Name: electrophysiological investigations of retinogeniculate and corticogeniculate synapse function
Uploaded: 2019-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) בתוך מרכז מחקר שיתופי (SFB) 1134 "הרכבים פונקציונליים" (J.v.E. ו X.C.) ואת המענק מחקר EN948/1-2 (J.v.E.).

כל הניסויים אושרו על ידי פאנל הפיקוח הממשלי על ניסויים בבעלי חיים של ריינלנד-פפאלץ.
1. פתרונות
<ol><li>תמיסת חיתוך<ol>
<li>כדי להפחית את ההתרגשות, הכינו פתרון מבוסס כולין לשימוש במהלך הניתוח כפי שהוצג כאן (ב-mM): 87 נארל, 2.5 KCl, 37.5 כולין כלוריד, 25 נחקו3, 1.25 נה2פו4, 0.5 Cacl2...

<ol>
	<li>Guido, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+form,+and+function+of+the+mouse+visual+thalamus.">Development, form, and function of the mouse visual thalamus.</a> Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).</li><li>Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paying+attention+to+the+thalamic+reticular+nucleus.">Paying attention to the thalamic reticular nucleus.</a> Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).</li><li>Turner, J. P., Salt, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sensory+and+corticothalamic+excitatory+inputs+to+rat+thalamocortical+neurones+in+vitro.">Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro.</a> The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).</li><li>Lindstrom, S., Wrobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+dependent+corticofugal+excitation+of+principal+cells+in+the+cat's+dorsal+lateral+geniculate+nucleus.">Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus.</a> Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).</li><li>Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+pulse+facilitation+of+corticogeniculate+EPSCs+in+the+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+of+the+rat+investigated+in+vitro.">Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro.</a> The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).</li><li>Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+of+a+local+circuit+neurone+in+lateral+geniculate+nucleus+of+the+cat.">Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat.</a> Nature. 317, 618-621 (1985).</li><li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+patterns+govern+synapse-specific+AMPA+receptor+trafficking+between+deliverable+and+synaptic+pools.">Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools.</a> Neuron. 62, 84-101 (2009).</li><li>Chen, C., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+remodeling+of+the+retinogeniculate+synapse.">Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 28, 955-966 (2000).</li><li>Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+signal+filtering+at+a+multisynapse+contact.">Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).</li><li>Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fuzzy+Logic+of+Network+Connectivity+in+Mouse+Visual+Thalamus.">The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus.</a> Cell. 165, 192-206 (2016).</li><li>Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-spike+interactions+and+synaptic+efficacy+of+retinal+inputs+to+the+thalamus.">Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus.</a> Nature. 395, 384-387 (1998).</li><li>Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thalamus. , (1997).</li><li>Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+alignment+of+feedback+effects+from+visual+cortex+to+thalamus.">Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus.</a> Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).</li><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).</li><li>Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+receptor+desensitization+and+saturation+to+plasticity+at+the+retinogeniculate+synapse.">Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 33, 779-788 (2002).</li><li>Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAMP44+modulates+integration+of+visual+inputs+in+the+lateral+geniculate+nucleus.">CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus.</a> Nature Communications. 9, 261 (2018).</li><li>Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologically+distinct+classes+of+relay+cells+exhibit+regional+preferences+in+the+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+of+the+mouse.">Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).</li><li>von Engelhardt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAMP44:+a+brain-specific+protein+attenuating+short-term+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus.">CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus.</a> Science. 327, 1518-1522 (2010).</li><li>Khodosevich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpressed+auxiliary+subunits+exhibit+distinct+modulatory+profiles+on+AMPA+receptor+function.">Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function.</a> Neuron. 83, 601-615 (2014).</li><li>Farrow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+subunits+of+the+CKAMP+family+differentially+modulate+AMPA+receptor+properties.">Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties.</a> eLife. 4, e09693 (2015).</li><li>Rafols, J. A., Valverde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+in+the+mouse.+A+Golgi+and+electron+microscopic+study.">The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study.</a> The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).</li><li>Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+synaptic+currents+increase+relay+neuron+firing+at+the+developing+retinogeniculate+synapse.">Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).</li><li>Hooks, B. M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+spontaneous+and+visual+activity+in+remodeling+of+the+retinogeniculate+synapse.">Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 52, 281-291 (2006).</li><li>Liu, X., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+for+AMPA+and+NMDA+receptors+in+transmission+at+the+immature+retinogeniculate+synapse.">Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse.</a> Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).</li><li>Govindaiah, G., Cox, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+differentially+regulate+GABAergic+inhibition+in+thalamus.">Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).</li><li>Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+the+Brakes:+Cellular+and+Synaptic+Mechanisms+that+Regulate+Thalamic+Oscillations.">Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations.</a> Neuron. 92, 687-704 (2016).</li><li>Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(B)+and+NMDA+receptors+contribute+to+spindle-like+oscillations+in+rat+thalamus+in+vitro.">GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).</li><li>Kulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+localization+of+GABA(B)+receptors+relative+to+synaptic+sites+in+the+rat+cerebellum+and+ventrobasal+thalamus.">Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus.</a> The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).</li><li>Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+low-threshold+spike+activation+in+relay+neurons+of+the+cat+lateral+geniculate+nucleus.">Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).</li><li>Armstrong, C. M., Gilly, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+resistance+and+space+clamp+problems+associated+with+whole-cell+patch+clamping.">Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping.</a> Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).</li><li>White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+in+persistent+inward+currents+generated+by+space-clamp+errors:+a+modeling+study.">Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study.</a> Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).</li><li>Clay, J. R., Shlesinger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effects+of+cesium+ions+on+potassium+channel+currents+in+biological+membranes.">Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes.</a> Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).</li></ol>

אנו מתארים פרוטוקול משופר המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר3, אשר מאפשר את החקירה של ההסתברות הגבוהה של הסינפסות retinogeniculate הסתברות נמוכה של שחרור corticogeniculate הסינפסות מאותה פרוסה. זה חשוב מאוד מאז שני כניסות אלה אינטראקציה אחד עם השני כדי לווסת את שידור האות החזותי: כניסות retinogeniculate הם ...

ממסר נוירונים של גרעין הג לרוחב לשלב ולהעביר מידע חזותי לקליפת הראייה. נוירונים אלה מקבלים קלט מרגש של התאים גנגליון באמצעות הסינפסות retinogeniculate, אשר מספקים את הכונן העיקרי ה, הכולל את הדחף המרכזי לנוירונים. בנוסף, ממסר הנוירונים מקבלים כניסות מהנוירוטית מנוירונים באמצעות corticogeniculate הסינפסות. יתר על כן, ממסר הנוירונים לקבל תשומות מעכבות של האינטרנוירונים מקומיים ו GABAergic נוירונים של הגרעין של רטיקולאריס thalami1. הגרעין ברטיקולריס thalami נמצא כמו מגן בין תלמוס לקליפת המוח, כך שסיבים מקרינים מקליפת התלמוס ובכיוון ההפוך, חייבים לעבור דרך הגרעין רטיקולאריס thalami2.
כניסות retinogeniculate ו corticogeniculate תשומות להציג תכונות סינפטית נפרדות3,4,5,6,7,8. כניסות retinogeniculate טופס מסופים גדולים עם מספר אתרי שחרור9,10. לעומת זאת, כניסות corticogeniculate מציגות מסופים קטנים עם אתרי שחרור בודדים7. בנוסף, הסינפסות retinogeniculate ביעילות כונן פוטנציאל הפעולה של הנוירונים ממסר למרות מהווה רק 5-10% של כל הסינפסות על ממסר נוירונים3,8,11. Corticogeniculate הסינפסות, לעומת זאת, משמש מאפטור של שידורי retinogeniculate על ידי שליטה על פוטנציאל הממברנה של ממסר נוירונים12,13.
אלה שני תשומות ההתרגשות העיקריים להעברת הנוירונים הם גם שונה מבחינה פונקציונלית. אחד ההבדל הבולט הוא דיכאון לטווח קצר של הסינפסות retinogeniculate ואת ההנחיה לטווח קצר של הסינפסות corticogeniculate3,5,8. הפלסטיות הקצרת-טווח מתייחס לתופעה שבה משתנה חוזק הסינפטית כאשר הסינפסה פעילה שוב ושוב תוך פרק זמן של מספר אלפיות-שניה ועד מספר שניות. ההסתברות לשחרור סינפטית היא גורם חשוב המשמש לפלסטיות לטווח קצר. סינפסות, עם הסתברות שחרור נמוך הראשונית, להציג הקלה לטווח קצר עקב הצטברות של Ca2 + ב preסינפסה ולכן עלייה בהסתברות השחרור נצפתה על פעילות חוזרת. לעומת זאת, הסינפסות עם הסתברות שחרור גבוה להציג בדרך כלל דיכאון לטווח קצר עקב דלדול של שלפוחיות מוכנות ושלפוחית14. בנוסף, הפחתת רגישות של קולטנים פוסט-סינפטית תורמת הפלסטיות לטווח הקצר בכמה סינפסות הסתברות גבוהה מהדורה8,15. הסתברות גבוהה לשחרור והפחתת הרגישות של α-אמינו-3-הידרוxy-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (אמפא) קולטנים תורמים לדיכאון הבולט לטווח קצר של הסינפסות retinogeniculate. לעומת זאת, ההסתברות לשחרור נמוך מהווה את ההנחיה לטווח הקצר של הסינפסות הcorticogeniculate.
בעכברים, המערכת האופטית נכנסת לגרעין של הג הצדדי (dLGN) מהאתר של קודולצלעות, בעוד שסיבים corticogeniculate נכנסים לתוך ה-dLGN rostroventrally. המרחק בין שני הקלטים מאפשר לחקור את המאפיינים הפרטניים של שני כניסות מרגש שונות מאוד אל אותו תא. כאן, אנו בונים על ולשפר את שיטת הניתוח שתוארה בעבר, שבו סיבים retinogeniculate והוא נשמר בפרוסות מוח חריפה3. אנו, לאחר מכן, לתאר את החקירה אלקטרופיסיולוגית של העברת נוירונים וגירוי של retinogeniculate וסיבים corticogeniculate עם אלקטרודות לתוך הגירוי. לבסוף, אנו מספקים פרוטוקול למילוי של נוירונים ממסר עם ביוציטוטין וניתוח אנטומי הבאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="614">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Amplifier&#160;</td>
			<td style="width:98px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:123px;">EPC 10 USB Double patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">B4261-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.02382.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C1879-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:98px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CsCl</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.02038.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cs-gluconate</td>
			<td style="width:98px;">Self-prepared</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-600&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5644-50MG</td>
			<td>methoxyverapamil hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-APV&#160;</td>
			<td style="width:98px;">Biotrend&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BN0085-100</td>
			<td style="width:172px;">NMDA-receptor antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Digital camera for microscope</td>
			<td style="width:98px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:98px;">SERVA</td>
			<td style="width:123px;">11290.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Forene</td>
			<td style="width:98px;">Abbvie</td>
			<td style="width:123px;">2594.00.00</td>
			<td style="width:172px;">isoflurane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:98px;">ROTH</td>
			<td style="width:123px;">9105.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">High Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:98px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">A385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Micromanipulators</td>
			<td style="width:98px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:123px;">SM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Miroscope</td>
			<td style="width:98px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:98px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolong Gold Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:98px;">ROTH</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.06329.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td style="width:98px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:123px;">1807502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Puller</td>
			<td style="width:98px;">Sutter&#160;</td>
			<td style="width:123px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">razor blade&#160;</td>
			<td style="width:98px;">Personna&#160;</td>
			<td>60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Semiautomatic Vibratome</td>
			<td style="width:98px;">Leica&#160; Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">SR 95531 hydrobromide&#160;</td>
			<td style="width:98px;">Biotrend&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AOB5680-10</td>
			<td style="width:172px;">GABAA-receptor antagonist&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological investigations of retinogeniculate and corticogeniculate synapse function

גרעין הג הצדדי הוא תחנת הממסר הראשונה למידע החזותי. ממסר נוירונים של הגרעין התלמי הזה לשלב קלט מתאי גנגליון רשתית ולהקרין אותו קליפת הראייה. בנוסף, ממסר הנוירונים לקבל עירור מלמעלה למטה מן הקליפה. שני תשומות ההתרגשות העיקריים לנוירונים בממסר שונים במספר היבטים. כל תא עצב ממסר מקבל קלט מתוך מספר סינפסות retinogeniculate בלבד, שהם מסופים גדולים עם אתרי שחרור רבים. זה משתקף על ידי עירור חזק זהובה, הנוירונים ממסר לקבל, מתאי גנגליון הרשתית. הסינפסות Corticogeniculate, לעומת זאת, הן פשוטות יותר עם כמה אתרי שחרור וחוזק סינפטית חלש יותר. שתי הסינפסות שונות גם בפלסטיות הסינפטית לטווח קצר. לסינפסות retinogeniculate יש הסתברות גבוהה לשחרר וכתוצאה מכך להציג דיכאון לטווח קצר. לעומת זאת, corticogeniculate הסינפסות יש הסתברות שחרור נמוך. סיבים Corticogeniculate לחצות את גרעיני התלתלמי לפני הכניסה לגרעין הגנוקה לרוחב. המיקומים השונים של הגרעין הטרתלמי הציקולאני (הרוסטרולי מתוך גרעין הג הצדדי) ומערכת האופטית (ונקטרו-מהצד מגרעין הג הצדדי) מאפשרים מגרה corticogeniculate או retinogeniculate בנפרד עם אלקטרודות של גירוי מסחטות. זה הופך את הגרעין לרוחב מצוי באזור המוח האידיאלי שבו שני סינפסות מרגש עם תכונות שונות מאוד גישו על אותו סוג תא, ניתן ללמוד בו זמנית. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את ההקלטה מהעברת נוירונים ולבצע ניתוח מפורט של הפונקציה retinogeniculate ואת corticogeniculate סינפציה בפרוסות מוח חריפה. המאמר מכיל פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הדור של פרוסות מוח חריפה של הגרעין הגניקה לרוחב ושלבים עבור ההקלטה פעילות מהעברת הנוירונים על ידי גירוי מערכת האופטית וסיבים corticogeniculate בנפרד.

הכנת הפרוסה של dLGN המכיל את המסלולים retinogeniculate מוצג תחת מטרה 4x (איור 2). Axons של תאים גנגליון ברשתית צרור יחד במערכת האופטית (איור 2). הפיפטה המעוררת הונחה על מערכת האופטית כדי לגרום retinogeniculate סינפקה-תיווך הנוכחי (איור 2A) ועל הגרעי...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function at JoVE.com

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפות המכילות את גרעין הגניקולציה האופטיבי ואת החקירה האלקטרופיזיולוגית של תפקוד הגניקולציה של הרשתית וסינפסת הגניקולציה של קליפת המוח. אקסונים של תאי גנגליון רשתית נכנסים לגרעין הגניקולציה בצדדים הרחק מהתשומות קליפת המוח. זה מאפשר גירויים נפרדים של geniculate רשתית סינפסות geniculate קליפת המוח, אשר יש תכונות פונקציונליות שונות מאוד.כדי להתחיל בהליך זה, להכין שני תאי פרוסה, אחד מלא 100 מיליליטר של פתרון הניתוח והשני עם 100 מיליליטר של פתרון הקלטה. מניחים את שתי הקוביות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, ובועה את הפתרונות עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני הניתוח. לאחר מכן מלא פלסטיק עם 250 מיליליטר של פתרון ניתוח כמעט קר כקרח, ובועה אותו עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני השימוש.לאחר מכן מלאו צלחת פטרי מפלסטיק בתסמת הניתוח הקרה לניתוח המוח. מניחים פיסת נייר סינון במכסה של צלחת פטרי, וממלאים אותה בכמות קטנה של פתרון ניתוח. לאחר מכן לקרר את תא הניתוח של הרטט.חותכים את העור של הראש מן caudal לאף, ולשמור אותו פתוח באצבעות כדי לחשוף את הגולגולת. כדי להשיג את קו החזית, ראשית לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע האחורי / החזיתי. ואז לחתוך פעמיים נוספות דרך התפר קורונטל תפר lambdoid.הסר את הגולגולת בין התפר הכתר לתפר lambdoid לחשוף את המוח הגדול. חותכים את נורת הריח, ומפרידים את הקם מהבריין עם להב דק. מוציאים את המוח מהגולגולת עם מרית דקה, וממקם אותו על נייר סינון במכסה של צלחת פטרי.כדי לשמר את שלמות התשומות החושיות והקליפתיות לגרעין הגניקולציה הרוחבי הגבי בפרוסת המוח, הפרד בין שתי ההמיספרות באמצעות חתך parasagittal בזווית של שלוש עד חמש מעלות. לאחר מכן לייבש את המישורים הצדדיים המדיאליים של שתי ההמיספרות על ידי הנחתם על נייר מסנן. ואז להדביק אותם על שלב החיתוך עם זווית של 10 עד 25 מעלות מן המישור האופקי.מניחים את הבמה במרכז מגש חיץ המתכת, ויוצקים בעדינות את שאר תותח הניתוח הקר כקרח לתוך מגש החיץ. בצע שלב זה בזהירות, שכן שפיכת קשה מדי עלולה להסיר את המוח המודבק. לאחר מכן שמרו את מגש החיץ במגש מלא הקרח כדי לשמור על הטמפרטורה הנמוכה במהלך הניתוח.חלק 250 מיקרומטר פרוסות עם סכין גילוח במהירות של 0.1 מילימטר לשנייה משרעת של מילימטר אחד. מעבירים את הפרוסות לתא ההחזקה המלא בתפיסת ניתוח מחומצן ב-34 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות, ואז מאפשרים לפרוסות להתאושש בתפיסת ההקלטה ב-34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. לאחר ההחלמה, מוציאים את תא החזקת הפרוסות מאמבט המים, ולשמור את הפרוסות בטמפרטורת החדר עד לשימוש בניסויים.בהליך זה, למשוך את פיפטות ההקלטה באמצעות נימי זכוכית borosilicate ו puller נימים. לאחר מכן למשוך את פיפטים מגרה באמצעות אותו פרוטוקול, אבל לשבור את הקצה מעט לאחר משיכת כדי להגדיל את הקוטר. לאחר מכן למלא את פיפטי הקלטה עם פתרון תאי וביוצטין, ולמלא את פיפטות מגרה עם פתרון הקלטה.לאחר מכן מניחים את הפרוסות בתא ההקלטה, ומבלבלים אותן ללא הרף בתפיסת הקלטה מחומצן בטמפרטורת החדר. דמיינו את הפרוסות במיקרוסקופ זקוף המצויד במיקרוסקופ וידאו IR-DIC. בדוק את כל הפרוסות ובחר את הפרוסות המציגות דרכי אופטיות שלמות.מניחים את פיפטה גירוי על הפרוסה לפני תיקון התא עם פיפטה הקלטה. כדי לחקור את הסינפסות geniculate הרשתית, מניחים את פיפטה מגרה ישירות על המתיחה האופטית שבו סיבי אקסון מתאים גנגליון רשתית ארוזים. כדי לנתח את הסינפסות geniculate קליפת המוח, מניחים את האלקטרודה מגרה על הגרעין reticularis תלאמי, אשר rostroventrally סמוך לגרעין geniculate הגבי.לאחר פיפיט ההקלטה הוא שקוע בתתב"א ההקלטה, להחיל צעד חמישה מילי וולט כדי לפקח על ההתנגדות פיפטה. הגדר את פוטנציאל האחזקה לאפס מילי-וולט ובטל את פוטנציאל ההיסט כך שזרם האחזקה יהיה אפס פיקומפר. לגשת לתא עם פיפטה הקלטה תוך הפעלת לחץ חיובי.כאשר פיפטה הוא במגע ישיר עם קרום התא, לשחרר את הלחץ החיובי, ולהגדיר את פוטנציאל החזקה מינוס 70 מיליבולטים. לאחר מכן להחיל לחץ שלילי קל כדי לאפשר את קרום התא לצרף פיפטה זכוכית כך חותם gigaohm צורות. לפצות על קיבוליות פיפטה, ולפתוח את התא על ידי הפעלת פולסים לחץ שלילי.כדי לחקור את הפונקציה הסינפטית, להחיל פולסים זרם 0.1 אלפית שנייה באמצעות פיפטה גירוי. נטר את התנגדות הסדרה באופן רציף על-ידי החלת צעד של חמישה מילי-וולט. ההתנגדות הסדרתית יכולה להיות מוערכת על ידי חלוקת חמישה מיליבולטים על ידי משרעת השיא של הזרם המעורר.השתמש רק בתאים עם עמידות לסדרה הקטנה מ- 20 מגה-השם לצורך ניתוח. לתיוג ביוצטין, שמרו על תצורת התא כולו למשך חמש דקות לפחות כדי לאפשר פיזור של ביוצטין לדנדריטים הדיסטליים. לאחר ההקלטה, להסיר בעדינות את פיפטה מהתא, כך soma לא נהרס.הכינו צלחת תרבות תאים של 24 בארות. מלאו כל באר ב-300 מיקרוליטרים של 4%PFA. יש לדאוג לא לזהם שום דבר עם PFA כי יהיה במגע עם פרוסות להיות מוקלט.מעבירים את הפרוסות מתא ההקלטה לצלחת המכילה PFA עם פיפטה גומי, ולתקן אותם בן לילה. למחרת, החלף את PFA עם PBS. שמור את הפרוסות ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי.כדי להכתים את התאים, לשטוף את הפרוסות עם PBS טרי שלוש פעמים. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי דגירה של הפרוסות בתפיסת החסימה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. ואז להשליך את פתרון החסימה, ולהדגר את הפרוסות עם סטרפטבידין Alexa 568 מדולל בתפיסת החסימה בארבע מעלות צלזיוס לילה על שייקר מסלולית.למחרת, להשליך את פתרון הנוגדן, ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית. לאחר מכן לשטוף את הפרוסות עם מי ברז לפני ההרכבה. מניחים את הפרוסות מעכבר אחד על מגלשת זכוכית אחת.ודאו שהתאים המוכתמים נמצאים על המשטח העליון של הפרוסות. סופגים את המים סביב הפרוסות עם רקמות, ולאחר מכן משאירים את הפרוסות להתייבש במשך כ 15 דקות. לאחר מכן להחיל שתי טיפות של מדיום הרכבה על כל פרוסה, ולהטמון להחליק כיסוי על השקופית מבלי לייצר בועות אוויר.אחסן את הפרוסות המסותוויות בארבע מעלות צלזיוס לאחר הצגתן במיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה זו IR-DIC מראה את הסכומה של נוירון ממסר גרעין geniculate הגבי עם קצה של פיפטה תיקון. כתמי ביוצטין מאפשרים לנו לקבל תצוגה של הנוירון המוקלט.שונה מן interneurons, אשר יש מורפולוגיה דו קוטבית, נוירונים ממסר יש ארברים דנדריטי רב קוטבי המכיל יותר משלושה דנדריטים ראשוניים. שחזור תלת מימדי של נוירון ממסר שכותרתו ביוצטין נוצר אז, אשר מראה ארכיטקטורה דנדריטית סימטרית רדיוטית. לשמר את תשומות geniculate הרשתית ואת תשומות geniculate קליפת המוח באותן פרוסות המוח חשובים ביותר בפרוטוקול זה.בעקבות הליך זה, אנו יכולים, למשל, גם לחקור את תשומות המעכבים מן הגרעין reticularis תלאמי על נוירונים גניקולציה גניקולציה משנית הגבית. זכור ללבוש כפפות בעת תיקון פרוסות המוח עם PFA, כמו PFA הוא מסוכן.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

הקלטות אלקטרו מתוך מסלול של סיבים ענק ד melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

מדידות אלקטרו וניתוח Nociception אצל תינוקות אדם

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

חקירות על שינויים בתפקוד המעגל היפוקמפוס בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...