Name: standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Detta arbete är delvis stöds av ett forskningsanslag från "Meer kennis met Minder Dieren" program (projektnummer 114022501) i den nederländska organisationen för hälsa forskning och utveckling (ZonMw) och den nederländska Heart Foundation CVON Consortium Grant Återansluta.

1. förberedelse av enheten
<ol><li>Överför mikroflödessystem 384-well-plattan till ett sterilt laminärt-Flow-huv.</li>
	<li>Ta bort locket och tillsätt 50 μL vatten eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till var och en av de 40 observationsbrunnarna (figur 1b, brunn B2) med en flerkanals eller upprepad pipett. Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Lämna plattan med locket på i det sterila odlings skåpet i rumstemperatur (RT).</li>
</ol>2. Förbered gel och beläggning
<ol><li>Bered 2,5 ml av 10 μg/ml Fibronektin (FN) beläggnings lösning. Späd 25 μl av 1 mg/ml Fibronektin stamlösning i 2,5 ml av Dulbecco ' s PBS (dpbs, kalcium och magnesium fri). Placera lösningen i vattenbadet vid 37 ° c till användning.</li>
	<li>Bered 100 μL kollagen-1-lösning. Tillsätt 10 μL av HEPES (1 M) till 10 μL NaHCO3 (37 g/L) och blanda genom pipettering. Placera röret på is och tillsätt 80 μL kollagen-1 (5 mg/mL) för att ge en neutraliserad kollagen-1 koncentration av 4 mg/mL. Använd en pipett för att blanda försiktigt och undvika bildandet av bubblor.</li>
	<li>Tillsätt 1,5 μL kollagen-1-lösning (4 mg/mL) till gel inloppet på varje mikrofluidisk enhet (figur 1b, brunn B1). Se till att droppet av gelen placeras i mitten av varje brunn för att gelen ska komma in i kanalen (se figur 2A). Anmärkning: Phaseguides förhindrar fyllning av intilliggande kanaler och möjliggör gel-mönkning. Korrekt gel lastning kan bekräftas under ett brightfield Mikroskop genom att observera menisken bildas genom "observation fönstret" (väl B2) eller genom att vända plattan upp och ner. Om gelen inte helt fyller kanalen, kan ytterligare en droppe av 1 μL tillsättas.</li>
	<li>Placera mikroflödessystem plattan i en inkubator (37 ° c, 5% Co2) för 10 min att polymerisera kollagen-1. Anmärkning: Timing av polymerisation är avgörande; på grund av de låga volymer som används i mikrofluidik, avdunstning kan redan observeras efter 15 min av inkubation, vilket resulterar i gel kollaps eller krympning.</li>
	<li>Ta ut plattan ur inkubatorn och överför till ett sterilt laminärt-flödesskydd.</li>
	<li>Tillsätt 50 μL av 10 μg/mL FN-beläggnings lösning till utloppet väl av den översta per fusions kanalen för varje mikrofluidisk enhet (figur 1b, väl a3). Tryck pipettspetsen mot sidan av brunnen för korrekt fyllning av brunnen utan att fånga upp luftbubblor (se figur 2b). Kanalen ska fyllas, och vätskan bör stift på utloppet (väl C1) utan att fylla utloppet väl.</li>
	<li>Placera plattan i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2) i minst 2 dagar. Anmärkning: Protokollet kan pausas här, eftersom kollagen-1-gelen tillsammans med beläggnings blandningen är stabil i minst 5 dagar i inkubatorn. Om beläggnings blandningen uppdateras kan längre perioder vara möjliga, men detta har inte testats. Avgörande är nivån av FN-beläggning, eftersom detta förhindrar uttorkning av kollagen-1 gel.</li>
</ol>3. cell sådd/mikrokärl kultur
<ol><li>Tillsätt 5 ml fetalt kalv serum och 2,5 ml penna/STREP till 500 ml basal endotelceller cellkulturmedium och filtersterilisera med en Flask topp filter med porstorlek 0,22 μm. Detta medium kallas nu basal medium.</li>
	<li>Förbered vaskulär tillväxtmedium: Tillsätt 3 μL av 50 μg/mL vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och 2 μL av 20 μg/mL grundläggande fibroblasttillväxtfaktorer (bFGF) till 5 mL basalt medium.</li>
	<li>Tina den frusna iPSC-ECs snabbt (< 1 min) i ett 37 ° Cwater bad och överför till en 15 mL tub och späd i 10 mL basala mediet.</li>
	<li>Räkna cellerna. Anmärkning: En enda injektionsflaska innehåller 1 000 000 celler i 0,5 mL med > 90% lönsamhet.</li>
	<li>Centrifugera röret vid 100 x g i 5 min. Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och Omsuspendera i basal medium för att ge en koncentration på 2 x 107 celler/ml.</li>
	<li>Överför mikroflödessystem 384-well-plattan från inkubatorn till ett sterilt laminärt-Flow Hood.</li>
	<li>Aspirera FN-beläggnings lösning från per fusions inloppet (brunn a1). Tillsätt 25 μL bas medium i inlopps brunnarna (brunn a1).</li>
	<li>Tillsätt en 1 μL droppe cellsuspension till varje topp perfusion inlopp väl (figur 1b, brunn a1). DROPP-programmet ska platta sig på några sekunder (se figur 3a, b för en illustration av denna "passiva pumpnings metod"). Obs: Kontrollera under ett Mikroskop om sådd är homogen. Om inte, tillsätt ytterligare 1 μl i utloppet och vänta tills dropp flackar.</li>
	<li>Inkubera den mikrofluidiska välplattan i 1 h vid 37 ° c, 5% CO2. Efter detta bör cellerna ha anslutit sig. Om inte, vänta ytterligare 30 min.</li>
	<li>Avlägsna det basala mediet från de övre per fusions utlopps brunnarna (figur 1b, väl a3). Tillsätt varmt kärl odlingssubstrat i det övre per fusions intaget och utloppet (figur 1b, brunnarna a1 och a3). Placera plattan på Rocker Platform (inställd på 7 ° vinkel, 8 min Gung intervall) i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2).</li>
	<li>Bildplattan med hjälp av ett brightfield Mikroskop med automatiserad fas vid dag 1 och 2 efter sådd för att bekräfta cellernas lönsamhet. Efter 2 dagar, en konfluenta enskiktslager bör ha bildats mot kollagen-1 byggnadsställning. Anmärkning: Om kanalerna inte verkar vara lika confluent, mikrofartyg kan odlas för en extra 24 h.</li>
</ol>4. studie angiogen Sprouting inklusive spets-och Stjälcellsbildning
<ol><li>Förbered 4,5 ml av angiogena groning medium genom att komplettera basala medium med 4,5 μl VEGF (50 μg/ml lager), 4,5 μl av phorbol 12-myristate-13-acetat (PMA) (2 μg/ml lager), och 2,25 μl av sphingosine-1-fosfat (S1P) (1 mm lager).</li>
	<li>Bered 8,5 mL odlingssubstrat för fartyg (basal medium kompletterat med 30 ng/mL VEGF och 20 ng/mL bFGF).</li>
	<li>Aspirera mediet från brunnarna och tillsätt 50 μL färskt kärl odlingssubstrat i de övre per fusions inloppet och utlopps brunnarna samt gel inlopp och utlopps brunnar (figur 1b, brunnar a1, A3, B1 och B3).</li>
	<li>Tillsätt 50 μl angiogen GRO-blandning till var och en av de nedersta per fusions kanalens inlopp och utlopps brunnar (figur 1b, brunnar C1 och C3).</li>
	<li>Sätt tillbaka enheten i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2) på Rocker-plattformen för att bilda en gradient av angiogena tillväxtfaktorer.</li>
	<li>Bild 1 dag och 2 dagar efter tillsats av angiogena tillväxtfaktorer med hjälp av ett brightfield Mikroskop med automatiserad fas. Anmärkning: Fortsätt odling av mikrokärlen för att studera anastomos (gå till avsnitt 5) eller fixera och färga mikrokärlen för att kvantifiera groning längd och morfologi vid dag 2 och dag 6 (gå till avsnitt 6).</li>
</ol>5. studie anastomosis och spira stabilisering
<ol><li>Bild med hjälp av ett brightfield Mikroskop med automatiserad fas.</li>
	<li>Tillsätt 1 μL Fluorescent märkt albumin (0,5 mg/mL) till det övre per fusions intaget (figur 1b, brunn a1) och blanda med en 50 μl pipett.</li>
	<li>Överför plattan till ett fluorescerande Mikroskop med automatiserad fas och inkubator inställd på 37 ° c. Ställ in Mikroskop vid 10X mål och korrekta exponeringsinställningar (t. ex. tetrametylrodamin [TRITC]-kanal, 20 MS-exponering). Få tid-lapse bilder varje minut för 10 min.</li>
	<li>Ta bort plattan från mikroskopet och överför plattan till ett sterilt laminärt flödes skydd.</li>
	<li>Ta bort allt medium från brunnarna och Byt ut både kärl odlingsmediet och angiogena groning-mediet i motsvarande brunnar (se steg 4,3 och 4,4).</li>
	<li>Sätt tillbaka enheten i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2) för att fortsätta angiogen Sprouting.</li>
	<li>Upprepa steg 5.1 − 5.6 för att studera permeabiliteten dag 6.</li>
</ol>6. fixering, färgning och avbildning
<ol><li>Aspirera alla kultur medier från alla brunnar. Anmärkning: Restmedium eller vätskor i mikrofluidiska kanaler påverkar inte fixeringen på grund av dess låga volym på 1 − 2 μL.</li>
	<li>Tillsätt 25 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS till alla per fusions inloppet (figur 1b, a1 och C1) och utlopps brunnar (figur 1b, A3 och C3). Inkubera i 10 minuter vid RT. Placera enheten under en liten vinkel (± 5 °) för inducera flöde (t. ex. genom att placera ena sidan av plattan på ett lock).</li>
	<li>Aspirera PFA från brunnarna. Tvätta alla perfusion inlopp och utlopp två gånger med 50 μL av Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS). Aspirera HBSS från Wells.</li>
	<li>Permeabilize vid RT för 10 min genom att tillsätta 50 μl av 0,2% icke-jonaktivt tensid till alla perfusion inlopp och utlopp.</li>
	<li>Aspirera det nonjoniska ytaktivt ämnet från brunnar. Tvätta perfusion kanalerna två gånger genom att tillsätta 50 μL av HBSS till alla perfusion inlopp och utlopp brunnar. Aspirera HBSS från Wells.</li>
	<li>Färga kärnor med Hoechst (1:2000) och F-Actin med phalloidin (1:200) i HBSS. Förbered 2,2 mL för 40 enheter, och tillsätt 25 μL till varje perfusion inlopp och utlopp väl. Placera plattan under en liten vinkel och inkubera vid RT i minst 30 min.</li>
	<li>Tvätta två gånger med 50 μL av HBSS i alla perfusion inlopp och utlopp.</li>
	<li>Direkt bild med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop med automatiserad fas eller förvara plattan skyddad från ljus vid 4 ° c för senare användning.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro.">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li><li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes.">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).</li><li>Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+model+to+reconstitute+sprouting+lymphangiogenesis+in+vitro.">Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 78, 115-128 (2016).</li><li>Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+microfluidic+angiogenesis+screen+for+studying+anti-angiogenic+therapeutic+drugs.">A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs.</a> Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+Biomimetic+Pericyte-Covered+3D+Microvascular+Network.">Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network.</a> PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).</li><li>Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+microenvironment+systems+for+modeling+human+vasculature.">Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature.</a> Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).</li><li>Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+end-user+perspective+on+Organ-on-a-Chip:+Assays+and+usability+aspects.">An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).</li><li>Pagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+design+and+fabrication+of+microfluidic+devices+for+cell+cultures:+An+effective+approach+to+control+cell+microenvironment+in+three+dimensions.">Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions.</a> Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).</li><li>Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineers+are+from+PDMS-land,+Biologists+are+from+Polystyrenia.">Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia.</a> Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8, 14361 (2017).</li><li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research.">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li><li>Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Tissue+and+Disease+Modeling+using+hiPSCs.">Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).</li></ol>

P. Vulto och T. Hankemeier är aktieägare i Mimetas BV. V. Borgdorff och A. REIJERKERK är anställda vid Ncardia BV. V. van Duinen, W. stam, V. V. Orlova och A.J. van zonneveld har inga avslöjanden.

Denna metod beskriver kulturen i 40 perfusable endoteliala mikrofartyg inom en robust och skalbar mikroflödessystem cellkultur plattform. Jämfört med traditionella 2D-och 3D-cellkulturmetoder visar denna metod hur en fysiologisk relevant cellulär mikromiljö som inkluderar gradienter och kontinuerlig perfusion kan kombineras med 3D-cellkultur med adekvat genomströmning för screening Ändamål.
En av de stora fördelarna jämfört med jämförbara mikroflödessystem analyser är att denna metod inte förlitar sig på pumpar för perfusion men använder en rocker plattform för att inducera kontinuerlig perfusion i alla mikroflödessystem enheter samtidigt. Detta säkerställer att analysen är robust och skalbar: plattorna kan staplas på en rocker plattform. Viktigt är att alla mikroflödessystem enheter förblir individuellt adresserbara, vilket gör att denna metod som skall genomföras inom läkemedels screening inklusive generering av en dos-responskurva. Dessutom, utan en pump, avbildning och medelstora ersättare är mycket enklare med mindre risk för (kors)-förorening.
En annan fördel med denna metod är användning av en standardiserad, pre-tillverkad plattform, medan jämförbara mikroflödessystem cellkultur plattformar måste tillverkas av slutanvändarna. Denna tillgänglighet underlättar antagandet av denna analys bland andra akademiska och farmaceutiska forskargrupper, vilket leder till standardisering. Till skillnad från mikrofluidiska prototyper säkerställer 384-well-plattgränssnittet kompatibilitet med den aktuella laboratorieutrustningen (t. ex. aspirare, platthanterare och flerkanalpipetter), vilket underlättar integrationen inom den nuvarande screening infrastrukturen .
Det finns flera kritiska steg för att utföra denna analys. Kollagen-1-gelen ska fylla gel kanalen helt. Vid laddning av gel kan denna fyllning observeras genom att inspektera de mikrofluidiska kanalerna antingen genom observations fönstret (figur 2A) eller genom att vrida plattan upp och ner (som visas i figur 1a). Medan fyllning, kollagen gel bör förbli i centrum kanalen, utan att strömma in i angränsande perfusion kanaler. Vi märkte att kvaliteten på kollagen-1 gel är avgörande för korrekt analys prestanda. Kollagen-1 partier med för hög viskositet kommer att leda till ofullständig fyllning av gel kanalen. Efter 10 min av polymerisation vid 37 ° c, bör gelen vara homogen och klar. Om kollagen-1 inte lagras på rätt sätt (t. ex. på grund av fluktuerande temperaturer i kylskåpet), kommer kollagen polymerisera inom kanalerna med tydligt synlig fiber bildning. Detta kan resultera i invasion av ECs i gelen utan tillsats av angiogena faktorer, men utan ordentlig lumen utveckling.
När cellerna är seedade avlägsnas Fibronektin-beläggningen från brunnarna, vilket innebär att endast de mikrofluidiska kanalerna fylls med beläggnings lösning. Aspiration av beläggnings lösningen från mikrofluidiska kanaler kan orsaka gel avbrott eller gel aspiration. Cellsuspensionen måste ersätta/tränga undan denna beläggnings lösning. Detta fungerar bäst när cellsuspensionen är seedad med hjälp av den passiva pump metoden, som direkt Pipettera cellsuspensionen i kanalerna visar mindre reproducerbara sådd tätheter.
Eftersom mikrokärlen bildar en stabil enskiktslager mot gelen, dessa små skillnader bara resultera i olika tider som behövs för att nå sammanlänkning. Således är analysens startpunkt bestäms av confluency snarare än kultur tid. Vid behov kan odlings tiden förlängas tills en klar enskiktslager har bildats mot gelen.
I brunnarna kan luftbubblor fastna genom felaktig fyllning av brunnarna (se figur 2b). Dessa luftbubblor kommer att begränsa flödet av medium, även när enheten är placerad på en rocker plattform, och resultera i kollaps av mikrokärl och felaktig lutning formation. Genom att trycka pipettspetsen mot sidovägg av brunnar kommer att öka framgången för att helt fylla brunnen. Om en luftbubbla fastnar i brunnarna kan den avlägsnas genom att försiktigt sätta in en steril pipettspets i glas bottnen. Luftbubblor kan också förekomma i mikrofluidiska kanaler. När mediet har tagits bort från brunnarna, är avdunstning av mediet märkbar från mikroflödessystem kanaler efter 30 min (på grund av mikroliter volymer inom kanalerna). Således utförs medelstora förändringar företrädesvis så snabbt som möjligt. När mediet tillsätts i en kanal med evaporerat medium kommer luftbubblor att fastna i de mikrofluidiska kanalerna. Dessa luftbubblor i mikrofluidiska kanaler kan avlägsnas manuellt genom att placera en P20 pipett direkt på antingen inloppet eller utlopp och tvinga medium genom mikrofluidik från motsatt brunn. Framgångsrik avlägsnande av luftbubblor resulterar i en liten men märkbar minskning av volymen i den andra brunnen. Tabell 1 visar vanliga fel och hur du felsöker dem.
Avsaknaden av en pump är en begränsning när kontinuerlig avbildning krävs, eftersom Rocker plattformen begränsar användaren till bild i sekventiella tidsintervall. Vidare, den perfusion av medium i denna plattform består av dubbelriktade flöde med låga nivåer av skjuvning stress, medan kärl in vivo utsätts för enkelriktade flöde med högre nivåer av skjuvning stress. Även om vi inte iakttar negativa effekter av det dubbelriktade flödet när det gäller angiogena Sprouting, är Flow en viktig biomekanisk stimulans och företrädesvis kontrollerad. Men medan det finns kommersiellt tillgängliga pump uppställningar, gränssnitt med 384-väl plattan fortfarande utmanande och pump uppställningar allvarligt hämma skalbarheten i denna analys.
Möjligheten att använda IPSC-ECs för att studera angiogen groning öppnar nya möjligheter inom sjukdomsmodellering och läkemedelsforskning. I motsats till primära ECs, dessa celler kan genereras i nästan obegränsade mängder med en stabil genotyp och genom att använda genomedigering tekniker, celler kan genereras som inklusive genknockouts och knock-ins. Eftersom protokollen för att särskilja ECs från iPSC är relativt nya är det dock fortfarande oklart vad som leder till iPSC-ECs som bäst återspeglar primära ECs och vilka undertyper av EG som är eller kan genereras. Dessutom finns det fortfarande kvarstående frågor om deras relevans. Exempelvis uppvisar iPSC-ECs fortfarande den plasticitet som är typisk för endotelceller? Och i vilken grad gör iPSC-härledda celler svara på och interagera med sina cellulära mikromiljö? Den standardiserade plattform som presenteras här kan användas för att besvara några av dessa frågor för att ytterligare validera användningen av iPSC-härledda ECs in vitro.
Den mest rättframma framtida riktningen för denna analys kommer att vara integrationen av andra celltyper som spelar en viktig roll under angiogenes, såsom pericyter och makrofager. Detta kommer att underlätta möjligheten att studera rollen av makrofager under anastomos mellan groddar eller vidhäftning av pericyter efter kapillärbildning. Också, det är möjligt att odla olika andra celltyper inom eller mot en extracellulär matris (t. ex., vi har visat kulturen av nervceller och olika epitelial strukturer såsom proximala tubuli och tunntarm), som kan kombineras med den vaskulära sängar som genereras med denna metod. Slutligen, det kommer att bli intressant att studera angiogena groning i syntetiska hydrogels, som deras definierade sammansättningen ytterligare ökar standardiseringen av analysen och tillåter trimning av stelhet och bindande motiv som påverkar cell-matris interaktioner.
Sammanfattningsvis visar denna metod genomförbarheten av iPSC-härledda ECs i en standardiserad och skalbar 3D angiogen analys som kombinerar fysiologiska relevanta odlingsförhållanden i en plattform som har erforderlig robusthet och skalbarhet som ska integreras i infrastrukturen för läkemedels screening.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 &#181;L of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 &#181;L of basal medium in the outlet well (well A3).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

In vitro-modeller spelar en grundläggande roll i upptäckten och validering av nya läkemedel mål av vaskulära sjukdomar. Aktuella in vitro-screening modeller som har tillräcklig genomströmning har dock endast begränsad fysiologisk relevans1, vilket hindrar översättningen av fynd från in vitro till in vivo. Således, för att främja prekliniska vaskulär läkemedelsforskning, förbättrade in vitro-modeller av kärl är nödvändiga som kombinerar hög genomströmning screening med en fysiologiskt relevant 3D cellulära mikro-miljö.
Inom det senaste decenniet har betydande framsteg gjorts för att öka den fysiologiska relevansen av in vitro-modeller av kärl. Istället för att odla endotelceller på plana ytor som vävnadsodling kan endotelceller bäddas in i 3D-ställningar, såsom fibrin och kollagen Gels2. Inom dessa matriser, endotelcellerna visar en mer fysiologiskt relevant fenotyp i samband med matris nedbrytning och lumen bildas. Dessa modeller visar dock bara en delmängd av de många processer som uppstår under angiogen groning som viktiga ledtrådar från den cellulära mikromiljön saknas fortfarande.
Mikrofluidiska cellkulturplattformar är unikt lämpade för att ytterligare öka den fysiologiska relevansen av in vitro-modeller av kärl. Till exempel, endotelceller kan utsättas för skjuvning stress, vilket är en viktig biomekanisk stimulans för kärl. Även möjligheten att rumsligt kontrollera vätskor inom mikrofluidik tillåter bildandet av biomolekylära gradienter3,4,5,6. Sådana gradienter spelar en viktig roll in vivo under bildandet och mönstringen under angiogenes. Men medan mikroflödessystem cellkultur plattformar har visat oöverträffad fysiologiska relevans över traditionella 2D-och 3D-cellkultur metoder, de saknar ofta den nödvändiga genomströmning, skalbarhet och standardisering som krävs för Drug screening 7. Dessutom är många av dessa plattformar inte kommersiellt tillgängliga och kräver slutanvändare att microfabricate sina enheter före användning8. Detta kräver inte bara tillverkande apparatur och teknisk kunskap, utan begränsar också kvalitetskontrollens nivå och inverkar negativt på reproducerbarheten9.
Hittills är primära humana endotelceller fortfarande den mest använda cell källan för att modellera angiogenes in vitro10. Emellertid, primära mänskliga celler har ett antal begränsningar som hindrar deras rutinmässig tillämpning i screeningmetoder. För det första finns det en begränsad möjlighet att skala upp och expandera primära cell-härledda kulturer. För storskaliga experiment måste därför partier från olika givare användas, vilket leder till genomiska skillnader och variationer i parti-till-sats. För det andra, efter några passager, primära endotelceller förlorar i allmänhet relevanta egenskaper när odlade in vitro-11,12.
Endotelceller som härrör från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) är ett lovande alternativ: de liknar primära celler, men med en stabilare genotyp som också är mottagliga för exakt genom redigering. Dessutom kan iPSCs självförnya och därmed utökas i nästan obegränsade kvantiteter, vilket gör iPSC-härledda celler till ett attraktivt alternativ till primära celler för användning inom in vitro-screening modeller13.
Här beskriver vi en metod för att odla endotelceller som perfusable 3D microfartyg i en standardiserad, hög genomströmning mikroflödessystem cellkultur plattform. Perfusion appliceras genom att placera enheten på en rocker plattform, vilket garanterar robust drift och ökar skalbarheten i analysen. Eftersom mikrokärlen kontinuerligt är parfymiserade och utsätts för en gradient av angiogena faktorer studeras angiogen groning i en mer fysiologisk relevant cellulär mikromiljö. Medan protokollet är förenligt med många olika källor av (primära) endotelceller14,15, fokuserade vi på att använda humant IPSC-härledda ECs för att öka standardiseringen av denna analys och för att underlätta dess integration inom vaskulär läkemedelsforskning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-10 &#956;L Electronic repeater pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z654566-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-lane OrganoPlate</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td>4003-400B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal culture medium</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-1</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Biopur 2.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Repeater M4 pieptte</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4759-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3569</td>
			<td>10 mg/mL solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-derived endothelial cells</td>
			<td>NCardia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>37 g/L in milliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td>Mimetas</td>
			<td></td>
			<td>Rocker platform used to provide flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>1 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Focus-Biomolecules</td>
			<td>10-2165</td>
			<td>2 &#956;g/mL in PBS containing 0.1% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1P</td>
			<td>Ecehelon Biosciences</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>1 mM in methanol containing 1% acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32-10</td>
			<td>50 &#956;g/mL in water containing 0.1% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized and scalable assay to study perfused 3d angiogenic sprouting of ipsc-derived endothelial cells in vitro

Preklinisk läkemedelsforskning av vaskulära sjukdomar kräver in vitro-modeller av kärl som är omprövnings bara för hög genomströmning screening. Aktuella in vitro-screening modeller som har tillräcklig genomströmning har dock endast begränsad fysiologisk relevans, vilket hindrar översättningen av fynd från in vitro till in vivo. Å andra sidan, mikroflödessystem cellkultur plattformar har visat oöverträffad fysiologiska relevans in vitro, men ofta saknar den nödvändiga genomströmning, skalbarhet och standardisering. Vi visar en robust plattform för att studera angiogenes av endotelceller härledda från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-ECs) i en fysiologisk relevant cellulär mikromiljö, inklusive perfusion och gradienter. IPSC-ECs odlas som 40 perfunderade 3D microfartyg mot en mönstrad kollagen-1 byggnadsställning. Vid applicering av en gradient av angiogena faktorer, kan viktiga kännetecken för angiogenes studeras, inklusive differentiering i spets-och stjälk cell och bildandet av perfusable lumen. Perfusion med fluorescerande Tracer färgämnen gör det möjligt att studera permeabilitet under och efter anastomos av angiogena groddar. Sammanfattningsvis visar denna metod genomförbarheten av iPSC-härledda ECs i en standardiserad och skalbar 3D angiogen analys som kombinerar fysiologiska relevanta odlingsförhållanden i en plattform som har erforderlig robusthet och skalbarhet som ska integreras i infrastrukturen för läkemedels screening.

Den mikroflödessystem 3D cellkultur plattform består av 40 perfunderade mikroflödessystem enheter (figur 1a, b), som används för att studera angiogena groning av parfymiserade mikrofartyg mot en mönstrad kollagen-1 gel (figur 1c). Dessa mikrokärl är kontinuerligt parfymiserade och utsätts för en gradient av angiogena tillväxtfaktorer (figur 3a-d). De angiogena groddar kan antingen studeras 2 dagar efter lutning exponering eller odlas i mer än 5 dagar efter lutning exponering för studie anastomos och spira stabilisering (se tidslinje, figur 1d).
Sådd av iPSC-ECs med hjälp av den passiva pump metoden bör resultera i homogena sådd tätheter (figur 4a, b). Kultur under kontinuerlig perfusion resulterade i konfluenta mikrokärl i 2 dagar, med cellerna helt kantar omkretsen av den mikroflödessystem kanalen och bildandet av en konfluenta enskiktslager mot den mönstrade kollagen-1 gel.
Exponering för en gradient av angiogena faktorer resulterade i riktad angiogen groning av mikrokärlen i den mönstrade kollagen-1-gelen (figur 5a-g). Klar spets cell formation och invasion i kollagen-1 gel var synlig 24 h efter tillsats av angiogena gradienten, medan stjälk celler inklusive lumen bildas var synliga efter 48 h (figur 5a).
Efter fixering och färgning kan kapillärnätet visualiseras med hjälp av phalloidin för att färga F-Actin och använda Hoechst 33342 för att färga kärnan (Figur 5b, c). Dessa groddar kan kvantifieras (t. ex. form och längd14). Utan tillsats av tillväxtfaktorer, ingen invasion i kollagen-1 gel bör observeras (figur 5D). Konfokal avbildning användes för att bestämma spira diametern och för att bekräfta lumen bildning (figur 5e-g).
Groddar fortsätter att växa mot riktningen av lutningen och nå motsatt perfusion kanal inom 3 − 4 dagar efter tillsats av angiogena tillväxtfaktorer. Detta resulterar i ombyggnad av kärl nätet, med en tydlig minskning av antalet angiogena groddar (figur 6a). Lumen bildningen bedömdes genom perfusion av det vaskulära nätverket med fluorescerande märkta makromolekyler (t. ex. albumin eller dextrans). Parfymera mikrokärlen med 0,5 mg/ml märkt albumin före och efter anastomos visade en klar skillnad i spira permeabilitet efter 10 min (figur 6b-e), vilket tyder på att kapillärerna stabiliseras och mogna efter anastomos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig1.jpg"> Figur 1: Microfluidic cell Culture Protocol för iPSC-härledda mikrofartyg. (a) botten av mikroflödessystem cell Culture enheten visas visar 40 mikroflödessystem enheter som är integrerade under den 384-väl plattan. Större vy visar en av 40 mikrofluidiska enheter. (b) varje mikroflödessystem enhet är placerad under 9 brunnar med 3 inlopp brunnar och 3 utlopp brunnar. De microfluidiska kanalerna separeras av åsar (' phaseguides '), som möjliggör mönstringen av hydrogeler i den centrala kanalen (' gel Channel '), medan det fortfarande finns kontakt med de angränsande kanalerna (' perfusion Channels '). (c) metod för att odla ett parfymierat mikrokärl inom mikroflödessystem-enheten, som används för att studera gradientdriven angiogen groning genom en mönstrad kollagen-1-matris. dtidslinje för studier av angiogen groning och/eller anastomosis. Denna siffra har modifierats från van Duinen et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig2.jpg"> Figur 2: lastnings procedurer för gel och medium. a) exempel på korrekt och felaktig gel deposition. Korrekt arkivering resulterar i en mönstrad kollagen-1 gel i mittkanalen, som därefter polymeriseras. b) exempel på korrekt och felaktig fyllning av brunnarna. Brunnarna fylls i storleksordningen 1 − 4 för att förhindra att luftbubblor svälls i mikrofluidiska kanaler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig3.jpg"> Figur 3: kontinuerligt hydrostatiskt tryck drivet flöde och lutning stabilisering. (a) hydrostatiska tryckskillnader mellan brunnar resulterar i passiv utjämning och flöde inom mikrofluidiska kanaler. (b) Placera enheten på en rocker plattform inställd på 7 ° och 8 min cykel tid resulterar i kontinuerlig, dubbelriktad perfusion inom mikrofluidic kanaler. (c) gradienter bildas genom att införa två olika koncentrationer i brunnarna, som kontinuerligt uppdateras genom passiv utjämning. d) gradient visualisering med fluorescein isotiocyanat (FITC)-dextran. Dubbelriktat flöde stabiliserar lutningen upp till 3 dagar. Skalstapel = 200 μm. Denna siffra har modifierats från van Duinen et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig4.jpg"> Figur 4: passiv pump metod för cell sådd. apassiv pumpning styrs av tryckskillnader som orsakas av skillnader i ytspänningen. Detta resulterar i ett flöde från DROPP (högt internt tryck) mot behållaren (lågt inre tryck). (b) tidsfördröjning för en DROPP (grå kontur) som är placerad ovanpå inloppet (vit kontur) på mikroflödessystem-kanalen (blå kontur). Direkt efter tillsats (figur 4b, i), droppar på toppen av inloppet krymper (figur 4b, II: 1 s efter tillsats; IV: 2 s efter addition), vilket resulterar i ett flöde mot utloppet. Detta fortsätter tills dropp menisken är fäst vid inloppet (figur 4b, IV). Scale bar = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig5.jpg"> Figur 5: robust 3D-groning av IPSC-EC-mikrofartyg. a) Sprouting av IPSC-EC över tiden. Mikrofartyg odlades för 48 h (höger) och sedan stimuleras med en angiogen cocktail som innehåller 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P, och 2 ng/mL PMA. De första spets-celler som invaderar kollagen-1 byggnadsställning (mitten) är synliga 24 h efter exponering. De första lumen är synliga (pilar) 48 h efter exponering (höger) medan spetsen-celler har migrerat vidare i riktning mot gradienten. (b) en matris med 15 mikrofartyg som stimulerades med VEGF, S1P och PMA i 2 dagar och färgas för F-Actin (gul) och kärnor (blått). Skalbar = 200 μm.cstimulerad mikrokärl (positiv kontroll). d) ostimulerad mikrokärl (negativ kontroll). e) den maximala projektionen av en enda kapillär i gelen. (f) samma som (g) men fokuserade på mitten. Streckad linje anger positionen för den rätvinkliga vyn i panel g. skalstreck (a-d: 200 μm, e-g: 20 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig6.jpg"> Figur 6: visualisering av angiogen GRO permeabilitet före och efter anastomosis. (a) anastomosis med basal kanal utlöser beskärning och mognad av angiogena groddar. Närbild av kapillärbädd vid 2, 4, 6 och 7 dagar efter stimulering med angiogena tillväxtfaktorer. b) angiogena groddar efter 2 dagar efter tillsats av angiogena tillväxtfaktorer. Angiogena groddar bildas inom gel, men är ännu inte ansluten till botten perfusion kanal. c) perfusion av mikrokärlet med 0,5 mg/ml albumin-Alexa 555 lösning. Fluorescerande bilder erhållna vid 0 och 10 min. (d, e) samma som i panelerna b och c, men efter 7 dagar av stimulering. Groddar är anslutna till den andra sidan och bildade en konfluenta mikrokärl i basal perfusion Channel. Skalstreck = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig6large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problem</td>
			<td>Orsaka</td>
			<td>Lösning</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Kollagen-1 går inte in i eller fyller kanalen helt</td>
			<td>Kollagen-1 droppe är inte placerad ovanpå inloppet</td>
			<td>Placera försiktigt droppet ovanpå inloppet från gel kanalen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volymen av kollagen-1 är för låg</td>
			<td>Använd 1,5 μL av gelen för att fylla kanalen helt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagen-1 är för trögflytande</td>
			<td>Använd en annan sats av kollagen-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagen-1 flödar in i perfusion kanaler</td>
			<td>Kollagen-1 pipetteras direkt in i gel kanalens inlopp</td>
			<td>Placera försiktigt droppet ovanpå inloppet från gel kanalen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Kollagen-1 är inte klar/fiber formation</td>
			<td>Kollagen-1 lagras inte korrekt</td>
			<td>Förvara kollagen-1 vid 4 ° c, frys inte</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 och Hepes inte blandas väl innan du lägger kollagen-1</td>
			<td>Blanda noga NaHCO3 och Hepes genom att Pipettera innan kollagen-1-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Droplet krymper inte med passiv pump metod</td>
			<td>Droplet fäster vid sidan av brunnen</td>
			<td>Aspirera dropp och tillsätt ny droppe ovanpå inloppet</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Se till att utloppet väl är fyllt med minst 20 μL medium</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Ingen groning observeras</td>
			<td>Tillväxtfaktorer läggs inte till eller alikvoter lagras inte korrekt</td>
			<td>Förbered färskt angiogent groning medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luftbubbla block perfusion/lutning formation</td>
			<td>Ta bort luftbubblor med hjälp av en P20 eller P200 pipett</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volymskillnader mellan brunnar</td>
			<td>Volymerna i alla brunnar måste vara lika för att kunna bilda en linjär gradient</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Celler inte livskraftiga</td>
			<td>Plattan inte placerad på Rocker plattform/Rocker plattform avstängd</td>
			<td>Se till att Rocker Platform är på och har rätt cykeltid/vinkel (8 min/7 °)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ingen perfusion möjlig på grund av förekomst av luftbubblor</td>
			<td>Ta bort luftbubblor med hjälp av en P20 eller P200 pipett</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inga lumen bildas, celler migrerar som enstaka celler</td>
			<td>Angiogen groning-blandning lades till innan en enskiktslager bildades</td>
			<td>Vänta ytterligare 24 timmar innan du lägger till de angiogena tillväxtfaktorerna</td>
		</tr>
<tr>
<td>Större variation i groning densitet</td>
			<td>Skillnader i cell tätheter efter sådd</td>
			<td>Kontrollera om CELLTÄTHETEN är homogen och jämförbar mellan mikrofluidiska enheter. Lägg till ytterligare en droppe cellsuspension vid behov</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Felsöka vanliga fel.

Watch this Scientific Journal Video about Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro at JoVE.com

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Denna metod beskriver kulturen av IPSC-härledda endotelceller som 40 perfunderade 3D microkärl i en standardiserad mikroflödessystem plattform. Denna plattform gör det möjligt att studera gradientdriven angiogen groning i 3D, inklusive anastomos och stabilisering av angiogena groddar i ett skalbart och högt dataflöde sätt.

Standardiserad och skalbar analys för att studera Parfymiserad 3D angiogen Sprouting av iPSC-härledda endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Denna in vitro-analys visar angiogenic groning i en hög genomströmning och skalbar plattform. Detta skulle kunna användas för att hitta nya mål i angiogenes. Denna angiogenesanalys kombinerar komplexa cellulära mikromiljöer som inkluderar gradienter och perfusion med en plattform som är kompatibel med screening med högt genomflöde.Angiogenes spelar en viktig roll i både hälsa och sjukdom. Förstå de mekanismer som uppstår under angiogenes kan hjälpa oss att förstå hur cancer växer och hur vävnader reparation. Denna metod skulle kunna ge insikt i mekanismerna under hjärt-kärlsjukdomar och vävnadsregenerering.I båda, angiogenes spelar en viktig roll. För första gången användning av denna mikrofluidiska plattform, måste du vara medveten om lagen om volymer och hur man pipetter. Du kan bekräfta stegen genom att titta under ett mikroskop eller vända plattan upp och ner.Vissa steg är svåra att få en känsla för när man bara läser metoden, till exempel hur små de mikrofluidiska kanalerna är eller hur man håller plattan. Demonstrera dessa förfaranden kommer wendy Stam, en tekniker från vårt laboratorium. Till att börja, överför den mikrofludic 384-väl plattan till en steril laminär flödeshuva.Ta bort locket och tillsätt 50 mikroliter vatten eller fosfatbuffrad saltlösning till var och en av de 40 observationsvälgarna med hjälp av en flerkanalspipett. Tillsätt sedan 1,5 mikroliter av fyra milligram per milliliter kollagen en lösning på gel inloppet av varje mikrofluidic enhet. Se till att droppe gel placeras i mitten av varje brunn för att gelen ska komma in i kanalen.Efter fyllning fem mikrofluidiska enheter, vänd plattan upp och ner för att visuellt inspektera korrekt fyllning av gelkanalerna. Placera mikrofludicplattan i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 10 minuter för att polymerisera kollagen ett. Ta sedan plattan ur inkubatorn och överför till en steril laminär flödeshuva.Tillsätt 50 mikroliter på 10 mikrogram per milliliter fibronectin-kodningslösning till utloppsvälen på den övre perfusionskanalen för varje mikrofluidisk enhet. Tryck pipetterspetsen mot sidan av brunnen för korrekt fyllning av brunnen utan att fånga luftbubblor. Kanalen fyller och de flytande pannor på utloppet utan att fylla utloppet väl.Placera sedan plattan i inkubatorn i minst två dagar. Nu, snabbt tina den frusna IPSC-ECs för mindre än en minut i en 37 grader Celsius vattenbad. Överför sedan cellerna till ett 15 milliliter rör och tillsätt långsamt 10 milliliter basalt medium för att späda ut.Rita 10 mikroliter av lösningen och räkna cellerna på en cellräknare. Centrifugera röret vid 100 gånger g i fem minuter. Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och resuspend i basalt medium för att ge en koncentration på två gånger 10 till de sjunde cellerna per milliliter.Därefter överför den mikrofluidiska 384-brunnsplattan från inkubatorn till en steril laminär flödeshuv. Aspirera den fibronectin kodningslösningen från perfusion utlopp och tillsätt 25 mikroliter av basalt medium i utlopps brunnarna. Lägg till en en mikroliterdropp av cellfjädring till varje toppperfusionsinloppskälla.Droppen plattar till på några sekunder. Kontrollera under ett mikroskop om sådden är homogen inom en enda kanal och mellan kanaler. Inkubera den mikrofluidiska brunnsplattan i en till 1,5 timmar vid 37 grader Celsius och 5 %koldioxid.Kontrollera efter det cellerna för att bekräfta att de har följt. Ta bort basalmediet från de övre perfusionsutloppsväldarna. Lägg varma kärl odlingsmedium i toppen perfusion inlopp och utlopp.Placera plattan på en vippplattform som är inställd på en sju graders vinkel och åtta minuters gungintervall i inkubatorn. Vid dag ett och två post-seeding, bild plattan med hjälp av en Brightfield mikroskop med automatiserat skede för att bekräfta cellens livskraft. Efter två dagar har en konfluent monolayer bildats mot kollagen en byggnadsställning.Först, förbereda 4,5 milliliter av angiogenic spirande medium genom att komplettera 4,5 milliliter basalt medium med 4,5 mikroliter av VEGF lager, 4,5 mikroliter PMA lager, och 2,25 mikroliter av S1P lager. Förbered 8,5 milliliter av kärltillväxtmedium genom att komplettera basalt medium med 5,1 mikroliter av VEGF och 3,4 mikroliter av BFGF. Aspirera medium från brunnarna och tillsätt 50 mikroliter av färskt kärl odling medium i toppen perfusion inlopp och utlopp brunnar och gel inlopp och utlopp brunnar.Tillsätt sedan 50 mikroliter av angiogenic sprout blandning till var och en av botten perfusion kanal inlopp och utlopp brunnar. Placera plattan tillbaka i inkubatorn på vippplattformen för att bilda en gradient av angiogena tillväxtfaktorer. En dag och två dagar efter tillägg av de angiogena tillväxtfaktorerna, använd ett Brightfield-mikroskop för att avbilda brunnarna på en automatiserad scen.För att studera anastomos och sprout stabilisering, lägga till en microliter av 0,5 milligram per milliliter fluorescerande märkt albumin till toppen perfusion inlopp. Blanda sedan lösningen med en 50 mikroliterpipett. Överför plattan till ett fluorescerande mikroskop med automatiserad scen och inkubator inställd på 37 grader Celsius.Ställ in mikroskopet på 10X-målsättningen och korrigera exponeringsinställningarna. Förvärva timelapse bilder varje minut i 10 minuter. Ta bort plattan från mikroskopet och överför plattan till en steril laminär flödeshuva.Ta bort allt medium från brunnarna och byt ut både kärlodlingsmediet och angiogent groningsmedium i motsvarande brunnar. Placera den mikrofluidiska plattan tillbaka in i inkubatorn för att fortsätta angiogenic groning. På dag sex, upprepa bildbehandling för att studera permeabilitet.För att fixa cellkulturen aspirerar du alla odlingsmedier från brunnarna. Tillsätt 25 mikroliter på 4%PFA i PBS till alla perfusions- och utloppsväldarna. Placera sedan en sida av den mikrofluidiska plattan på locket i en liten vinkel på fem grader för att framkalla flöde.Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur. Därefter aspirera PFA från brunnarna. Tvätta alla perfusionsinlopp och uttag två gånger med 50 mikroliter hbss.Därefter aspirera HBSS från brunnarna. Paraformaldehyd är en farlig kemikalie som bör hanteras med handskar och endast öppnas i en rökhuva. Därefter lägger du till 50 mikroliter av 0,2%icke-joniska ytaktiva ämnen till alla perfusionsinlopp och uttag för att permeabilisera vid rumstemperatur i 10 minuter och placera den mikrofluidiska plattan på locket vid en liten vinkel på fem grader.Aspirera det icke-joniska ytaktiva från brunnarna och tvätta perfusionskanalerna två gånger genom att tillsätta 50 mikroliter av HBSS till alla perfusionsinlopps- och utlopps brunnar. Aspirera HBSS:en från brunnarna. Förbered Hoechst 1, 000 till 2, 000 för färgning av atomkärnorna och förbered Phalloidin 100 till 200 i HBSS för färgning F-aktin.Kombinera sex milliliter HBSS, 30 mikroliter av F-aktin och tre mikroliter Hoechst i ett Falcon-rör. Tillsätt sedan 25 mikroliter till varje perfusion inlopp och utlopp väl. Placera plattan under en lätt vinkel och inkubera i rumstemperatur i minst 30 minuter.Tvätta två gånger med 50 mikroliter av HBSS i alla perfusions inlopp och utlopp. Sedan direkt bild med hjälp av ett fluorescerande mikroskop med automatiserad scen eller lagra plattan skyddas från ljus vid fyra grader Celsius för senare användning. I detta protokoll perfunderades och exponerades mikrokärlen kontinuerligt för en gradient av angiogena tillväxtfaktorer.Seedning av IPSC-ECs med hjälp av passiva pumpmetoden resulterade i homogena sådddensiteter. Timelapse av en droppe som är placerad på toppen av inloppet av mikrofluidiska kanalen visar droppen direkt efter addition, droppen ovanpå inloppsstammen efter addition, tills droppen menisken var nålas av inloppet som resulterade i ett flöde mot utloppet. Exponering för en gradient av angiogenic faktorer resulterade i directional angiogenic spirande av de mikro fartyg inom mönstrade kollagen en gel.Klart spets cell bildning och invasion i kollagen en gel var synlig 24 timmar efter tillsats av angiogenic gradient medan lager celler inklusive lumen bildandet var synliga efter 48 timmar. Efter fixering och färgning identifierades formen och längden på dessa groddar. Men utan tillägg av tillväxtfaktorer, observerades ingen invasion i kollagen en gel.Med confocal imaging fastställdes gro diameter och lumen bildandet bekräftades. Denna metod skulle kunna användas för att skärmen för nya angiogenic hämmare. Detta kan bidra till att hitta nya behandlingar mot diabetesrenostropati, reumatoid artrit och cancer.Vi undersöker för närvarande hur vi kan skapa samkulturer inklusive en modell av blod - hjärnbarriären och vascularized organoider.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparameter Optisk Kartläggning av Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Förbättrad 3D Hydrogel kulturer av primära gliaceller för In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En öppen källkodsteknikplattform för tillverkning av hydrogelbaserade 3D-kulturmodeller på ett automatiserat och standardiserat sätt

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Tillverkning av 3D Cardiac Microtissue Arrays med mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter, hjärtfibblaster och endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...