la traduzione dei risultati dall'invitro all'in vivo. D'altra parte, le piattaforme di coltura cellulare microfluidica hanno dimostrato una rilevanza fisiologica senza precedenti in vitro, ma spesso mancano della produttività, della scalabilità e della standardizzazione richieste. Dimostriamo una solida piattaforma per studiare l'angiogenesi delle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC-EC) in un microambiente cellulare fisiologico rilevante, tra cui perfusione e gradienti. Gli iPSC-EC sono coltivati come 40 microvessels 3D perfusi contro uno scaffold di collagene-1 modellato. Dopo l'applicazione di un gradiente di fattori angiogenici, è possibile studiare importanti segni di angiogenesi, tra cui la differenziazione in cellule di punta e gambo e la formazione di lume perfutilizzabile. La perfusione con coloranti traccianti fluorescenti consente lo studio della permeabilità durante e dopo l'anastomosi dei germogli angiogenici. In conclusione, questo metodo mostra la fattibilità delle EC derivate da iPSC in un saggio angiogenico 3D standardizzato e scalabile che combina condizioni di coltura fisiologiche rilevanti in una piattaforma che ha la robustezza e la scalabilità necessarie da integrare all'interno l'infrastruttura di screening dei farmaci.

La piattaforma di coltura cellulare 3D microfluidica è costituita da 40 unità microfluidiche perfuse (Figura 1a,b), che viene utilizzata per studiare la germogliazione angiogenica di microvessels perfusi contro un gel di collagene-1 modellato (Figura 1c). Queste micronavi sono continuamente perfuse ed esposte a un gradiente di fattori di crescita angiogenici (Figura 3a-d). I germogli angiogenici possono essere studiati 2 giorni dopo l'esposizione al gradiente o coltivati per più di 5 giorni dopo l'esposizione al gradiente per studiare anastomosi e stabilizzazione del germoglio (vedere timeline, Figura 1d).
La seeding degli iPSC-EC utilizzando il metodo di pompaggio passivo dovrebbe comportare densità di semità omogenee (Figura 4a,b). La coltura in continua perfusione ha portato a microvessels confluenti in 2 giorni, con le cellule che rivestono completamente la circonferenza del canale microfluidico e la formazione di un monostrato confluente contro il gel di collagene-1 modellato.
L'esposizione a un gradiente di fattori angiogenici ha portato alla germogliazione angiogenica direzionale dei microvasi all'interno del gel di collagene-1 modellato(Figura 5a-g). La formazione e l'invasione delle cellule di punta chiara nel gel di collagene-1 erano visibili 24 h dopo l'aggiunta del gradiente angiogenico, mentre le cellule di gambo, inclusa la formazione di lume, erano visibili dopo 48 h (Figura 5a).
Dopo la fissazione e la colorazione, la rete capillare può essere visualizzata utilizzando il phalloidin per macchiare F-actin e utilizzando Hoechst 33342 per macchiare il nucleo (Figura 5b,c). Questi germogli possono essere quantificati (ad esempio, forma e lunghezza14). Senza l'aggiunta di fattori di crescita, nessuna invasione nel gel di collagene-1 dovrebbe essere osservata (Figura 5d). L'imaging confocale è stato utilizzato per determinare il diametro del germoglio e per confermare la formazione del lume (Figura 5e-g).
I germogli continuano a crescere verso la direzione del gradiente e raggiungono il canale di perfusione opposto entro 3/4 giorni dopo l'aggiunta di fattori di crescita angiogenici. Ciò si traduce nel rimodellamento della rete vascolare, con una chiara riduzione del numero di germogli angiogenici (Figura 6a). La formazione di lumen è stata valutata mediante perfusione della rete vascolare con macromolecole fluorescenti (ad esempio, albumina o dextrans). Perfassociare i microvessels con 0,5 mg/mL etichettato albumina prima e dopo l'anastomosis ha rivelato una chiara differenza nella permeabilità del germoglio dopo 10 min (Figura 6b-e), che suggerisce che i capillari stabilizzano e maturano dopo l'anastomosi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig1.jpg"> Figura 1: Protocollo di coltura cellulare microfluidica per micronavi derivate da iPSC. (a) Viene visualizzato il fondo del dispositivo di coltura cellulare microfluidica che mostra le 40 unità microfluidiche integrate sotto la piastra 384. La vista più grande mostra una delle 40 unità microfluidiche. (b) Ogni unità microfluidica è posizionata sotto 9 pozzi con 3 pozzi di insegliazione e 3 pozzi di uscita. I canali microfluidici sono separati da creste ('phaseguides'), che consentono la modellazione di idrogel nel canale centrale ('canale gel') mentre c'è ancora contatto con i canali adiacenti ('canali di perfusione'). (c) Metodo per la coltura di un microvaso perfuso all'interno del dispositivo microfluidico, che viene utilizzato per studiare il gradiente guidato angiogenico spuntando attraverso una matrice di collagene-1 modellato. (d) Cronologia per lo studio della germogliazione angiogenica e/o dell'anastomosi. Questa cifra è stata modificata da van Duinen etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig2.jpg"> Figura 2: Procedure di caricamento per gel e media. (a) Esempi di deposizione di gel corretta e errata. L'archiviazione corretta si traduce in un gel di collagene-1 modellato nel canale centrale, che viene successivamente polimerizzato. (b) Esempi di riempimento corretto e non corretto dei pozzi. I pozzi vengono riempiti nell'ordine di 1/4 per evitare l'intrappolamento delle bolle d'aria all'interno dei canali microfluidici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig3.jpg"> Figura 3: Flusso a pressione idrostatica continua e stabilizzazione del gradiente. (a) Le differenze di pressione idrostatica tra i pozzi provocano livellamento passivo e flusso all'interno dei canali microfluidici. (b) Collocare il dispositivo su una piattaforma rocker impostata a 7 e 8 min ciclo si traduce in una perfusione continua e bidirezionale all'interno dei canali microfluidici. (c) I gradienti si formano introducendo due diverse concentrazioni all'interno dei pozzi, che vengono continuamente rinfrescate mediante livellamento passivo. (d) Visualizzazione gradiente con fluoresceinisociocianato (FITC)-dextran. Il flusso bidirezionale stabilizza il gradiente fino a 3 giorni. Barra della scala: 200 m. Questa cifra è stata modificata da van Duinen etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig4.jpg"> Figura 4: Metodo di pompaggio passivo per la semina cellulare. (a) Il pompaggio passivo è guidato da differenze di pressione causate da differenze di tensione superficiale. Ciò si traduce in un flusso dalla goccia (alta pressione interna) verso il serbatoio (bassa pressione interna). (b) Intervallo di tempo di una goccia (contorno grigio) che viene posizionata sopra l'ingresso (contorno bianco) del canale microfluidico (contorno blu). Subito dopo l'addizione (Figura 4b, i), la goccia sulla parte superiore dell'imlettinca si restringe (Figura 4b, ii: 1 s dopo l'aggiunta; iv: 2 s dopo l'aggiunta), che si traduce in un flusso verso l'uscita. Questo continua fino a quando il menisco gocciolina è appuntato dall'inserizione (Figura 4b, iv). Barra di scala - 400 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig5.jpg"> Figura 5: Robusto germoglio 3D di micronavi iPSC-EC. (a) Sprouting di iPSC-EC nel tempo. Le microvessels sono state coltivate per 48 h (a destra) e poi stimolate con un cocktail angiogenico contenente 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P e 2 pMA ng/mL. Le prime cellule di punta che invadono lo scaffold di collagene-1 (al centro) sono visibili 24 h dopo l'esposizione. I primi lumen sono visibili (frecce) 48 h dopo l'esposizione (a destra) mentre le celle di punta sono migrate ulteriormente nella direzione del gradiente. (b) Matrice di 15 microvessels che sono stati stimolati con VEGF, S1P e PMA per 2 giorni e macchiati per F-actin (giallo) e nuclei (blu). Barra di scala - 200 m. (c) Micronave stimolato (controllo positivo). (d) Micronave non stimolato (controllo negativo). (e) La proiezione massima di un singolo capillare all'interno del gel. (f) Uguale a (g) ma focalizzato sul centro. La linea punteggiata indica la posizione della vista ortogonale nel pannello g. Barre di scala (a-d: 200 m; e-g: 20 m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig6.jpg"> Figura 6: Visualizzazione della permeabilità del germoglio angiogenico prima e dopo l'anastomosi. (a) Anastomosi con trigger di canale basale e maturazione dei germogli angiogenici. Primo piano del letto capillare a 2, 4, 6 e 7 giorni dopo la stimolazione con fattori di crescita angiogenici. (b) Germogli angiogenici dopo 2 giorni dopo l'aggiunta di fattori di crescita angiogenici. I germogli angiogenici si formano all'interno del gel, ma non sono ancora collegati al canale di perfusione inferiore. (c) Perfusione del micronave con soluzione 0,5 mg/mL albumin-Alexa 555. Immagini fluorescenti ottenute a 0 e 10 min. (d,e) Come nei pannelli b e c, ma dopo 7 giorni di stimolazione. I germogli sono collegati all'altro lato e formano un microrecipient confluente nel canale di perfusione basale. Barre di scala : 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Causa</td>
			<td>Soluzione</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Il collagene 1 non entra o riempie completamente il canale</td>
			<td>La goccia di collagene-1 non è posizionata sopra l'inseridio</td>
			<td>Posizionare con attenzione la goccia sulla parte superiore dell'ingresso dal canale gel</td>
		</tr>
<tr>
<td>Il volume di collagene 1 è troppo basso</td>
			<td>Utilizzare 1,5 l del gel per riempire completamente il canale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Il collagene 1 è troppo viscoso</td>
			<td>Utilizzare un altro lotto di collagene-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Il collagene-1 fluisce nei canali di perfusione</td>
			<td>Il collagene-1 viene convogliato direttamente nell'inserimento del canale gel</td>
			<td>Posizionare con attenzione la goccia sulla parte superiore dell'ingresso dal canale gel</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Il collagene-1 non è la formazione chiara/fibra</td>
			<td>Il collagene 1 non viene conservato correttamente</td>
			<td>Conservare il collagene-1 a 4 gradi centigradi, non congelare</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 e HEPES non si mescolano bene prima di aggiungere collagene-1</td>
			<td>Mescolare con attenzione il NaHCO3 e HEPES pipettando prima di aggiungere il collagene-1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Goccia non si riduce utilizzando il metodo di pompaggio passivo</td>
			<td>Gocciolina aderisce al lato del pozzo</td>
			<td>Gocciolina aspirata e aggiungere una nuova goccia sulla parte superiore dell'inseridio</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Assicurarsi che il pozzo di uscita sia riempito con almeno 20</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Non si osserva alcun germoglio</td>
			<td>I fattori di crescita non vengono aggiunti o gli aliquot non vengono memorizzati correttamente</td>
			<td>Preparare un nuovo mezzo angiogenico</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blocchi d'aria perfusione / formazione di gradiente</td>
			<td>Rimuovere le bolle d'aria utilizzando una pipetta P20 o P200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Differenze di volume tra i pozzi</td>
			<td>I volumi in tutti i pozzi devono essere uguali per formare un gradiente lineare</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Celle non vitali</td>
			<td>Piastra non posizionata sulla piattaforma rocker/piattaforma rocker spenta</td>
			<td>Assicurarsi che la piattaforma rocker sia attiva e che abbia il giusto tempo/angolo di ciclo (8 min/7o)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nessuna perfusione possibile a causa della presenza di bolle d'aria</td>
			<td>Rimuovere le bolle d'aria utilizzando una pipetta P20 o P200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Non si formano lumamen, le cellule migrano come singole cellule</td>
			<td>La miscela di germogli angiogenica è stata aggiunta prima della formazione di un monostrato</td>
			<td>Attendere altri 24 h prima di aggiungere i fattori di crescita angiogenici</td>
		</tr>
<tr>
<td>Principali variazioni nella densità di germogli</td>
			<td>Differenze nella densità delle cellule dopo la semina</td>
			<td>Controllare se la densità cellulare è omogenea e comparabile tra unità microfluidiche. Se necessario, aggiungere un'altra goccia di sospensione cellulare</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Risoluzione degli errori comuni.

Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Questo metodo descrive la coltura delle cellule endoteliali derivate da iPSC come 40 micronavi 3D perfuse in una piattaforma microfluidica standardizzata. Questa piattaforma consente lo studio della germogliazione angiogenica basata su gradienti in 3D, tra cui l'anastomosis e la stabilizzazione dei germogli angiogenici in modo scalabile e ad alta produttività.

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Questo saggio in vitro dimostra la germogliazione angiogenica in una piattaforma ad alta produttività e scalabile. Questo potrebbe essere usato per trovare nuovi bersagli nell'angiogenesi. Questo test di angiogenesi combina complessi micro ambienti cellulari che includono gradienti e perfusione con una piattaforma compatibile con lo screening ad alta produttività.L'angiogenesi gioca un ruolo importante sia nella salute che nelle malattie. Comprendere i meccanismi che si verificano durante l'angiogenesi potrebbe aiutarci a capire come crescono i tumori e come riparano i tessuti. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sui meccanismi durante le malattie cardiovascolari e la rigenerazione dei tessuti.In entrambi, l'angiogenesi gioca un ruolo importante. Per l'uso per la prima volta di questa piattaforma microfluidico, è necessario essere consapevoli della legge dei volumi e di come pipettare. È possibile confermare i passaggi guardando al microscopio o capovolgendo la piastra.Alcuni passaggi sono difficili da capire quando si legge solo il metodo, ad esempio quanto sono piccoli i canali microfluidici o come tenere la piastra. A dimostrare queste procedure sarà Wendy Stam, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, trasferire la piastra microfludica da 384 po 'su una cappa sterile a flusso laminare.Rimuovere il coperchio e aggiungere 50 microlitri di acqua o soluzione salina tamponata con fosfato a ciascuno dei 40 pozzi di osservazione utilizzando una pipetta multicanale. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di quattro milligrammi per collagene millilitro una soluzione all'ingresso gel di ogni unità microfluidico. Assicurarsi che la goccia di gel sia posizionata al centro di ogni pozzo affinché il gel entri nel canale.Dopo aver riempito cinque unità microfluidiche, capovolgere la piastra per ispezionare visivamente il corretto riempimento dei canali del gel. Posizionare la piastra microfludica in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10 minuti per polimerizzare quella di collagene. Quindi estraere il piatto dall'incubatrice e trasferirlo in una cappa di flusso laminare sterile.Aggiungere 50 microlitri di 10 microgrammi per soluzione di codifica della fibronecina millilitro al pozzo di uscita del canale di perfusione superiore di ogni unità microfluidica. Premere la punta della pipetta contro il lato del pozzo per il corretto riempimento del pozzo senza intrappolare bolle d'aria. Il canale si riempie e le padelle liquide sull'uscita senza riempire bene l'uscita.Quindi posizionare la piastra nell'incubatrice per almeno due giorni. Ora, scongelare rapidamente gli IPSC-EC congelati per meno di un minuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere lentamente 10 millilitri di mezzo basale per diluire.Disegnare 10 microlitri della soluzione e contare le celle su un contatore di celle. Centrifugare il tubo a 100 volte g per cinque minuti. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risosopend in mezzo basale per produrre una concentrazione di due volte 10 alla settima cella per millilitro.Successivamente, trasferire la piastra microfluidico da 384 porri dall'incubatrice a una cappa di flusso laminare sterile. Aspirare la soluzione di codifica della fibronectina dall'uscita di perfusione e aggiungere 25 microlitri di mezzo basale nei pozzi di uscita. Aggiungere una goccia di sospensione cellulare a un microlitro ad ogni pozzetto di ingresso perfusione superiore.La goccia si appiattisce in pochi secondi. Verificare al microscopio se la semina è omogenea all'interno di un singolo canale e tra i canali. Incubare la piastra del pozzo microfluidico per una o 1,5 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Successivamente, controlla le cellule per confermare che hanno aderito. Rimuovere il mezzo basale dai pozzi di uscita perfusione superiore. Aggiungere il mezzo di coltura del vaso caldo nell'ingresso e nell'uscita della perfusione superiore.Posizionare la piastra su una piattaforma rocker impostata su un angolo di sette gradi e otto minuti di intervallo di dondolo nell'incubatore. Al primo giorno e due post-seeding, immagini la piastra utilizzando un microscopio Brightfield con stadio automatizzato per confermare la vitalità cellulare. Dopo due giorni, un monostrato confluente si è formato contro l'impalcatura di collagene.In primo luogo, preparare 4,5 millilitri di mezzo di germinazione angiogenica integrando 4,5 millilitri di mezzo basale con 4,5 microlitri di calcio VEGF, 4,5 microlitri di stock di PMA e 2,25 microlitri di stock S1P. Preparare 8,5 millilitri di mezzo di crescita dei vasi integrando il mezzo basale con 5,1 microlitri di VEGF e 3,4 microlitri di BFGF. Aspirare il mezzo dai pozzi e aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura di recipienti freschi nei pozzi di ingresso e uscita perfusione superiore e nei pozzi di ingresso e uscita in gel.Quindi aggiungere 50 microlitri di miscela di germogli angiogenici a ciascuno dei pozzi di ingresso e uscita del canale di perfusione inferiore. Riposizionare la piastra nell'incubatore sulla piattaforma del rocker per formare un gradiente di fattori di crescita angiogenici. Un giorno e due giorni dopo l'aggiunta dei fattori di crescita angiogenici, utilizzare un microscopio Brightfield per immagini i pozzi su uno stadio automatizzato.Per studiare l'anastomosi e la stabilizzazione del germoglio, aggiungere un microlitro di 0,5 milligrammi per millilitro etichettato fluorescentmente albumina all'ingresso perfusione superiore. Quindi mescolare la soluzione con una pipetta da 50 microliter. Trasferire la piastra su un microscopio fluorescente con stadio automatizzato e incubatore impostati a 37 gradi Celsius.Impostare il microscopio all'obiettivo 10X e correggere le impostazioni di esposizione. Acquisire immagini timelapse ogni minuto per 10 minuti. Rimuovere la piastra dal microscopio e trasferire la piastra in un cappuccio di flusso laminare sterile.Rimuovere tutto il mezzo dai pozzi e sostituire sia il mezzo di coltura del recipiente che il mezzo di germogliazione angiogenico nei pozzi corrispondenti. Riposizionare la piastra microfluidica nell'incubatrice per continuare la germinazione angiogenica. Il sesto giorno, ripeti l'imaging per studiare la permeabilità.Per fissare la coltura cellulare, aspirare tutti i mezzi di coltura dai pozzi. Aggiungere 25 microlitri del 4%PFA in PBS a tutti i pozzi di ingresso e uscita perfusione. Quindi posizionare un lato della piastra microfluidica sul coperchio con un leggero angolo di cinque gradi per indurre il flusso.Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, aspira la PFA dai pozzi. Lavare tutte le insenature e uscite perfusione due volte con 50 microlitri di HBSS.Quindi aspirare l'HBSS dai pozzi. La paraformaldeide è una sostanza chimica pericolosa che deve essere maneggiata indossando guanti e aperta solo in un cappuccio dei fumi. Aggiungere quindi 50 microlitri dello 0,2% di tensioattivi non ionici a tutte le insenature e uscite perfusione per permeabilizzare a temperatura ambiente per 10 minuti e posizionare la piastra microfluidica sul coperchio con un leggero angolo di cinque gradi.Aspirare il tensioattivo non ionico dai pozzi e lavare due volte i canali di perfusione aggiungendo 50 microlitri di HBSS a tutti i pozzi di ingresso e uscita perfusione. Aspirare l'HBSS dai pozzi. Preparare la Hoechst 1.000-2.000 per la colorazione dei nuclei e preparare la Phalloidin da 100 a 200 in HBSS per la colorazione dell'F-actin.Combina sei millilitri di HBSS, 30 microlitri di F-actin e tre microlitri di Hoechst in un tubo Falcon. Quindi aggiungere 25 microlitri ad ogni ingresso perfusione e prendere bene. Posizionare la piastra sotto un leggero angolo e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.Lavare due volte con 50 microlitri di HBSS in tutte le insenature e uscite perfusione. Quindi immagine diretta utilizzando un microscopio fluorescente con stadio automatizzato o conservare la piastra protetta dalla luce a quattro gradi Celsius per un uso successivo. In questo protocollo, i micro recipienti sono stati continuamente perfusi ed esposti a un gradiente di fattori di crescita angiogenici.La semina degli IPSC-EC utilizzando il metodo di pompaggio passivo ha portato a densità omogenee di semina. La timelapse di una goccia che viene posizionata sopra l'ingresso del canale microfluidico mostra la goccia subito dopo l'aggiunta, la goccia sopra il tronco di ingresso dopo l'aggiunta, fino a quando il menisco gocciolatore è stato appuntato dall'ingresso che ha portato a un flusso verso l'uscita. L'esposizione a un gradiente di fattori angiogenici ha portato alla germogliazione angiogenica direzionale dei micro vasi all'interno del collagene modellato un gel.La formazione di cellule a punta chiara e l'invasione nel collagene un gel era visibile 24 ore dopo l'aggiunta del gradiente angiogenico mentre le cellule stock, compresa la formazione di lume, erano visibili dopo 48 ore. Dopo la fissazione e la colorazione, sono stati identificati la forma e la lunghezza di questi germogli. Tuttavia, senza aggiunta di fattori di crescita, non è stata osservata alcuna invasione nel gel di collagene.Con l'imaging confocale, è stato determinato il diametro del germoglio e la formazione di lume è stata confermata. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per migliorare la ricerca di nuovi inibitori angiogenici. Questo potrebbe aiutare a trovare nuovi trattamenti contro la retinopatia diabetica, l'artrite reumatoide e il cancro.Attualmente stiamo esplorando come possiamo creare co-culture tra cui un modello della barriera ematica e degli organoidi vascolarizzati.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Una piattaforma tecnologica open source per la produzione di modelli di cultura 3D basati su idrogel in modo automatizzato e standardizzato

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...